三萜相关蛋白质与其编码基因以及在提高植物三萜化合物含量中的应用
阅读说明：本技术 三萜相关蛋白质与其编码基因以及在提高植物三萜化合物含量中的应用 (Triterpene related protein, coding gene thereof and application of triterpene related protein in improving content of plant triterpene compound ) 是由 尹静 詹亚光 杨杰 肖佳雷 李影 张玉琦 常存 于 2019-09-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了三萜相关蛋白质与其编码基因以及在提高植物三萜化合物含量中的应用。本发明公开的三萜相关蛋白质为TRP1、TRP2或TRP3,TRP1为氨基酸序列是序列1的蛋白质；TRP2为氨基酸序列是序列3的蛋白质；TRP3为氨基酸序列是序列5的蛋白质。本发明的三萜相关蛋白及其编码基因以及TRP2和TRP3的组合、BpW和TRP1的组合均可以用来培育三萜化合物合成提高的植物,并进一步为植物中三萜化合物的高效合成调控和生物技术的利用提供了有效的基因资源,具有广泛的应用前景。(The invention discloses a triterpene related protein, a coding gene thereof and application of the triterpene related protein in improving the content of plant triterpene compounds. The triterpene related protein disclosed by the invention is TRP1, TRP2 or TRP3, and the TRP1 is a protein of which the amino acid sequence is a sequence 1; TRP2 is a protein of which the amino acid sequence is sequence 3; TRP3 is a protein whose amino acid sequence is sequence 5. The triterpene related protein and the coding gene thereof, the combination of TRP2 and TRP3 and the combination of BpW and TRP1 can be used for cultivating plants with improved triterpene compound synthesis, and further provide effective gene resources for efficient synthesis regulation and control of triterpene compounds in the plants and utilization of biotechnology, and have wide application prospects.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，三萜相关蛋白质与其编码基因以及在提高植物三萜化合物含量中的应用。
背景技术
白桦(Betula platyphylla suk.)树中含有重要的次生代谢产物-白桦三萜(TBP)，其中白桦脂醇、白桦脂酸和齐墩果酸成分是极具开发潜力的抗癌、抗艾滋病毒(HIV)及治疗心血管疾病和护肝的先锋药物。
随着天然药物开发日渐兴起，天然植物资源趋于匮乏，如何有效、合理地利用天然植物资源也日渐迫切；同时由于植物的次生代谢产物在自然状态下含量低，如何提高植物次生代谢产物的产量是关系到天然药物的开发能否应用于实际生产的关键环节。然而，次生代谢途径通常极为复杂，而且不同途径之间通常有着繁复的交互作用。为了按照人们的意愿改变植物中某种次生代谢产物的含量，或者让植物合成新的次生代谢产物，除了需要首先阐明它们的代谢途径外，还必须了解代谢途径中的酶所受到的表达调控、前体物的丰度、产物合成部位、合成后积累与运输机制等。为了使这些天然物质更好的为人类所利用，对其代谢途径进行遗传修饰必将成为一个重要的研究方向，其中用基因工程的方法提高目标途径的基因表达量或抑制其他途径的基因表达，促进植物或细胞表达次生代谢产物是一种新的手段。目前已有数种次生代谢产物在转基因植物和培养细胞中得到了表达。
高等植物中，有超过100种不同的三萜骨架被报道。这些三萜骨架是由共同的前体2,3-氧化角鲨烯(2,3-oxidosqualene)经过角鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclases,OSCs)合成的。萜类生成及修饰阶段决定萜类化合物结构多样性，是研究萜类等植物次生代谢的重点及难点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物三萜化合物含量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于白桦(Betula platyphyllasuk.)的与三萜化合物合成相关的蛋白质(简称三萜相关蛋白)，所述三萜相关蛋白的名称为TRP1、TRP2或TRP3；
所述TRP1为如下A1)-A3)中的任一种：
A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述TRP2为如下A4)-A6)中的任一种：
A4)氨基酸序列是序列3的蛋白质；
A5)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A6)在A4)或A5)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述TRP3为如下A7)-A9)中的任一种：
A7)氨基酸序列是序列5的蛋白质；
A8)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A9)在A7)或A8)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
为了使A1)、A4)或A7)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1或序列3或序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签
残基
序列
Poly-Arg
5-6(通常为5个)
RRRRR
Poly-His
2-10(通常为6个)
HHHHHH
FLAG
8
DYKDDDDK
Strep-tag II
8
WSHPQFEK
c-myc
10
EQKLISEEDL
上述A2)中的蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。A5)中的蛋白质，为与序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。A8)中的蛋白质，为与序列5所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)、A5)或A8)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。A5)中的蛋白质的编码基因可通过将序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。A8)中的蛋白质的编码基因可通过将序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的蛋白质，序列4所示的DNA分子编码序列3所示的蛋白质，序列6所示的DNA分子编码序列5所示的蛋白质。
本发明还提供了与所述三萜相关蛋白相关的生物材料，所述生物材料为生物材料1、生物材料2或生物材料3；
所述生物材料1为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码所述TRP1的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
所述生物材料2为下述C1)至C7)中的任一种：
C1)编码所述TRP2的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体、或含有C2)所述表达盒的重组载体；
C4)含有C1)所述核酸分子的重组微生物、或含有C2)所述表达盒的重组微生物、或含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C5)含有C1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有C2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
C6)含有C1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有C2)所述表达盒的转基因植物组织；
C7)含有C1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有C2)所述表达盒的转基因植物器官；
所述生物材料3为下述D1)至D7)中的任一种：
D1)编码所述TRP3的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有D2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D6)含有D1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D7)含有D1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述编码所述TRP1的核酸分子可为如下b11)-b14)中的任一种：
b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；
b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TRP1的cDNA分子或DNA分子；
b14)在严格条件下与b11)-b13)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TRP1的cDNA分子或DNA分子；
C1)所述编码所述TRP2的核酸分子可为如下c11)-c14)中的任一种：
c11)编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
c12)序列表中序列4所示的cDNA分子或DNA分子；
c13)与c11)或c12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TRP2的cDNA分子或DNA分子；
c14)在严格条件下与c11)-c13)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TRP2的cDNA分子或DNA分子；
D1)所述编码所述TRP3的核酸分子可为如下d11)-d14)中的任一种：
d11)编码序列是序列表中序列6的cDNA分子或DNA分子；
d12)序列表中序列6所示的cDNA分子或DNA分子；
d13)与d11)或d12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述TRP3的cDNA分子或DNA分子；
d14)在严格条件下与d11)-d13)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码所述TRP3的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。所述三萜相关蛋白的名称为TRP1、TRP2或TRP3；
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码TRP1、TRP2或TRP3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的TRP1、TRP2或TRP3的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码TRP1、TRP2或TRP3蛋白质且具有TRP1、TRP2或TRP3蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列3或序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码TRP1蛋白质的核酸分子的表达盒(TRP1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TRP1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动TRP1基因转录的启动子，还可包括终止TRP1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。C2)所述的含有编码TRP2蛋白质的核酸分子的表达盒(TRP2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TRP2蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动TRP2基因转录的启动子，还可包括终止TRP2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。D2)所述的含有编码TRP3蛋白质的核酸分子的表达盒(TRP3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达TRP3蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动TRP3基因转录的启动子，还可包括终止TRP3基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述TRP1基因表达盒或所述TRP2基因表达盒或所述TRP3基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pCAMBIA1303载体。
B3)所述重组载体具体可为pCAMBIA1303-TRP1。所述pCAMBIA1303-TRP1为利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间插入序列2的第1-1530位所示的TRP1基因得到的重组载体。所述pCAMBIA1303-TRP1能表达序列1所示的TRP1蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，所述融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
C3)所述重组载体具体可为pCAMBIA1303-TRP2。所述pCAMBIA1303-TRP2为利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间插入序列4的第1-1185位所示的TRP2基因得到的重组载体。所述pCAMBIA1303-TRP2能表达序列3所示的TRP2蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，所述融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
D3)所述重组载体具体可为pCAMBIA1303-TRP3。所述pCAMBIA1303-TRP3为利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间插入序列6的第1-1536位所示的TRP3基因得到的重组载体。所述pCAMBIA1303-TRP3能表达序列5所示的TRP3蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，所述融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌LBA4404。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
本发明还提供了一种成套产品，所述成套产品为下述Y1-Y4中的任一种：
Y1、由名称为BpW的蛋白质、所述TRP2和所述TRP3组成的成套产品；
所述BpW为如下A10)-A12)中的任一种：
A10)氨基酸序列是序列7的蛋白质；
A11)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A12)在A10)或A11)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
Y2、由名称为生物材料4的生物材料、所述生物材料2和所述生物材料3组成的成套产品；
所述生物材料4为下述E1)至E7)中的任一种：
E1)编码所述BpW的核酸分子；
E2)含有E1)所述核酸分子的表达盒；
E3)含有E1)所述核酸分子的重组载体、或含有E2)所述表达盒的重组载体；
E4)含有E1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E2)所述表达盒的重组微生物、或含有E3)所述重组载体的重组微生物；
E5)含有E1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有E2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
E6)含有E1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E2)所述表达盒的转基因植物组织；
E7)含有E1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E2)所述表达盒的转基因植物器官；
Y3、由所述TRP1和所述BpW组成的成套产品；
Y4、由所述生物材料1和所述生物材料4组成的成套产品。
上述成套产品具有如下任一功能：
F1)调控植物三萜化合物含量；
F2)制备调控植物三萜化合物含量产品；
F3)提高植物三萜化合物含量；
F4)制备提高植物三萜化合物含量产品；
F5)培育三萜化合物含量增加植物；
F6)制备培育三萜化合物含量增加植物产品。
上述成套产品中，E1)所述编码所述BpW的核酸分子可为如下e11)-e14)中的任一种：
e11)编码序列是序列表中序列8的cDNA分子或DNA分子；
e12)序列表中序列8所示的cDNA分子或DNA分子；
e13)与e11)或e12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述BpW的cDNA分子或DNA分子；
e14)在严格条件下与e11)-e13)中任一种限定的核苷酸序列杂交，且编码所述BpW的cDNA分子或DNA分子。
E3)所述重组载体具体可为pCAMBIA1303-BpW。所述pCAMBIA1303-BpW为利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间插入序列8的第1-2265位所示的BpW基因得到的重组载体。所述pCAMBIA1303-BpW能表达序列7所示的BpW蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，所述融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
本发明还提供了所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3，或调控所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3的含量或活性的物质，或所述生物材料1、所述生物材料2或所述生物材料3，或所述成套产品的下述任一应用：
D1)调控植物三萜化合物含量；
D2)制备调控植物三萜化合物含量产品；
D3)提高植物三萜化合物含量；
D4)制备提高植物三萜化合物含量产品；
D5)培育三萜化合物含量增加植物；
D6)制备培育三萜化合物含量增加植物产品。
本发明还提供下述X1)-X6)任一所述的方法：
X1)培育三萜化合物含量增加植物的方法，包括使受体植物中表达所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3，或提高受体植物中所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3的含量，或提高受体植物中所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3的活性，得到与所述受体植物相比三萜化合物含量增加的目的植物；
X2)提高植物中三萜化合物含量的方法，包括使受体植物中表达所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3，或提高受体植物中所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3的含量，或提高受体植物中所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3的活性，得到与所述受体植物相比三萜化合物含量增加的目的植物，实现植物中三萜化合物含量的提高；
X3)培育三萜化合物含量增加植物的方法，包括使受体植物中表达所述BpW、所述TRP2和所述TRP3，或提高受体植物中所述BpW、所述TRP2和所述TRP3的含量，或提高受体植物中所述BpW、所述TRP2和所述TRP3的活性，得到与所述受体植物相比三萜化合物含量增加的目的植物；
X4)提高植物中三萜化合物含量的方法，包括使受体植物中表达所述BpW、所述TRP2和所述TRP3，或提高受体植物中所述BpW、所述TRP2和所述TRP3的含量，或提高受体植物中所述BpW、所述TRP2和所述TRP3的活性，得到与所述受体植物相比三萜化合物含量增加的目的植物，实现植物中三萜化合物含量的提高；
X5)培育三萜化合物含量增加植物的方法，包括使受体植物中所述BpW和所述TRP1，或提高受体植物中所述BpW和所述TRP1的含量，或提高受体植物中所述BpW和所述TRP1的活性，得到与所述受体植物相比三萜化合物含量增加的目的植物；
X6)提高植物中三萜化合物含量的方法，包括使受体植物中表达所述BpW和所述TRP1，或提高受体植物中所述BpW和所述TRP1的含量，或提高受体植物中所述BpW和所述TRP1的活性，得到与所述受体植物相比三萜化合物含量增加的目的植物，实现植物中三萜化合物含量的提高。
上述方法中，X1)或X2)所述方法可通过向所述受体植物中导入所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3的编码基因并使所述编码基因得到表达实现；
X3)或X4)所述方法可通过向所述受体植物中导入所述BpW、所述TRP2和所述TRP3的编码基因并使所述BpW、所述TRP2和所述TRP3的编码基因均得到表达实现；
X5)或X6)所述方法可通过向所述受体植物中导入所述BpW的编码基因和所述TRP1的编码基因并使所述BpW和所述TRP1的编码基因均得到表达实现。
上述方法中，所述TRP1的编码基因可为B1)所述核酸分子。所述TRP2的编码基因可为C1)所述核酸分子。所述TRP3的编码基因可为D1)所述核酸分子。所述BpW的编码基因可为E1)所述核酸分子。
上述方法中，其中所述TRP1的编码基因、所述TRP2的编码基因、所述TRP3的编码基因和所述BpW的编码基因均可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TRP1、所述TRP2、所述TRP3或所述BpW的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述TRP1的编码基因可利用含有所述TRP1的编码基因的重组表达载体导入受体植物中。所述重组表达载体具体可为所述pCAMBIA1303-TRP1。
所述TRP2的编码基因可利用含有所述TRP2的编码基因的重组表达载体导入受体植物中。所述重组表达载体具体可为所述pCAMBIA1303-TRP2。
所述TRP3的编码基因可利用含有所述TRP3的编码基因的重组表达载体导入受体植物中。所述重组表达载体具体可为所述pCAMBIA1303-TRP3。
所述BpW的编码基因可利用含有所述BpW的编码基因的重组表达载体导入受体植物中。所述重组表达载体具体可为所述pCAMBIA1303-BpW。
所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。
所述目的植物理解为不仅包含目的蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明中，所述三萜化合物可为白桦脂醇和/或白桦脂酸。
所述植物可为M1)或M2)或M3)：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)茄科植物或桦木科植物；
M3)烟草或白桦。
扩增编码所述TRP1、所述TRP2或所述TRP3核酸分子的引物对，也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明的三萜相关蛋白(TRP1、TRP2和TRP3)及其编码基因可以提高植物中三萜化合物的含量，BpW、TRP2和TRP3的组合以及BpW和TRP1的组合均可以进一步促进三萜化合物的合成：TRP2和TRP3单独瞬时表达的植物中，白桦脂醇和白桦脂酸的含量均显著高于野生型植物，TRP2和TRP3单独瞬时表达的植物中白桦脂醇含量分别为野生型植物的1.50倍和1.46倍，白桦脂酸含量分别为野生型植物的12.40倍和11.85倍；当BpW、TRP2和TRP3基因同时在植物中表达时，白桦脂醇和白桦脂酸的含量均显著高于野生型植物，二者分别为野生型植物的1.85倍和13.62倍；BpW与TRP1共同侵染植物时，白桦脂酸含量均显著高于BpW和TRP1分别单独侵染的植物，且是野生型植物的10.27倍，分别是BpW和TRP1分别单独侵染的植物的11.65倍和10.97倍；BpW与TRP1共同侵染植物时，白桦脂醇含量为野生型植物的1.16倍，分别是BpW和TRP1分别单独侵染的植物的1.34倍和1.40倍；在转TRP1基因植物中，BpSS、BpSE及BpW基因的相对表达量显著提高，其中BpW基因上调效果最为明显，BpDS和BpY基因的相对表达量被显著下调。表明，本发明的三个三萜相关蛋白(TRP1、TRP2和TRP3)及其编码基因以及TRP2和TRP3的组合、BpW和TRP1的组合均可以用来培育三萜化合物合成提高的植物，并进一步为植物中三萜化合物的高效合成调控和生物技术的利用提供了有效的基因资源，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为高效液相色谱检测瞬时表达的烟草中白桦脂醇和白桦脂酸的含量。(a)是TRP1、TRP2、TRP3瞬时表达烟草中白桦脂醇含量；(b)是TRP1、TRP2、TRP3过表达烟草中白桦脂酸含量。WT表示野生型本氏烟，BpW表示BpW表达烟草，TRP1表示TRP1表达烟草，TRP2表示TRP2表达烟草，TRP3表示TRP3表达烟草，BpW+TRP1表示TRP1与BpW共同表达烟草，BpW+TRP2+TRP3表示BpW、TRP2与TRP3共同表达烟草。
图2为WT(野生型)、TRP2、TRP3瞬时表达烟草的高效液相色谱结果。左侧为白桦脂醇的检测结果，最下方图为标准品；右侧为白桦脂酸的检测结果，最下方图为标准品。
图3是转基因白桦PCR鉴定图及目的基因表达检测结果。a为转基因白桦的PCR鉴定电泳图；b为TRP1基因的表达量检测结果；c为三萜合成途径相关基因在野生型本氏烟和TRP1-5株系中的表达检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
IS培养基：1L培养基中含370mg/L MgSO4·7H2O；170mg/L KNO3；710mg/L Ca(NO3)2·4H2O；140mg/L KC1；680mg/L NH4NO3；80mg/LKH2PO4；27.8mg/L FeSO4·7H2O；37.3mg/L Na2-EDTA；8mg/L MnSO4·4H2O；0.8mg/L KI；9mg/L ZnSO4·7H2O；0.25mg/LCuSO4·5H2O；3.2mg/L H3BO3；100mg/L肌醇；0.8mg/L烟酸(VB3)；0.1mg/L盐酸硫胺素(VB1)；0.1mg/L盐酸吡哆醇(VB6)；10mg/L尿素；1mg/L延胡索酸；10mg/L酪氨酸；1mg/L抗坏血酸，余量为水。
实施例1、三萜相关蛋白质TRP1、TRP2、TRP3可以提高植物中三萜化合物含量
本实施例提供了来源于白桦(Betula platyphylla Suk.)的与三萜化合物合成相关的蛋白质(记为三萜相关蛋白)，其名称分别为TRP1、TRP2、TRP3，TRP1、TRP2、TRP3的氨基酸序列分别为序列表中序列1、3、5，在白桦中，编码这三个蛋白质的DNA分子分别为序列表中序列2、4和6所示DNA，将这三种DNA分子分别记为TRP1基因、TRP2基因和TRP3基因。
一、重组表达载体的构建
提取白桦组培苗总RNA，反转录合成cDNA，利用TRP1-F与TRP1-R扩增序列2所示的TRP1基因，利用TRP2-F与TRP2-R扩增序列4所示的TRP2基因，利用TRP3-F与TRP3-R扩增序列6所示的TRP3基因，引物序列为：
TRP1-F：5′-GATCATGGAGGTCTGGCTCA-3′；
TRP1-R：5′-CAACATGGTGGCATGGACTGT-3′；
TRP2-F：5′-CTGGGTTCCATGTCTTATACTTG-3′；
TRP2-R：5′-ACCACCCCACAGACTGGATTATG-3′；
TRP3-F：5′-CAGCTCTACCATGGAAGCCCTA-3′；
TRP3-R：5′-CCTTTTCCCTTCAACTGCCC-3′。
利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间插入序列2的第1-1530位所示的TRP1基因，得到重组载体，将含有TRP1基因的序列正确的重组载体记为pCAMBIA1303-TRP1，pCAMBIA1303-TRP1能表达序列1所示的TRP1蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，该融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间插入序列4的第1-1185位所示的TRP2基因，得到重组载体，将含有TRP2基因的序列正确的重组载体记为pCAMBIA1303-TRP2，pCAMBIA1303-TRP2能表达序列3所示的TRP2蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，该融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间序列6的第1-1536位所示的TRP3基因，得到重组载体，将含有TRP3基因的序列正确的重组载体记为pCAMBIA1303-TRP3，pCAMBIA1303-TRP3能表达序列5所示的TRP3蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，该融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
利用NcoI在pCAMBIA1303载体的多克隆位点间序列表中序列8的第1-2265位所示的BpW基因，得到重组载体，将含有BpW基因的序列正确的重组载体记为pCAMBIA1303-BpW，pCAMBIA1303-BpW能表达序列表中序列7所示的BpW蛋白质与GUS、GFP形成的融合蛋白质，该融合蛋白质的表达由35S启动子驱动。
其中，序列表中序列8所示的DNA分子编码序列表中序列7所示的BpW蛋白质。
BpW基因来源于白桦。
二、TRP1、TRP2、TRP3可以提高本氏烟草中三萜化合物的含量
1、瞬时表达本氏烟草
将步骤一得到的pCAMBIA1303-TRP1、pCAMBIA1303-TRP2、pCAMBIA1303-TRP3和pCAMBIA1303-BpW以及出发载体pCAMBIA1303分别导入农杆菌LBA4404中，将得到的重组菌分别记为LBA4404-pCAMBIA1303-TRP1、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP2、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP3和LBA4404-pCAMBIA1303-BpW以及LBA4404-pCAMBIA1303。
(1)分别挑取pCAMBIA1303-TRP1、pCAMBIA1303-TRP2、pCAMBIA1303-TRP3、pCAMBIA1303-BpW以及以及LBA4404-pCAMBIA1303农杆菌单菌落，接种在含有利福平(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，置于28℃震荡培养2天，4000g离心10min收集菌体。
(2)将收集的菌体分别重悬于20mL渗透质(10mM MES，10mM MgCl2，100μM乙酰丁香酮，pH 5.7)中，至终浓度OD600为1.0，室温孵育2h，得到各菌株重悬液，备用。
(3)步骤(2)完成后，使用1mL无针注射器分别在3周龄的本氏烟草(本氏烟)叶片的下表皮渗入步骤(2)得到的各菌株重悬液进行农杆菌的侵染，渗透菌液后的本氏烟草植物在长日照条件下(16h光照，8h黑暗)培养于25℃的组培室中，由LBA4404-pCAMBIA1303-TRP1、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP2、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP3和LBA4404-pCAMBIA1303-BpW获得的瞬时表达烟草分别记为TRP1表达烟草、TRP2表达烟草、TRP3表达烟草、BpW表达烟草，将LBA4404-pCAMBIA1303-BpW、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP2、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP3的菌悬液等体积混合后侵染本氏烟草获得的瞬时表达烟草记为BpW、TRP2与TRP3共同表达烟草，将LBA4404-pCAMBIA1303-TRP1、LBA4404-pCAMBIA1303-BpW的菌悬液等体积混合后侵染本氏烟草获得的瞬时表达烟草记为TRP1与BpW共同表达烟草，由LBA4404-pCAMBIA1303获得的瞬时表达烟草为空载对照烟草，在渗透菌液后的第3天后取材检测三萜化合物的含量。
2、检测瞬时表达本氏烟草中三萜化合物的含量
利用高效液相色谱法检测步骤1中得到的各瞬时表达烟草中白桦脂醇、白桦酯酸的含量，并利用未转化的野生型本氏烟作为对照。具体步骤为：取烟草叶片，60度烘干至恒重，磨碎，精密称取0.3g组织干样，加入25mL盐酸-无水乙醇溶液(将氯化氢浓度为36％-38％(质量百分比)的盐酸水溶液与乙醇按照体积比为2：8混合得到)，90℃回流3h，冷却后摇匀过滤，收集滤液。精密量取滤液15mL和蒸馏水15mL，混合后置于80℃水浴上蒸去乙醇，然后向剩余液体中加入20mL乙醚进行萃取，收集上层乙醚萃取液，剩余液体再利用20mL乙醚萃取2次，合并三次的上层乙醚萃取液并于40℃低温蒸干，并利用1mL甲醇溶解，再利用0.45μm有机滤膜滤过，得到待测液，然后利用高效液相色谱检测待测液中的白桦脂醇、白桦酯酸，分别以白桦脂醇(北京世纪奥科生物技术有限公司商城分公司，BWB50068)、白桦酯酸(北京世纪奥科生物技术有限公司商城分公司，BWB50067)为标准品，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。
高效液相色谱(HPLC)检测条件：用Waters公司600-717-2487色谱系统，色谱柱HiQsilC18V 4.6mm×250mm；流动相为乙腈：水＝9：1(v/v)；柱温25℃；灵敏度16AUFS；流速1.0mL/min；检测波长210nm，进样20μL(白桦脂醇回归方程为：y＝10000000x+63763，R2＝0.9995；白桦脂酸回归方程：Y＝9×106X+68020R2＝0.9994)，结果如图1、图2和表1所示。
表1、不同基因瞬时表达烟草中白桦脂醇和白桦脂酸的含量(mg/g干重)
烟草
白桦脂醇
白桦脂酸
野生型本氏烟
2.16
0.0363
TRP2表达烟草
3.23
0.45
TRP3表达烟草
3.15
0.43
BpW、TRP2与TRP3共同表达烟草
3.99
0.494
TRP1表达烟草
1.78
0.034
BpW表达烟草
1.86
0.032
TRP1与BpW共同表达烟草
2.50
0.373
结果显示，空载对照烟草与野生型本氏烟中的白桦脂醇和白桦脂酸含量均无显著差异。
TRP2和TRP3瞬时表达的烟草中，白桦脂醇和白桦脂酸的含量均显著高于野生型本氏烟，TRP2和TRP3瞬时表达的烟草中白桦脂醇含量分别为野生型本氏烟的1.50倍和1.46倍，白桦脂酸含量分别为野生型本氏烟的12.40倍和11.85倍。当BpW、TRP2和TRP3基因同时在烟草中表达时，白桦脂醇和白桦脂酸的含量均显著高于野生型本氏烟，二者分别为野生型本氏烟的1.85倍和13.62倍。以上结果说明，在白桦脂醇和白桦脂酸的生物合成中，TRP2和TRP3基因均发挥重要作用，BpW、TRP2和TRP3基因组合可以进一步提高白桦脂醇和白桦脂酸的含量。
TRP1瞬时表达的烟草中，白桦脂醇和白桦脂酸含量分别与野生型本氏烟相比，未见增加。BpW与TRP1共同侵染烟草时，白桦脂酸含量均显著高于BpW和TRP1分别单独侵染的烟草，且是野生型本氏烟的10.27倍，分别是BpW和TRP1分别单独侵染的烟草的11.65倍和10.97倍，表明TRP1在BpW基因过表达时，同样能够促进白桦脂酸的生物合成。BpW与TRP1共同侵染烟草时，白桦脂醇含量均显著高于BpW和TRP1分别单独侵染的烟草，且为野生型本氏烟的1.16倍，分别是BpW和TRP1分别单独侵染的烟草的1.34倍和1.40倍。说明，在白桦脂醇和白桦脂酸的生物合成中，TRP1与BpW基因可以协同发挥作用。
三、TRP1、TRP2、TRP3可以调控白桦中三萜合成途径相关基因的表达
1、转基因白桦的制备
利用步骤二的重组菌LBA4404-pCAMBIA1303-TRP1、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP2、LBA4404-pCAMBIA1303-TRP3以及LBA4404-pCAMBIA1303分别进行遗传转化，制备转基因白桦，步骤如下：
由东北林业大学种子园的优良白桦种子诱导成无菌苗(WPM培养基+0.5mg/L IBA+蔗糖20g/L+琼脂5.3g/L，pH 6.5)，并选择茎壮，叶片大的材料进行实验。
采用叶盘法进行白桦组织的的遗传转化，取包括白桦组培苗的叶片、茎段和叶柄的外殖体。将外植体置于含有6-BA(5mg/L)的IS培养基中预培养3天，得到预培养的外殖体。活化重组菌，挑取重组菌单菌落置于含有利福平(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，28℃震荡培养，直至菌液OD600＝0.6-0.8左右，将菌液4,000r/min离心5min，收集菌体。用等体积的无菌水重悬菌体得到重组菌悬液，将预培养的外殖体叶片浸入重组菌悬液中5min，取出材料，用无菌滤纸吸干多余液体，得到侵染后的外殖体。将侵染后的外殖体置于含有5mg/L 6-BA和0.6mg/L NAA的IS培养基上25℃暗培养3天。暗培养结束后，用含有500mg/L头孢霉素的无菌水涮洗数次至材料表面干净，滤纸吸干叶片表面水分，然后将其放入含有头孢霉素(500mg/L)、潮霉素(10mg/L)以及5mg/L 6-BA和0.6mg/L NAA的IS培养基中，连续脱菌数日至无菌，直至长出愈伤组织。将愈伤组织转移到含有6-BA(1mg/L)、头孢霉素(300mg/L)和潮霉素(10mg/L)的IS培养基中，诱导成苗，即得到转基因白桦。培养条件：温度为24～26℃，光照强度为2,000lx，光照时间16h/d，湿度为40～50％。
将由LBA4404-pCAMBIA1303-TRP1得到的转基因植株记为转TRP1基因白桦，将由LBA4404-pCAMBIA1303-TRP2得到的转基因植株记为转TRP2基因白桦，将由LBA4404-pCAMBIA1303-TRP3得到的转基因植株记为转TRP3基因白桦，将由LBA4404-pCAMBIA1303得到的转基因植株记为空载对照白桦。
2、转基因白桦的PCR鉴定
利用引物GUS-F/R进行PCR扩增鉴定步骤1得到的各转基因白桦，以未转基因的野生型白桦植株和空载对照白桦为阴性对照，pCAMBIA1303质粒为阳性对照。利用北京擎科生物科技有限公司2×T5Direct PCR Kit(Plant)试剂盒进行：取直径为1-2mm叶片，放入离心管内并加入50μL Lysis Buffer A，95℃加热5-10min，静置后取1μL作为模板，GUS-F/R为特异性引物，PCR扩增条件：98℃3min；98℃10s，60℃10s，72℃45s，30个循环；72℃5min，鉴定阳性植株。引物GUS-F/R如下：
GUS-F：ATTACGGCAAAGTGTGGGT，GUS-R：TGACGCACAGTTCATAGAG。
结果(图3中a)显示，转基因白桦以及阳性对照均显示有目的条带，证明包含TRP1、TRP2、TRP3基因得片段已整合到植物基因组中。野生型白桦植株和空载对照白桦中均不含有TRP1基因、TRP2基因或TRP3基因。
3、检测转基因白桦中目的基因表达量
利用实时荧光定量PCR(Premix Ex TaqTM，TaKaRa)方法分别对5株转TRP1基因白桦苗(TRP1-1、TRP1-5、TRP1-6、TRP1-7、TRP1-8)中TRP1基因的相对表达量进行检测，并利用未转基因的野生型白桦(WT)和空载对照白桦为对照。所用引物为TRP1-F和TRP1-R，利用Tubulin基因(微管蛋白基因)作为内参，内参引物为TU-F和TU-R，引物如表2。
结果(图3中b)显示，野生型白桦和空载对照白桦中TRP1基因的相对表达量无显著差异；与野生型白桦相比，转基因株系TRP1-1、TRP1-5、TRP1-6、TRP1-7、TRP1-8中的TRP1基因的表达量显著上调，分别为野生型白桦的14.52、17.47、14.86、4.74、7.64倍，其中TRP1在TRP1-5株系中的表达量最高。
4、检测转基因白桦中三萜合成途径相关基因的表达量
利用实时荧光定量PCR(Premix Ex TaqTM，TaKaRa)方法检测对转基因植株TRP1-5中三萜合成途径相关基因的相对表达量，并利用未转基因的野生型白桦(WT)和空载对照白桦为对照。利用Tubulin基因(微管蛋白基因)作为内参，内参引物为TU-F和TU-R。所用引物如表2。
表2、荧光定量PCR引物序列
结果(图3中c)显示，野生型白桦和空载对照白桦中各基因的相对表达量均无显著差异；与野生型白桦相比，BpSS、BpSE及BpW基因的相对表达量显著提高，其中BpW基因上调效果最为明显，BpDS和BpY基因的相对表达量被显著下调。说明白桦TRP1基因可以促进白桦脂醇和白桦脂酸合成基因上调表达。
<110> 东北林业大学
<120> 三萜相关蛋白质与其编码基因以及在提高植物三萜化合物含量中的应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 1
Met Glu Val Trp Leu Ile Ile Leu Ala Ser Leu Phe Ala Cys Phe Ser
1 5 10 15
Ile Lys Leu Leu Phe Ser Leu Phe Phe Ser Ser Lys Thr Thr Lys Asp
20 25 30
Gly Lys Leu Pro Pro Gly Pro Thr Pro Leu Pro Phe Ile Gly His Leu
35 40 45
His Ile Leu Pro Lys Ser Thr Ile Asp Leu Arg Ser Leu Ile Ser Asn
50 55 60
Leu Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Ile Leu Thr Leu Arg Val Gly Ser Lys
65 70 75 80
Pro Ile Ile Phe Ile Thr Ser Tyr Pro Ile Ala His Gln Ala Leu Val
85 90 95
Lys Asn Ser Ala Ile Phe Ala Asn Arg Pro Pro Ile Val Pro Val Ser
100 105 110
Tyr Val Leu Ser Asn Lys Arg Lys Asp Ile Gly Gly Ser Pro Tyr Gly
115 120 125
Leu Thr Trp Arg Leu Leu Arg Arg Asn Leu Met Ser Asp Ser Leu His
130 135 140
Pro Thr Gly Val Lys Ser Tyr Ser Phe Ala Arg Lys Arg Ser Leu Lys
145 150 155 160
Thr Met Ile Asp Ser Phe Lys Gln Cys Ser Pro Asn Glu Ala Val Arg
165 170 175
Leu Phe Glu His Leu His Arg Ala Val Phe Ser Leu Phe Ile Leu Met
180 185 190
Thr Tyr Gly Asp Ile Ser Glu Asp Ala Val Lys Glu Val Glu Asp Ile
195 200 205
Gln Tyr Lys Phe Leu Val Arg Tyr Ser Glu Phe Ser Val Phe Ala Thr
210 215 220
Trp Pro Thr Leu Gly Lys Leu Ile Tyr Arg Lys Lys Trp Lys Arg Tyr
225 230 235 240
Thr Glu Phe Leu Arg Arg Gln Tyr Asp Ile Leu Met Pro Tyr Ile Arg
245 250 255
Ala Arg Gln Lys Leu Lys Gln Glu Lys Gly Lys Asp Val Gly Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Thr Asp Thr Leu Leu Asp Leu Glu Ile Ser Glu Gly Ala Val
275 280 285
Asn Gln Gly Lys Phe Glu Asp Ala Asp Ile Leu Ser Leu Ser Ser Glu
290 295 300
Phe Ile Asn Ala Gly Ala Asp Thr Thr Ala Thr Val Phe His Trp Thr
305 310 315 320
Met Ala Tyr Leu Val Lys His Pro His Ile Gln Ala Lys Leu Phe Ala
325 330 335
Glu Ile Gly Arg Val Val Glu His Gly Ala Glu Glu Val Lys Glu Glu
340 345 350
Asp Leu Gln Arg Ile Pro Tyr Leu Lys Ala Val Ile Leu Glu Cys Leu
355 360 365
Arg Met His Pro Pro Asn Thr Ser Leu Val Pro His Thr Asn Thr Glu
370 375 380
Asp Met Glu Leu Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Lys Asn Thr Thr Val Leu
385 390 395 400
Ile Gly Thr Ser Ile Ile Gly Arg Asp Pro Thr Val Trp Glu Asn Pro
405 410 415
Met Glu Phe Arg Pro Glu Arg Met Met Gly Ser Asn Asp Asp Gly Gly
420 425 430
Glu Leu Thr Glu Val Ala Asp Val Ser Ser Phe Lys Met Leu Pro Phe
435 440 445
Gly Ala Gly Arg Arg Met Cys Pro Gly Tyr Lys Tyr Gly Thr Leu Val
450 455 460
Leu Glu Tyr Phe Ile Ala Asn Leu Val Trp Asn Phe Glu Trp Lys Ala
465 470 475 480
Val Asp Gly Val Asp Leu Thr Glu Lys Glu Glu Phe Leu Val Val Met
485 490 495
Lys Asn Pro Val Arg Ala Lys Val Ile Pro Arg Val Leu Lys
500 505 510
<210> 2
<211> 1533
<212> DNA
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 2
atggaggtct ggctcatcat cctcgcatct ctctttgcat gtttttccat aaaactcctc 60
ttcagccttt tcttttcctc caaaacaaca aaagatggca agctcccacc agggcccacg 120
cctcttccct tcatcggaca ccttcatata cttcccaaat ccaccatcga cctccgatcc 180
ctcatctcta acctctccaa aaagtacggc ccaattctga cactccgagt tggctctaag 240
cctatcattt tcattacctc ctaccccatt gcccaccaag cgcttgttaa aaacagtgcc 300
atctttgcaa accgtccgcc aatcgtccct gtcagctatg ttctcagtaa caagcgcaaa 360
gatattggcg ggtcccccta tggcctgact tggcgtctcc tccgtcgtaa cctcatgtct 420
gactctctcc accctactgg ggtgaagtcc tactctttcg cgcgcaagcg atccttgaaa 480
acaatgattg atagcttcaa gcaatgttcc ccgaacgagg ccgtccgcct ctttgagcat 540
ctccaccggg ccgtgttttc cttgttcatt ctcatgactt atggggacat cagcgaggat 600
gccgttaaag aagttgaaga catacaatac aaattccttg tcaggtactc tgagtttagt 660
gttttcgcca cctggccgac gctcgggaag cttatttaca gaaagaaatg gaaaaggtac 720
acagagtttt taaggcgtca atacgatatc ctcatgcctt atattagagc ccgacagaag 780
ttgaagcaag agaagggcaa agatgtcggc ttggtaacat acacagatac cttactggat 840
ttggaaattt ctgagggagc cgttaaccaa ggtaagtttg aggatgccga tatactgagc 900
ttgagctcag agtttatcaa cgcaggcgca gacacaaccg caacggtgtt ccactggacc 960
atggcgtatt tagtgaagca cccacatatt caagccaaac tctttgctga aatcggtcga 1020
gttgtggagc atggagcgga agaggttaaa gaggaggacc tgcaaaggat tccatatttg 1080
aaagcggtga ttctagaatg tctcagaatg caccctccaa atacctcgtt agtaccgcac 1140
acaaacacag aagatatgga attgtgcggc tacaatatcc ccaagaatac cacggtgctc 1200
atcgggacat caataatagg gcgcgatcca acagtgtggg agaatcctat ggagtttcgg 1260
ccagaaagga tgatgggtag caatgatgac ggcggagaat taactgaagt ggctgatgtg 1320
tcgtcgttta agatgttgcc ctttggtgcc gggaggagga tgtgtcccgg ttacaaatat 1380
gggacgcttg ttctggagta ctttattgcc aatttggttt ggaattttga gtggaaggca 1440
gtagatggcg ttgatctaac ggagaaggag gagttcttgg tagttatgaa gaatccggtg 1500
cgtgccaagg tcatcccaag agtactcaaa tag 1533
<210> 3
<211> 395
<212> PRT
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 3
Met Val Lys Ile Phe Ala Asp Cys Ser Glu Arg Thr Ile Leu Lys Phe
1 5 10 15
Glu Lys Leu Leu Gln Gly Glu Asn Leu Gly Gly Arg Lys Thr Met Glu
20 25 30
Leu Asp Leu Glu Ala Glu Phe Ser Asn Leu Ala Leu Asp Ile Ile Gly
35 40 45
Leu Ser Val Phe Asn Tyr Asp Phe Gly Ser Val Thr Lys Glu Ser Pro
50 55 60
Val Ile Lys Ala Val Tyr Gly Thr Leu Phe Glu Ala Glu His Arg Ser
65 70 75 80
Thr Phe Tyr Phe Pro Tyr Trp Lys Leu Pro Leu Ala Arg Trp Ile Val
85 90 95
Pro Arg Gln Arg Lys Phe Gln Lys Asp Leu Lys Ile Ile Asn Asp Cys
100 105 110
Leu Asp Gly Leu Ile Arg Asn Ala Lys Glu Thr Arg Gln Glu Thr Asp
115 120 125
Val Glu Lys Leu Gln Gln Arg Asp Tyr Lys Asn Leu Arg Asp Ala Ser
130 135 140
Leu Leu Arg Phe Leu Ile Asp Met Arg Gly Ala Asp Val Asp Asp Arg
145 150 155 160
Gln Leu Arg Asp Asp Leu Met Thr Met Leu Ile Ala Gly His Glu Thr
165 170 175
Thr Ser Ala Val Leu Thr Trp Ala Val Phe Leu Leu Ala Gln Asn Pro
180 185 190
Ser Lys Met Arg Lys Ala Gln Ala Glu Ile Asp Leu Val Leu Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Pro Thr Phe Glu Leu Leu Lys Lys Leu Glu Tyr Ile Arg Leu
210 215 220
Ile Ile Val Glu Ala Leu Arg Leu Tyr Pro Gln Pro Pro Leu Leu Ile
225 230 235 240
Arg Arg Ser Leu Arg Ser Glu Val Leu Pro Gly Gly Tyr Lys Gly Asp
245 250 255
Lys Asp Gly Tyr Thr Ile Pro Val Gly Thr Asp Ile Phe Ile Ser Val
260 265 270
Tyr Asn Leu His Arg Ser Pro Tyr Phe Trp Asp Arg Pro Asp Glu Phe
275 280 285
Glu Pro Glu Arg Phe Leu Val Glu Arg Lys Ser Glu Gly Ile Glu Gly
290 295 300
Trp Ala Gly Phe Asp Pro Ser Arg Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Pro Asn
305 310 315 320
Glu Ile Ile Ser Asp Phe Ala Phe Leu Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg
325 330 335
Lys Cys Ile Gly Asp Gln Phe Ala Leu Met Glu Ser Thr Val Ala Leu
340 345 350
Ala Val Leu Leu Gln Lys Phe Asp Val Glu Leu Arg Gly Pro Pro Glu
355 360 365
Ser Val Glu Leu Val Thr Gly Ala Thr Met His Thr Lys Asp Gly Leu
370 375 380
Trp Cys Lys Val Arg Lys Arg Glu Gly Val His
385 390 395
<210> 4
<211> 1188
<212> DNA
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 4
atggtcaaga tatttgctga ttgttcagaa agaacaatac tgaaatttga gaagcttcta 60
caaggagaga acttgggcgg aaggaagaca atggagttgg atcttgaagc agaattttct 120
aatttggctc ttgacattat tggtcttagt gtcttcaact atgattttgg atcagttacc 180
aaagaatctc ctgtaattaa ggcagtatac ggcactcttt ttgaagctga gcacagatct 240
actttctact ttccgtactg gaaacttcct ttggcaaggt ggattgtccc caggcagcgg 300
aagttccaga aggaccttaa aattatcaac gactgtcttg atggactcat cagaaatgca 360
aaagagaccc gacaggaaac agatgttgaa aaactgcaac aaagggacta caaaaatctc 420
agggatgcaa gtcttttgcg tttcttgatt gatatgcgag gagctgatgt cgatgaccgt 480
cagcttagag atgatctgat gacaatgcta attgctggtc atgaaacaac atctgctgtt 540
cttacctggg ctgttttcct gcttgcacaa aatccctcca aaatgagaaa agctcaagcg 600
gagattgatt tagtgcttgg gcaggggaga ccaactttcg aattgctcaa aaaattggag 660
tacattagac ttattattgt cgaagctctg cgtttgtatc ctcaacctcc tttactaatt 720
agacgttctc tcagatcaga agtattacca ggagggtaca agggtgacaa agatggttat 780
accattcctg ttgggactga tatcttcatt tctgtatata atctccatag atcgccgtat 840
ttttgggacc gacctgacga gtttgagccg gagaggtttt tggtggaaag gaagagtgaa 900
ggcattgaag gatgggctgg ttttgatcca tctcgaagcc ctggcgcatt atatccaaat 960
gagataatat cagattttgc cttcttaccc tttggcggcg gaccaagaaa atgcattgga 1020
gaccagtttg ctctgatgga gtctacggtg gcattggctg tgttgctgca aaagttcgac 1080
gtggagttga gaggaccccc agaatcggtg gaattagtca ccggggcaac aatgcacaca 1140
aaggatggat tgtggtgcaa agtgagaaag agagaaggtg tccattga 1188
<210> 5
<211> 512
<212> PRT
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 5
Met Glu Ala Leu Pro Ile Leu Leu Ala Ile Ala Ala Ala Thr Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Phe Trp Phe Tyr Leu Leu Ala Arg Lys Leu Thr Gly Pro Lys
20 25 30
Val Trp Pro Phe Phe Gly Ser Leu Pro Tyr Leu Phe Leu Asn Arg Cys
35 40 45
Arg Ile His Asp Trp Met Ala Asn Asn Leu Arg Ala Thr Gly Gly Leu
50 55 60
Ala Thr Tyr Gln Thr Cys Thr Ile Pro Phe Pro Phe Leu Ala Arg Lys
65 70 75 80
Gln Gly Phe Phe Thr Val Thr Cys His Pro Lys Asn Ile Glu His Ile
85 90 95
Leu Arg Ser Arg Phe Asp Asn Tyr Pro Lys Gly Pro Asp Trp Gln Ala
100 105 110
Ala Phe His Asp Leu Leu Gly Gln Gly Ile Phe Asn Ser Asp Gly Glu
115 120 125
Thr Trp Leu Ile Gln Arg Lys Thr Ala Ala Leu Glu Phe Thr Thr Arg
130 135 140
Thr Leu Arg Gln Ala Met Ala Arg Trp Val Asn Arg Thr Ile Lys Asn
145 150 155 160
Arg Leu Trp Cys Ile Leu Asp Lys Ala Ala Lys Asp Asn Ile Ser Val
165 170 175
Asp Leu Gln Asp Leu Leu Leu Arg Leu Thr Phe Asp Asn Ile Cys Gly
180 185 190
Leu Thr Phe Gly Lys Asp Pro Glu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Ser Asp
195 200 205
Asn Pro Phe Ala Met Ala Phe Asp Thr Ala Thr Glu Thr Thr Leu Gln
210 215 220
Arg Leu Leu Tyr Pro Gly Phe Leu Trp Arg Leu Glu Lys Leu Leu Gly
225 230 235 240
Ile Gly Ala Glu Arg Arg Leu Lys Glu Ser Leu Gln Val Val Glu Asn
245 250 255
Tyr Met Asn Asp Ala Ile Thr Ala Arg Lys Glu Ser Pro Ser Asp Asp
260 265 270
Leu Leu Ser Arg Phe Met Asn Lys Arg Asp Val Asp Gly Lys Thr Phe
275 280 285
Thr Val Ser Val Leu Gln Arg Ile Ala Leu Asn Phe Val Leu Ala Gly
290 295 300
Arg Asp Thr Ser Ser Val Ala Leu Ser Trp Phe Phe Trp Leu Val Met
305 310 315 320
His Asn Pro Glu Val Glu Asp Lys Ile Ile Glu Glu Ile Ser Thr Val
325 330 335
Leu Asn Asp Thr Arg Gly Ala Asp His Leu Lys Trp Val Gln Glu Pro
340 345 350
Leu Glu Phe Asp Glu Ala Asp Arg Leu Val Tyr Leu Lys Ala Ala Leu
355 360 365
Ala Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ser Val Pro Glu Asp Phe Lys Tyr
370 375 380
Val Val Ser Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr Phe Val Pro Ala Gly
385 390 395 400
Ser Thr Val Thr Tyr Ser Ile Tyr Ser Val Gly Arg Met Lys Ser Ile
405 410 415
Trp Gly Glu Asp Cys Met Glu Phe Lys Pro Glu Arg Trp Leu Ser Ala
420 425 430
Glu Gly Asp Arg Phe Glu Pro Pro Lys Asp Gly Tyr Lys Phe Val Ala
435 440 445
Phe Asn Ala Gly Pro Arg Thr Cys Leu Gly Lys Asp Leu Ala Tyr Leu
450 455 460
Gln Met Lys Ser Val Ala Ser Ala Val Leu Leu Arg Tyr Arg Ile Ser
465 470 475 480
Gln Val Pro Gly His Arg Val Glu Gln Lys Met Ser Leu Thr Leu Phe
485 490 495
Met Lys Asn Gly Leu His Val Tyr Val Gln Pro Arg Gln Leu Ser Val
500 505 510
<210> 6
<211> 1539
<212> DNA
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 6
atggaagccc tacctattct cttggccatt gcagctgcca catcagccta tctcttctgg 60
ttctatctcc tagcccgaaa gctcaccggt cccaaagtat ggcccttctt tgggagcctc 120
ccgtatctct ttctgaaccg gtgtagaatc cacgactgga tggctaacaa ccttcgcgcc 180
accggcggtt tagccacgta ccaaacatgc accatcccct ttcctttctt ggctcgcaag 240
caaggttttt tcacggtcac ttgtcacccc aagaacatcg agcacatcct ccgaagccgg 300
ttcgataact acccaaaagg ccctgactgg caggccgctt tccacgacct gttgggccaa 360
gggatcttca acagcgacgg cgagacgtgg ctcatacaac gcaaaacggc ggcgttggag 420
ttcaccacga ggacgctaag gcaagccatg gctcggtggg tgaaccggac catcaagaac 480
cggctctggt gcattttgga caaagcggct aaagacaaca tctcggtgga cttgcaggac 540
ttgttgctac gcttgacgtt cgataatata tgcggcctca cgttcggtaa agacccggaa 600
acgctctctc cggagctatc cgataacccg tttgccatgg cctttgacac cgccaccgaa 660
accactctcc aacggcttct ctacccgggt ttcctttgga gattggagaa gttattgggt 720
atcggagcgg agaggagatt gaaagaaagc cttcaagtcg tcgaaaacta catgaacgac 780
gccatcacgg cgcgcaagga atctccgtca gatgatttac tctctcgctt catgaacaaa 840
cgtgacgtcg acggcaaaac cttcacagtc tccgtcctcc aacgaatcgc tctcaacttc 900
gtcctcgccg gccgagacac gtcgtcggtg gcgctgagct ggttcttctg gctcgtcatg 960
cacaacccgg aggtcgagga caagatcatc gaggagatat caaccgtcct gaacgacaca 1020
cgtggcgccg accacttgaa atgggtccaa gagccgttgg agttcgacga ggccgaccgg 1080
ttggtctacc tgaaagccgc acttgccgaa acgctgcgtt tgttcccgtc cgtgccggag 1140
gacttcaagt acgtcgtctc cgacgatgtt ttaccggacg gcactttcgt accggccggt 1200
tcgacggtga cgtattcgat atattctgtt gggaggatga agagtatatg gggcgaggac 1260
tgcatggagt ttaaaccgga gcggtggctc tcggccgagg gagaccgctt cgaaccgccc 1320
aaagatgggt acaagttcgt ggccttcaat gctggaccga ggacttgtct tgggaaggac 1380
ttggcttacc tgcaaatgaa gtctgtagct tcggctgtgc ttttgaggta ccggatatcg 1440
caggttcccg gtcaccgggt ggagcagaag atgtctctga cgctgttcat gaagaatggg 1500
ctccacgtgt acgtgcaacc acgtcagctc tctgtgtga 1539
<210> 7
<211> 755
<212> PRT
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 7
Met Trp Lys Leu Lys Ile Ala Glu Gly Gly Pro Gly Leu Val Ser Gly
1 5 10 15
Asn Asp Phe Ile Gly Arg Gln His Trp Glu Phe Asp Pro Asp Ala Gly
20 25 30
Thr Pro Gln Glu Arg Ala Glu Val Glu Lys Val Arg Glu Glu Phe Thr
35 40 45
Lys Asn Arg Phe Gln Met Lys Gln Ser Ala Asp Leu Leu Met Arg Met
50 55 60
Gln Leu Arg Lys Glu Asn Pro Cys Gln Pro Ile Pro Pro Pro Val Lys
65 70 75 80
Val Lys Glu Thr Glu Val Ile Thr Glu Glu Ala Val Ile Thr Thr Leu
85 90 95
Arg Arg Ser Leu Ser Phe Tyr Ser Ser Ile Gln Ala His Asp Gly His
100 105 110
Trp Pro Gly Glu Ser Ala Gly Pro Leu Phe Phe Leu Gln Pro Phe Val
115 120 125
Met Ala Leu Tyr Ile Thr Gly Asp Leu Asn Thr Ile Phe Ser Pro Ala
130 135 140
His Gln Lys Glu Ile Ile Arg Tyr Leu Tyr Asn His Gln Asn Glu Asp
145 150 155 160
Gly Gly Trp Gly Phe His Ile Glu Gly His Ser Thr Met Phe Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Ser Tyr Ile Ala Leu Arg Ile Leu Gly Glu Gly Leu Glu Asp
180 185 190
Gly Glu Asp Gly Ala Met Ala Lys Ser Arg Lys Trp Ile Leu Asp His
195 200 205
Gly Gly Leu Val Ala Ile Pro Ser Trp Gly Lys Phe Trp Ala Thr Val
210 215 220
Leu Gly Leu Tyr Glu Trp Ser Gly Cys Asn Pro Leu Pro Pro Glu Phe
225 230 235 240
Trp Leu Leu Pro Asp Ile Phe Pro Ile His Pro Gly Lys Met Leu Cys
245 250 255
Tyr Cys Arg Leu Val Tyr Met Pro Met Ser Tyr Leu Tyr Gly Lys Arg
260 265 270
Phe Val Gly Pro Ile Thr Gly Leu Ile Gln Ser Leu Arg Gln Glu Leu
275 280 285
Tyr Asn Glu Pro Tyr His Gln Ile Asn Trp Asn Lys Ala Arg Ser Thr
290 295 300
Val Ala Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Pro His Pro Leu Ile Gln Asp Leu
305 310 315 320
Leu Trp Gly Phe Leu His His Val Ala Glu Pro Val Leu Thr His Trp
325 330 335
Pro Phe Ser Met Leu Arg Glu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Ile Gly His
340 345 350
Val His Tyr Glu Asp Glu Asn Ser Lys Tyr Leu Cys Ile Gly Ser Val
355 360 365
Glu Lys Val Leu Cys Leu Ile Ala Cys Trp Ala Glu Asp Pro Asn Gly
370 375 380
Glu Ala Tyr Lys Leu His Leu Gly Arg Ile Pro Asp Asn Tyr Trp Val
385 390 395 400
Ala Glu Asp Gly Leu Lys Ile Gln Ser Phe Gly Cys Gln Met Trp Asp
405 410 415
Ala Gly Phe Ala Ile Gln Ala Ile Leu Ser Cys Asn Leu Asn Glu Glu
420 425 430
Tyr Trp Pro Thr Leu Arg Lys Ala His Glu Phe Val Lys Ala Ser Gln
435 440 445
Val Pro Glu Asn Pro Ser Gly Asp Phe Lys Ala Met Tyr Arg His Ile
450 455 460
Asn Lys Gly Ala Trp Thr Phe Ser Met Gln Asp His Gly Trp Gln Val
465 470 475 480
Ser Asp Cys Thr Ala Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Leu Phe Ser Gln
485 490 495
Met Pro Pro Asp Leu Val Gly Glu Lys Ile Glu Lys Glu Arg Leu Tyr
500 505 510
Asp Ala Val Asn Val Ile Leu Ser Leu Gln Ser Ser Asn Gly Gly Phe
515 520 525
Pro Ala Trp Glu Ser Gln Arg Ala Tyr Gly Trp Leu Glu Lys Phe Asn
530 535 540
Pro Thr Glu Phe Phe Glu Asp Thr Leu Ile Glu Arg Glu Tyr Val Glu
545 550 555 560
Cys Thr Ser Ser Ala Val His Gly Leu Ala Leu Phe Arg Lys Phe Tyr
565 570 575
Pro Arg His Arg Arg Thr Glu Ile Asp Ser Ser Ile Tyr Arg Gly Ile
580 585 590
Gln Tyr Ile Glu Asp Val Gln Glu Pro Asp Gly Ser Trp Tyr Gly His
595 600 605
Trp Gly Ile Cys Tyr Thr Tyr Gly Thr Trp Phe Ala Val Gly Ala Leu
610 615 620
Ala Ala Cys Gly Arg Asn Tyr Lys Asn Cys Pro Ala Leu Arg Lys Ser
625 630 635 640
Cys Glu Phe Leu Leu Ser Lys Gln Leu Pro Asn Gly Gly Trp Gly Glu
645 650 655
Ser Tyr Leu Ser Ser Gln Asn Lys Val Trp Thr Asn Ile Glu Gly Asn
660 665 670
Arg Ala Asn Leu Val Gln Thr Ala Trp Ala Leu Leu Ser Leu Ile Asp
675 680 685
Ala Gly Gln Ala Glu Ile Asp Pro Thr Pro Ile His Arg Gly Val Arg
690 695 700
Val Leu Ile Asn Ser Gln Met Glu Asp Gly Asp Phe Pro Gln Gln Glu
705 710 715 720
Ile Thr Gly Val Phe Met Arg Asn Cys Thr Leu Asn Tyr Ser Ser Tyr
725 730 735
Arg Asn Ile Phe Pro Ile Trp Ala Leu Gly Glu Tyr Arg Arg Arg Val
740 745 750
Leu Phe Ala
755
<210> 8
<211> 2268
<212> DNA
<213> 白桦(Betula platyphylla suk.)
<400> 8
atgtggaagt tgaagatagc ggaaggaggg ccagggctgg tgagcggaaa tgatttcatc 60
gggcggcaac actgggaatt cgacccggat gccggcactc cccaagagcg tgctgaagtt 120
gaaaaggtcc gcgaggagtt caccaaaaat cggtttcaga tgaaacaaag cgctgatctt 180
ttgatgagga tgcagcttag gaaggagaac ccatgccaac caattccacc accagtgaaa 240
gtgaaagaaa cagaggtgat aacagaggaa gcagtgatta ctacactgag aagatcacta 300
agcttttatt cctccattca agctcatgat ggccactggc ctggtgaatc tgctggcccc 360
ttgtttttcc ttcaaccctt tgtaatggca ttatacatca ctggagatct caatactatt 420
ttttccccag cacaccagaa ggaaattatt cgatacttgt ataatcatca gaacgaagat 480
ggaggctggg ggttccatat agagggtcac agcacaatgt ttgggtcagc tttgagctac 540
attgccttga gaatacttgg agagggactt gaagatggtg aagatggggc tatggctaaa 600
agccggaaat ggattcttga ccatggtggt ttagtggcta ttccttcatg gggaaagttt 660
tgggccacgg tactgggact gtatgagtgg tcaggctgca atccactgcc cccagagttc 720
tggcttcttc ctgatatctt tcccatacat ccaggtaaaa tgttatgcta ctgtcgcttg 780
gtttacatgc caatgtctta tttatatggg aagaggtttg ttggtccaat cactggattg 840
attcaatcac ttagacaaga gttatataac gagccttacc atcaaattaa ctggaataaa 900
gcccggagta cagttgcaaa ggaggatctc tactatccgc atcccctcat acaagatctg 960
ctatggggat ttcttcacca tgtagccgag cctgtcctga cgcattggcc cttttcaatg 1020
ctgagagaga aggcactcaa agctgcaatt ggtcatgtac attatgagga cgagaacagc 1080
aaataccttt gcattggaag cgttgaaaag gtattatgtt tgattgcatg ttgggctgaa 1140
gatccaaatg gggaggcata caagcttcat ctaggaagga ttccagacaa ctattgggtt 1200
gctgaagatg gcttaaaaat tcagagtttc ggctgtcaga tgtgggatgc gggttttgct 1260
attcaagcaa ttctctcttg caatttaaac gaagagtatt ggccaacact tcgtaaagca 1320
catgagtttg taaaggcttc acaggtccca gaaaaccctt ctggggactt caaagccatg 1380
taccgccaca taaacaaagg agcatggaca ttctcgatgc aggaccatgg atggcaagtc 1440
tctgactgca ccgctgaagg gctgaaggtt gcaatcttgt tctcgcaaat gcctccggac 1500
cttgtcgggg aaaaaattga gaaagagcgg ttatatgatg ctgtgaatgt cattctttct 1560
ctacaaagta gcaatggtgg tttcccagca tgggagtctc aaagagcata tggttggttg 1620
gagaagttca accccacgga attctttgaa gataccctta ttgagcgaga gtacgtagag 1680
tgcacttcat ctgcagttca tggtctggca ctctttagga agttctatcc ccggcaccgg 1740
aggacggaga tagatagtag catttacagg ggaattcaat acattgaaga cgtgcaagaa 1800
cctgatggat catggtatgg tcattggggg atttgctaca cctacggtac atggtttgct 1860
gtaggggcac tggcagcctg tggaagaaac tacaaaaatt gtcctgcatt gcgcaaatct 1920
tgtgaatttt tgctatcaaa gcagctacct aatggtggat ggggagaaag ttacctatca 1980
agccaaaaca aggtgtggac gaatatagaa ggcaaccgtg caaatttagt ccaaacagca 2040
tgggccttgt tatccctcat tgatgctggg caggccgaga tagatccaac gccaattcat 2100
cgtggagtaa gagtattgat caattcacag atggaagatg gtgactttcc tcaacaggaa 2160
atcactggag tatttatgcg aaactgcaca ctaaactact catcatatag aaacattttt 2220
ccaatatggg ctcttggaga atatcggagg cgagttctat ttgcatga 2268
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：高亲和PVR突变体