高亲和pvr突变体
阅读说明：本技术 高亲和pvr突变体 (High affinity PVR mutants ) 是由 赵文珊 高艳锋 周晓文 周秀曼 祁元明 吴亚红 翟文杰 于 2020-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了几种高亲和PVR突变体,通过将野生型PVR或其同工变体的某氨基酸位点突变得到与TIGIT具有更高亲和力的PVR突变体。本发明的PVR突变体,亲和力高。本发明还提供了该突变体或其制剂在制备治疗、预防、或者缓解肿瘤相关疾病等药物中的用途。(The invention discloses several high-affinity PVR mutants, and PVR mutants with higher affinity with TIGIT are obtained by mutating certain amino acid positions of wild-type PVR or isovariant thereof. The PVR mutant of the invention has high affinity. The invention also provides the application of the mutant or the preparation thereof in preparing medicaments for treating, preventing or relieving tumor-related diseases and the like.)
技术领域：
本发明涉及分子生物领域，尤其涉及一种高亲和PVR蛋白突变体，蛋白的结构、对应氨基酸、对应基因序列、制备方法及应用。
技术背景：
近年来，恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一。肿瘤免疫疗法已成为继传统的外科手术、放射治疗、化学治疗、靶向治疗之后最受瞩目的治疗方法。靶向肿瘤微环境免疫抑制的免疫疗法被2013年《科学》杂志评选的十大科学突破之首。2018年诺贝尔生理学或医学奖授予肿瘤免疫治疗领域的两位免疫学家，以表彰他们在癌症免疫领域中做出的贡献。
免疫应答过程是机体内各种免疫细胞致炎机制和抗炎机制的微妙平衡过程，而这种平衡过程依赖于免疫细胞上受配体的相互作用以及细胞因子网络的参与。在肿瘤免疫治疗过程中，T细胞是肿瘤免疫应答的核心执行者。T细胞表面的调节性受体包括正性共刺激分子及负性共刺激分子，它们精准地调节T细胞的功能。其中，负性共刺激分子即为免疫检查点分子。T细胞表面的免疫检查点分子与肿瘤细胞上过度表达的配体相互作用，使T细胞陷入耗竭状态，造成肿瘤免疫耐受和免疫逃逸以及肿瘤治疗效果不佳。目前，已知T细胞上表达的免疫检查点分子包括：CTLA-4、PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT等。
TIGIT分子是近年新发现的一种具有免疫抑制作用的T细胞调节性受体，属于PVR/nectin蛋白家族，TIGIT的配体分子包括：CD155。CD155又被称为PVR或者nectin-like 5，主要在树突状细胞(DC)和各种肿瘤细胞等中表达。
TIGIT/PVR通路的研究以及抑制剂的开发在癌症免疫治疗领域具有潜力。因此，设计PVR高亲和突变体作为TIGIT/PVR信号通路的竞争性抑制剂，对于打破肿瘤免疫耐受具有重要的应用价值。
发明内容
一方面，本发明提供了几种高亲和PVR蛋白突变体，相比野生型人hPVR(h缩写在本文均表示人)蛋白或其同工变体，其氨基酸序列具有以下至少一个特征：
A、第72位氨基酸为R或W
B、第131位氨基酸为V
C、第132位氨基酸为Q或N。
所述同工变体是指，保留与TIGIT结合能力的PVR蛋白，其可来自不同物种，可为野生物种的截短蛋白或融合其他序列的蛋白衍生体。
可选地，与人野生型PVR蛋白相比，以上的PVR蛋白突变体与真核蛋白hTIGIT-Fc具有更高的亲和力。
任选地，所述野生型PVR蛋白或其同工变体包括如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，如所述野生型PVR蛋白序列为SEQ ID NO:1。
任选地，所述突变体为人源蛋白，如选自SEQ ID NO:1所示野生型PVR的四个单氨基酸位点突变体之一：S72R(表示第72位氨基酸由S变为R后的蛋白，本文其他突变体亦沿用该简称方法)，S72W，G131V或S132Q。
进一步，本发明提供了编码任一在先所述PVR蛋白突变体的分离的核酸分子。
进一步，本发明提供了含上述核酸分子的载体。
进一步，本发明提供了含上述核酸分子或载体的细胞。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”或简称“核酸分子”通常是指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一定组合，其不与在自然界中发现的多核苷酸的全部或一部分缔合，或连接至其在自然界中不连接的多核苷酸。
在本申请中，术语“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
在本申请中，术语“细胞”通常是指可以或已经含有包括本申请所述的核酸分子的质粒或载体，或者能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的个体细胞、细胞系或细胞培养物。所述细胞可以包括单个宿主细胞的子代。由于天然的、意外的或故意的突变，子代细胞与原始亲本细胞在形态上或在基因组上可能不一定完全相同，但能够表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段即可。所述细胞可以通过使用本申请所述的载体体外转染细胞而得到。所述细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(例如酵母细胞，例如COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，HeLa细胞，HEK-293细胞，COS-1细胞，NS0细胞或骨髓瘤细胞)。在某些情形中，所述细胞可以是哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞。在本本领域有时用更具体的术语“重组细胞”，通常是指在其中引入了重组表达载体的细胞。所述重组宿主细胞不仅包括某种特定的细胞，还包括这些细胞的后代。
进一步，本发明提供了含上述PVR蛋白突变体的各种药用形式，PVR突变体在药物中可以多种形式出现，比如蛋白、核酸分子、载体、细胞；如一种制剂，含有上述的PVR蛋白突变体。在本申请中，术语“药学上可接受的佐剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是PH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子可包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
相应地，本发明公开了该PVR蛋白突变体或其各种药用形式的医药用途，如：在制备治疗、预防、或者缓解TIGIT相关疾病等药物中的用途。所述TIGIT相关的疾病可以是T细胞功能障碍性病症。T细胞功能障碍体现在T细胞耗尽，是通过增强NK细胞和激活T细胞，增强机体免疫活性实现对疾病的治疗或延迟或缓解。例如，所述TIGIT相关的疾病可以是肿瘤、癌症或感染性病症。例如，所述TIGIT相关的疾病可以是PVR阳性或PVR阳性的肿瘤、癌症、免疫性疾病或感染性病症，包括肿瘤、癌症、免疫性疾病或感染性病症等。TIGIT相关疾病可具体选自下组：乳腺癌、结肠癌、肝癌、淋巴瘤、软骨肉瘤、多发性骨髓瘤、肺癌、肾癌、黑色素瘤、T淋巴瘤、胰腺癌。
本发明的有益之处在于：本发明的高亲和PVR蛋白突变体，通过将野生型PVR或其同工变体的氨基酸位点突变，得到具有更高亲和力的PVR蛋白突变体，不但可以显著下调T细胞活化和细胞因子分泌，同时还可以降低使用剂量，降低治疗成本。
附图说明：
图1表征实施例中质粒pLVXpuro-hPVR及其突变体在CHO-K1细胞膜上的定位，其中流式检测结果中，每个样品图(如PVR的)的左侧灰峰为同型对照，右侧表示构建稳定表达PVR目的蛋白的CHO-K1细胞膜上目的蛋白的表达情况。
图2：实施例中流式细胞仪检测hPVR(WT)及其突变体与hTIGIT-Fc蛋白的结合情况。
图3：实施例中hPVR及其突变体对TIGIT分泌IL-2的影响。
具体实施方式
下文中，F表示上游引物，R代表下游引物。
实施例1：慢病毒载体pLVXpuro-hPVR的构建。
(1)PCR扩增：利用KOD-Plus-Neo高保真扩增酶(TOYOBO)从cDNA中扩增得到hPVR基因。
扩增引物为：
hPVR-F:aaggatccgccaccatggcccgagc；
hPVR-R:cctctagatcaattacggcagctct；
PCR条件为：94℃2min，98℃10s，55℃2min，25个循环后，68℃，5min。
(2)PCR产物胶回收：PCR产物经过DNA凝胶电泳后，根据DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)说明书纯化回收得到hPVR基因片段。
(3)目的基因和载体的酶切：使用核酸内切酶BamHI，XbaI(NEB)，将步骤(2)中胶回收得到的目的片段和慢病毒载体pLVX-puro(本实验室自行保存)37℃酶切，2h。
(3)酶切产物胶回收：酶切产物经过DNA凝胶电泳后，根据DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)说明书纯化回收得到hPVR基因片段。
(4)目的片段与载体的连接与转化：用T4 DNA连接酶连接目的片段和载体pLVXpuro，将连接的得到的目标质粒pLVXpuro-hPVR转入XL-1Blue感受态，转化后产物涂布于LB Amp平板。
(5)测序鉴定：从步骤(4)平板上挑取单克隆，摇菌，送至基因公司进行测序。测序结果显示，慢病毒载体pLVXpuro-hPVR构建成功。
实施例2：pLVXpuro-hPVR突变蛋白慢病毒载体的构建
(1)PCR引物设计：根据hPVR突变体蛋白的基因序列和密码子表，设计hPVR四个蛋白突变体的引物。突变体蛋白的基因序列依此如下：
突变体S72R：
突变体S72W：
突变体G131V：
突变体S132Q：
引物序列为：
突变体S72R
hPVR-S72R-F:gcggcatggtgaacgtggcagcatggccgt；
hPVR-S72R-R:acggccatgctgccacgttcaccatgccgc；
突变体S72W
hPVR-S72W-F:gcggcatggtgaatggggcagcatggccgt；
hPVR-S72W-R:acggccatgctgccccattcaccatgccgc；
突变体G131V
hPVR-G131V-F:cacgttcccgcaggtcagcaggagcgtgga；
hPVR-G131V-R:tccacgctcctgctgacctgcgggaacgtg；
突变体S132Q
hPVR-S132Q-F:gttcccgcagggccagaggagcgtggatat；
hPVR-S132Q-R:atatccacgctcctctggccctgcgggaac；
(2)PCR扩增：
PCR扩增hPVR突变体蛋白基因反应体系为：50nghPVR DNA模板：1μL；10μM正向引物：1μL；10μM反向引物：1μL；10×Buffer：5μL；2mM dNTP：5μL；25mM MgSO4：3μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)：1μL；ddH2O：43μL，共50μL。
PCR反应条件为：94℃2min，98℃10s，55℃30s，68℃8min，15个循环后，68℃10min。
(3)DNA凝胶电泳和PCR产物的纯化：制备1％琼脂糖凝胶，取5μL的PCR产物加入1μL6×LoadingBuffer，点样，200V电泳15min。电泳检测到目的条带后，将剩余的45μL的PCR产物进行DNA片段纯化。
(4)DpnI酶切：用Dpn I(NEB)酶切pLVXpuro-hPVR模板。酶切体系：DNA纯化产物44μL；10×CutSmartbuffer 5μL；DpnI：1μL。酶切反应条件：37℃，2h；80℃，40min。
(5)转化与测序鉴定：将Dpn I酶切产物转入XL-1Blue感受态，转化后产物涂布于LB Amp平板。次日，挑取单克隆，摇菌，送至华大基因公司进行测序。
测序结果显示，含有hPVR基因突变体的慢病毒载体构建成功，分别命名为pLVXpuro-hPVR(S72R)，pLVXpuro-hPVR(S72W)，pLVXpuro-hPVR(G131V)，pLVXpuro-hPVR(S132Q)。
实施例3：hPVR及hPVR基因突变体过表达稳定细胞系的构建
3.1细胞复苏与培养
(1)复苏HEK-293T细胞和CHO-K1细胞：将新鲜的DMEM、RPMI 1640培养基在37℃水浴锅中预热。从-80℃冰箱中取出HEK-293T细胞和CHO-K1细胞，迅速放入37℃水浴锅中，缓慢振荡使其融化。将融化后的细胞悬液在1000rpm，25℃条件下，离心5min。离心后将上清吸弃，HEK-293T细胞加入1mL预热的DMEM培养基，CHO-K1细胞加入1mL预热的RPMI 1640培养基后重悬。将细胞悬液转移至培养皿中，补加相应的培养基至10mL，轻轻摇匀后放于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
(2)细胞传代：当细胞铺满皿底时，吸弃旧的培养基。用移液枪缓慢加入10mL的PBS7.2润洗细胞后，将PBS 7.2吸弃。加入1mL 0.25％的胰酶，显微镜下观察细胞变圆，细胞间隙加大时，去除胰酶。加入3mL新鲜培养基，终止消化，用移液枪轻轻吹打，将细胞吹散。将细胞悬液分至3个培养皿中，补加培养基至10mL，放入37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
3.2慢病毒包装
(1)在六孔板中铺HEK-293T细胞，转染当天在显微镜下观察细胞密度，细胞汇合度达到80-90％时可以进行转染。
(2)将HEK-293T细胞吸弃旧培养基，更换1mL新鲜的无双抗的DMEM培养基。
(3)在转染试剂powertrans 293加入辅助质粒PMD2.G和PSPAX2以及目的质粒pLVXpuro-hPVR/pLVXpuro-hPVR(S72R)/pLVXpuro-hPVR(S72W)/pLVXpuro-hPVR(G131V)/pLVXpuro-hPVR(S132Q)后混匀，形成脂质体-DNA复合物。将脂质体-DNA复合物加入HEK-293T细胞中。
(4)6h时更换新鲜的DMEM培养基，转染48h时，收取病毒，用0.45μm的滤头过滤除去细胞碎片。
3.3病毒感染CHOK1细胞
(1)将病毒液加入汇合度达到30-40％的CHOK1细胞的6孔板中，加入1μg/mL的Polybrene。用封口膜将6孔板封住，离心感染(2000rpm，30min，25℃)。
(2)感染4h时，补加培养基500μL。感染24h，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。
实施例4：hPVR及hPVR突变体细胞膜定位检测
(1)转染48h后，弃去旧的培养基。10mL PBS7.2润洗后，用0.25％的胰酶消化至显微镜下细胞呈现变圆、细胞间隙加大。加入新鲜的RPMI 1640培养基，重悬制成单细胞悬液。
(2)将细胞按3×105/管，分装于1.5mL离心管中，；离心(2000rpm，5min，4℃)弃掉培养基。用PBS7.2润洗一次，离心(2000rpm，5min，4℃)弃掉PBS。
(3)在细胞中加入anti-human hPVR(eBioscience)或其同型抗体，在冰上孵育30min。用1mL的PBS7.2润洗一次，离心(2000rpm，5min，4℃)弃掉PBS，加入200μL Buffer重悬制成单细胞悬液，流式上机检测hPVR及hPVR突变体蛋白在膜上的表达情况。
实施例5：突变体亲和力检测FACS
(1)将购买的Human-hTIGIT-Fc蛋白(Sino Biological Inc.)用无菌水使其完全溶解为250ng/μL的蛋白溶液，将蛋白溶液分装于低吸附的离心管中，放于-80℃冰箱中保存。
(2)将过表达hPVR，hPVR(S72R)，hPVR(S72W)，hPVR(G131V)，hPVR(S132Q)的CHO-K1细胞分别与120nM、60nM、30nM、15nM、7.5nM、3.75nΜ、1.875nM的真核蛋白Human-hTIGIT-Fc冰上孵育30min，
(3)与蛋白孵育结束后，PBS7.2润洗一次，离心(2000rpm，5min，4℃)后加入anti-humanIgG Fc(Biolegend)抗体，冰上孵育30min。阴性对照组不与真核蛋白Human-hTIGIT-Fc孵育，只加入anti-human Fc抗体。
(4)与抗体孵育结束后，用1mLPBS7.2润洗一次。加入200μLFACS buffer重悬制成单细胞悬液，流式细胞仪检测荧光强度的变化情况。
实施实例6：突变体对细胞因子分泌影响检测
(1)在24孔板中，将CHO-K1-hPVR、CHO-K1-hPVR(S72R)、CHO-K1-hPVR(S72W)、CHO-K1-hPVR(G131V)和CHO-K1-hPVR(S132Q)按1×105细胞/孔进行铺板。
(2)铺板12h时，在孔板中加入2×105Jurkat-hTIGIT细胞，加入1μg/mL anti-human CD3(BioGems)，0.5μg/mL anti-human CD28(BioGems)后共培养48h。对照组只加入Jurkat-hTIGIT细胞和anti-human CD3、anti-human CD28。
(3)共培养结束前4h，加入阻断剂。
(4)共培养48h时，收集细胞至1.5mL离心管中，离心弃掉上清中的培养基。
(5)将离心后的细胞涡旋混匀，加入200μL1×Fixation buffer(Thermo Fisher)重悬细胞，室温固定30min。
(6)固定结束后，加入1mL 1×Permeab ilization buffer(Thermo Fisher)洗涤两次。
(7)加入anti-human-IL-2APC(Biolegend)抗体或同型抗体(Rat IgG2a-APC，Biolegend)，冰上避光孵育30min。
(8)抗体孵育结束后，用PBS 7.2洗涤1次，200uLFACS Buffer重悬细胞，流式上机检测荧光强度的变化情况。
以上实施实例仅用作本领域技术人员理解本发明的实质，不用作对本发明保护范围的限定。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以变化和修改均属于本发明保护范围。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 高亲和PVR突变体
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 392
<212> PRT
<213> 智人(Homo Spaiens)
<400> 1
Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu
1 5 10 15
Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln
20 25 30
Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro
35 40 45
Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu
50 55 60
Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln
65 70 75 80
Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly
100 105 110
Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe
115 120 125
Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys
130 135 140
Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro
145 150 155 160
Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln
165 170 175
Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val
180 185 190
Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu
195 200 205
Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu
210 215 220
His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr
245 250 255
Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro
275 280 285
Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys
290 295 300
Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala
305 310 315 320
Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu
325 330 335
His Ser Gly Met Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile
340 345 350
Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser
355 360 365
Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser
370 375 380
Glu His His Gln Ser Cys Arg Asn
385 390