一种犬嗜吞噬细胞无形体p44重组蛋白及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种犬嗜吞噬细胞无形体p44重组蛋白及其制备方法和应用 (Canine phagocytophilic cell anaplasma P44 recombinant protein and preparation method and application thereof ) 是由 李晓光 何坚锋 王哲侃 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种犬嗜吞噬细胞无形体P44重组蛋白,属于动物病毒抗体检测领域。所述重组蛋白包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。本发明还进一步公开了所述重组蛋白的基因,包含所述基因的载体和宿主细胞,以及所述重组蛋白的其制备方法和在检测犬嗜吞噬细胞无形体的抗体中应用。利用本发明的重组蛋白检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体,方便快捷,灵敏度高,与其他病原体无交叉反应,特异性强,具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。(The invention discloses a canine phagocytophile anaplasma P44 recombinant protein, and belongs to the field of animal virus antibody detection. The recombinant protein comprises an amino acid sequence shown in SEQ ID NO.1 or consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1. The invention further discloses a gene of the recombinant protein, a vector and a host cell containing the gene, a preparation method of the recombinant protein and application of the recombinant protein in detecting an antibody of dog phagocytophilic anaplasma. The recombinant protein is used for detecting the canine phagocytophile anaplasma antibody, is convenient and rapid, has high sensitivity, no cross reaction with other pathogens, strong specificity, great clinical significance and wide application prospect.)
技术领域
本发明属于动物病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种犬嗜吞噬细胞无形体P44重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
犬嗜吞噬细胞无形体病(Anaplasma phagocytophilum)是由蜱作为传播媒介引起的血液病原菌，其所致疾病为经蜱传播的人兽共患病，由侵染动物末梢血中性粒细胞引起，动物患该病表现出的临床特征为发热、全身不适、食欲减退、乏力等类似流感样症状。
目前临床中较为直接的诊断方法为血涂片染色法，间接荧光抗体试验(Indirectfluorescence antibody，IFA)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked immunosorbentassay，ELISA)等免疫学方法，此外PCR(聚合酶链式反应)法也是一种常用于嗜吞噬细胞无形体的诊断，是用于诊断嗜吞噬细胞无形体病最为敏感和特异性较高的检测方法。但是上述的免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。
嗜吞噬细胞无形体抗体检测方面，目前国内外研究的主要方向均是使用一小部分蛋白序列进行检测抗体，这种情况势必有漏检的风险。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种犬嗜吞噬细胞无形体P44重组蛋白，包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
在本发明中，重组蛋白也叫融合蛋白或重组融合蛋白，是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。
P44蛋白是犬嗜吞噬细胞无形体主要的免疫原蛋白，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答。本发明将P44蛋白全长序列进行抗体检测，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应。
在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。
本发明的第二方面提供一种编码本发明第一方面所述重组蛋白的基因，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
该基因序列是为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达，可以提高蛋白表达效率。
本发明的第三方面提供一种表达载体，其包括本发明第二方面所述的基因。
在本发明的一些实施方案中，所述表达载体为pET30a，其具有卡那霉素抗性，表达的融合蛋白具有组氨酸(His)标签。
本发明的第四方面提供一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的表达载体。
进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。
在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为BL21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、费用低、表达量大等优点。
本发明的第五方面提供一种制备本发明第一方面所述重组蛋白的方法，包括诱导本发明第四方面所述宿主细胞进行蛋白表达的步骤。
进一步地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或原核宿主细胞。
在本发明的一些实施方案中，所述宿主细胞为原核宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，更优选地，大肠杆菌为BL21。利用大肠杆菌进行表达具有周期短、成本低、表达量大等优点。
在本发明的一些具体实施方案中，诱导大肠杆菌进行蛋白表达的步骤为：
S1，用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基37℃培养所述大肠杆菌，
S2，当大肠杆菌培养液OD600至0.5-0.7时，用终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h；利用该诱导条件，能够使得重组蛋白更加缓慢地表达，有充分的时间进行空间构象的形成，这对重组蛋白发挥功能具有非常重要的作用。
S3，将培养液于4℃，7000rpm离心10min，收集菌体；
S4，用缓冲液Binding Buffer破碎菌体；
S5，超声破碎菌体，条件为：550w，超声2s，间隔5s，共80-120次；
S6，4℃，12000rpm离心30min收集上清，所述重组蛋白在上清中。
优选地，步骤S2中在大肠杆菌培养液OD600至0.6时进行诱导。
优选地，步骤S5中，超声破碎100次。采用本发明的破碎方法，避免了破碎过于剧烈，造成重组蛋白损失的情况。
在本发明的一些实施方案中，进一步包括对重组蛋白进行纯化的步骤。重组蛋白的纯化方式可以有多种，例如离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等方法。在本发明的一些实施方案中，选择亲和层析的方法，由于重组蛋白中加入了His标签，一步纯化能够达到较高的纯度。
在本发明的一些具体实施方案中，将包含重组蛋白的上清过Ni柱，然后用洗脱缓冲液Elution Buffer洗脱得到目的蛋白。
优选地，所述洗脱缓冲液Elution Buffer的配方为：50mM Tris，0.2M Nacl，0.5MImidazole，pH8.0。
本发明的第六方面提供本发明第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体的试剂盒中的应用。
本发明的第七方面提供一种用于检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体的试剂盒，包括本发明第一方面所述的重组蛋白。
进一步地，所述试剂盒还包括鼠IgG和羊抗鼠IgG。
在本发明的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的试剂方法如下：
S1，分别制备重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物；
S2，将所述重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物混合，制备金标垫；
S3，利用重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠IgG作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；
S4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试区有检测线(T线)，质控区有质控线(C线)，检测线靠近金标垫，质控线靠近滤纸，即制备得到检测条。
在使用时，滴加犬生物样本至样本垫处，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下：
①两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；
②仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；
③质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。
在本发明的一些实施方案中，犬嗜吞噬细胞无形体抗体检测结果呈阳性，代表犬生物样本中含有犬嗜吞噬细胞无形体抗体，意味着犬具有犬嗜吞噬细胞无形体感染或曾被犬嗜吞噬细胞无形体感染。
在本发明的一些实施方案中，所述生物样本为血清或血浆，或任何其他可能包含抗体的体液。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
P44蛋白是犬嗜吞噬细胞无形体主要的免疫原性抗原且高度保守，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答，诱导宿主细胞产生中和抗体，因此将P44蛋白全长序列进行抗体检测，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。
本发明采用的胶体金标记免疫分析法是一种新型分析技术，具有快捷简便、成本低、无污染且无需培训的特点，与传统方法相比更为适合现场检测，具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，有广阔的市场前景和应用价值。
附图说明
图1示出了犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白纯化的凝胶电泳结果。1：蛋白marker(YEASEN，货号：20313ES76)；2：细胞破碎后上样；3：流穿；4：50mM Imidazole洗脱；5：0.5MImidazole洗脱。
图2示出了本发明一个实施例的检测试纸条的试剂图。1：样本垫；2：金标垫；3：NC膜；31：检测线(T线)；32：质控线(C线)；4：滤纸；5：底板。
图3示出了本发明的一个实施例利用试纸条进行检测的结果示意图。T：检测线，C：质控线。
图4示出了利用本发明的试纸条对临床犬血清样本进行检测的总体结果。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白基因表达载体的构建
犬嗜吞噬细胞无形体P44基因是根据NCBI Gene bank:WP_011451309的蛋白序列设计。
P44重组蛋融合白的氨基酸序列序列如下(SEQ ID NO.1)：
MMSLAIVMAGNDVRAHDDVSALDTGGAGYFYVGLDYSPAFSKIRDFSIRESNGETKAVYPYLKDGKSVKLESHKFDWNTPDPRIGFKDNMLVAMEGSVGYGIGGARVELEIGYERFKTKGIRDSGSKEDEADTVYLLAKELAYDVVTGQTDKLTAALAKTSGKDIVQFANAVKITNSTIDGKVCSGKHAALVPNKGKDYDADAKESNTNAHKTAQCSGLADSAATGPKSFSGFVGAVKVGEGKNWPTGRAASATSNETVVGPTNSNATAVAKDLVALNSDEKTIVAGLLAKTIEGGEVVEIRAVSSTSVMVNACYDLLSEGLGVVPYACVGLGGNFVGVVDGHITPKLAYRLKAGLSYQLSPEISAFAGGFYHRVVGDGVYDDLPAQRLVDDTSPAGRTKDTAIANFSMAYVGGEFGVRFAF
由于不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。
本发明利用大肠杆菌作为表达系统，为了获得更高的表达效率和更高的表达量，在进行外源蛋白表达时进行了密码子优化，反翻译成核苷酸序列，得到的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)：
ATGATGAGCCTGGCGATTGTGATGGCGGGCAACGATGTGCGCGCGCATGATGATGTGAGCGCGCTGGATACCGGCGGCGCGGGCTATTTTTATGTGGGCCTGGATTATAGCCCGGCGTTTAGCAAAATTCGCGATTTTAGCATTCGCGAAAGCAACGGCGAAACCAAAGCGGTGTATCCGTATCTGAAAGATGGCAAAAGCGTGAAACTGGAAAGCCATAAATTTGATTGGAACACCCCGGATCCGCGCATTGGCTTTAAAGATAACATGCTGGTGGCGATGGAAGGCAGCGTGGGCTATGGCATTGGCGGCGCGCGCGTGGAACTGGAAATTGGCTATGAACGCTTTAAAACCAAAGGCATTCGCGATAGCGGCAGCAAAGAAGATGAAGCGGATACCGTGTATCTGCTGGCGAAAGAACTGGCGTATGATGTGGTGACCGGCCAGACCGATAAACTGACCGCGGCGCTGGCGAAAACCAGCGGCAAAGATATTGTGCAGTTTGCGAACGCGGTGAAAATTACCAACAGCACCATTGATGGCAAAGTGTGCAGCGGCAAACATGCGGCGCTGGTGCCGAACAAAGGCAAAGATTATGATGCGGATGCGAAAGAAAGCAACACCAACGCGCATAAAACCGCGCAGTGCAGCGGCCTGGCGGATAGCGCGGCGACCGGCCCGAAAAGCTTTAGCGGCTTTGTGGGCGCGGTGAAAGTGGGCGAAGGCAAAAACTGGCCGACCGGCCGCGCGGCGAGCGCGACCAGCAACGAAACCGTGGTGGGCCCGACCAACAGCAACGCGACCGCGGTGGCGAAAGATCTGGTGGCGCTGAACAGCGATGAAAAAACCATTGTGGCGGGCCTGCTGGCGAAAACCATTGAAGGCGGCGAAGTGGTGGAAATTCGCGCGGTGAGCAGCACCAGCGTGATGGTGAACGCGTGCTATGATCTGCTGAGCGAAGGCCTGGGCGTGGTGCCGTATGCGTGCGTGGGCCTGGGCGGCAACTTTGTGGGCGTGGTGGATGGCCATATTACCCCGAAACTGGCGTATCGCCTGAAAGCGGGCCTGAGCTATCAGCTGAGCCCGGAAATTAGCGCGTTTGCGGGCGGCTTTTATCATCGCGTGGTGGGCGATGGCGTGTATGATGATCTGCCGGCGCAGCGCCTGGTGGATGATACCAGCCCGGCGGGCCGCACCAAAGATACCGCGATTGCGAACTTTAGCATGGCGTATGTGGGCGGCGAATTTGGCGTGCGCTTTGCGTTT
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重组基因序列，并与pET30a质粒连接，形成重组表达载体。
实施例2犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白的表达
将犬嗜吞噬细胞无形体P44融合基因质粒转化至大肠杆菌BL21中，涂布于含50μg/mL卡那霉素(上海生工，货号：K0408)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落，用含有相同浓度的卡那霉素的300mL LB培养基37℃培养至OD600达0.6左右，用终浓度为1mM的IPTG(上海生工，货号：IB0168)进行诱导表达，诱导条件为：25℃，转速200rpm，4h。诱导之后，将培养液4℃，转速7000rpm，离心10min，收集菌体。
实施例3犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白的纯化及复性
用50mL上样缓冲液Binding Buffer(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)50mL破碎菌体；然后超声破碎，条件为550w，超声2s，间隔5s，共100次；最后12000rpm，30min，4℃离心收集上清，目的蛋白在上清中。接着过Ni柱一步纯化，用洗脱缓冲液Elution Buffer(50mMTris，0.2M Nacl，0.5M Imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。利用PAGE凝胶电泳检测目的蛋白，结果如图1所示。
由图1可知，纯化后的融合蛋白纯度很高，将纯化后的重组蛋白用透析缓冲液(50mM Tris，0.2M Nacl，pH8.0)透析，每隔12h换一次透析液，共3次。取出透析后的蛋白液，经0.22μm滤器过滤后，用BCA法测定浓度后，于-20℃保存备用。
实施例4双抗原夹心金标法检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体
1双抗原夹心金标法检测条的制备
1.1胶体金的烧制
在三角烧瓶中加入1000mL超纯水，在磁力加热搅拌器上加热至沸腾，然后加入10％氯金酸(sigma)4mL，再加入10％柠檬酸三钠溶液6mL，继续加热沸腾5min，然后冷却至室温后用0.22μm过滤器过滤胶体金后放置4℃备用。
1.2重组犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白的标记
取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K2CO3调节金水pH至6.5，搅拌后加入1.2mg纯化后的重组犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白，室温搅拌15min，加入1mL 10％BSA溶液，室温搅拌15min后12000rpm离心10min，将上清小心吸出弃去，沉淀用金标稀释液(20mM Tris，1％BSA，0.03％Proclin300，pH8.0)定容至1mL，此为标记好的重组犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白胶体金复合物。
1.3鼠IgG标记
取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K2CO3调节金水pH至7.0，搅拌后加入1mg鼠IgG(杭州隆基生物技术有限公司，货号：AS00901)，室温搅拌15min，加入1mL 10％BSA溶液，室温搅拌15min后12000rpm离心10min，将上清小心吸出弃去，沉淀用金标稀释液(20mM Tris，1％BSA，0.03％Proclin300，pH8.0)定容至1mL，此为标记好的鼠IgG胶体金复合物。
将上述金标复合物用金标稀释液稀释100倍后与1.2步骤中稀释后的犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白胶体金复合物混合后浸泡玻璃纤维，37℃烘干4h后即制成金标垫。
1.4重组犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白的点膜
用点膜稀释液(50mM Tris，2％蔗糖，pH8.5)稀释纯化后P44融合蛋白至1.2mg/mL做为胶体金试纸条的检测线(Test-Line，T线)，用相同稀释液稀释羊抗鼠IgG(杭州隆基生物技术有限公司，货号：PS00901)至0.3mg/mL做为胶体金试纸条的质控线(Control-Line，C线)，将上述两种稀释之后的溶液划线至硝酸纤维素膜上，37℃烘干过夜。
1.5双抗原夹心金标法检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体试纸条的组装
将以上金标垫、包被好原料至硝酸纤维素膜(NC膜)的聚酯板及滤纸、样本垫等安装底板上，组装成犬嗜吞噬细胞无形体抗体双抗原夹心法检测试纸条。具体安装方式如图2所示：分别将样本垫1、金标垫2、NC膜3和滤纸4安装在底板5上。其中样本垫1叠加一部分压在金标垫2上，金标垫2叠加一部分压在NC膜3上，滤纸4叠加一部分压在NC膜3上。其中NC膜3分为测试区和质控区，测试区设置检测线31(T线)，质控区设置质控线32(C线)，检测线31靠近金标垫2，质控线32靠近滤纸4。
进一步，将组装好的试纸条用切条机切割成3mm条子，然后装入特别制定的塑料卡中，即成为成熟的检测试剂卡。
2双抗原夹心金标法检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体试纸条/卡的检测
加入90μL待检测样本(犬血清、血浆)至样本加样处(S)，室温放置10min后判定结果，结果判定标准如下(如图3所示)：
④两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；
⑤仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；
⑥质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。
3双抗原夹心金标法检测犬嗜吞噬细胞无形体抗体试纸条/卡的检测结果
一共检测15份犬嗜吞噬细胞无形体感染阳性犬血清(样本编号1～15)，及50份正常未患病且未经免疫的犬血清(样本编号16～65)，其中T线和C线两条线的表示检测结果为阳性，只有C线一条线的表示检测结果为阴性。
检测结果如表1所示：15份阳性血清中检测出阳性15例，漏检0例，在50份阴性血清中出现假阳2例(26号样本和49号样本)。
表1犬嗜吞噬细胞无形体抗体检测结果
由此可知，样本检测的灵敏度和特异性分别为100％和96％，整体符合率为96.9％，如图4所示。
以上结果表明，利用本发明的重组犬嗜吞噬细胞无形体P44融合蛋白检测犬嗜吞噬细胞无形体，具有非常高的的灵敏度和特异性，可以作为制作犬嗜吞噬细胞无形体抗体检测试纸条的原料，并可以在临床检测中广泛应用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 杭州亿米诺生物科技有限公司
<120> 一种犬嗜吞噬细胞无形体P44重组蛋白及其制备方法和应用
<130> AJ2010244
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Met Ser Leu Ala Ile Val Met Ala Gly Asn Asp Val Arg Ala His
1 5 10 15
Asp Asp Val Ser Ala Leu Asp Thr Gly Gly Ala Gly Tyr Phe Tyr Val
20 25 30
Gly Leu Asp Tyr Ser Pro Ala Phe Ser Lys Ile Arg Asp Phe Ser Ile
35 40 45
Arg Glu Ser Asn Gly Glu Thr Lys Ala Val Tyr Pro Tyr Leu Lys Asp
50 55 60
Gly Lys Ser Val Lys Leu Glu Ser His Lys Phe Asp Trp Asn Thr Pro
65 70 75 80
Asp Pro Arg Ile Gly Phe Lys Asp Asn Met Leu Val Ala Met Glu Gly
85 90 95
Ser Val Gly Tyr Gly Ile Gly Gly Ala Arg Val Glu Leu Glu Ile Gly
100 105 110
Tyr Glu Arg Phe Lys Thr Lys Gly Ile Arg Asp Ser Gly Ser Lys Glu
115 120 125
Asp Glu Ala Asp Thr Val Tyr Leu Leu Ala Lys Glu Leu Ala Tyr Asp
130 135 140
Val Val Thr Gly Gln Thr Asp Lys Leu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Thr
145 150 155 160
Ser Gly Lys Asp Ile Val Gln Phe Ala Asn Ala Val Lys Ile Thr Asn
165 170 175
Ser Thr Ile Asp Gly Lys Val Cys Ser Gly Lys His Ala Ala Leu Val
180 185 190
Pro Asn Lys Gly Lys Asp Tyr Asp Ala Asp Ala Lys Glu Ser Asn Thr
195 200 205
Asn Ala His Lys Thr Ala Gln Cys Ser Gly Leu Ala Asp Ser Ala Ala
210 215 220
Thr Gly Pro Lys Ser Phe Ser Gly Phe Val Gly Ala Val Lys Val Gly
225 230 235 240
Glu Gly Lys Asn Trp Pro Thr Gly Arg Ala Ala Ser Ala Thr Ser Asn
245 250 255
Glu Thr Val Val Gly Pro Thr Asn Ser Asn Ala Thr Ala Val Ala Lys
260 265 270
Asp Leu Val Ala Leu Asn Ser Asp Glu Lys Thr Ile Val Ala Gly Leu
275 280 285
Leu Ala Lys Thr Ile Glu Gly Gly Glu Val Val Glu Ile Arg Ala Val
290 295 300
Ser Ser Thr Ser Val Met Val Asn Ala Cys Tyr Asp Leu Leu Ser Glu
305 310 315 320
Gly Leu Gly Val Val Pro Tyr Ala Cys Val Gly Leu Gly Gly Asn Phe
325 330 335
Val Gly Val Val Asp Gly His Ile Thr Pro Lys Leu Ala Tyr Arg Leu
340 345 350
Lys Ala Gly Leu Ser Tyr Gln Leu Ser Pro Glu Ile Ser Ala Phe Ala
355 360 365
Gly Gly Phe Tyr His Arg Val Val Gly Asp Gly Val Tyr Asp Asp Leu
370 375 380
Pro Ala Gln Arg Leu Val Asp Asp Thr Ser Pro Ala Gly Arg Thr Lys
385 390 395 400
Asp Thr Ala Ile Ala Asn Phe Ser Met Ala Tyr Val Gly Gly Glu Phe
405 410 415
Gly Val Arg Phe Ala Phe
420
<210> 2
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatgagcc tggcgattgt gatggcgggc aacgatgtgc gcgcgcatga tgatgtgagc 60
gcgctggata ccggcggcgc gggctatttt tatgtgggcc tggattatag cccggcgttt 120
agcaaaattc gcgattttag cattcgcgaa agcaacggcg aaaccaaagc ggtgtatccg 180
tatctgaaag atggcaaaag cgtgaaactg gaaagccata aatttgattg gaacaccccg 240
gatccgcgca ttggctttaa agataacatg ctggtggcga tggaaggcag cgtgggctat 300
ggcattggcg gcgcgcgcgt ggaactggaa attggctatg aacgctttaa aaccaaaggc 360
attcgcgata gcggcagcaa agaagatgaa gcggataccg tgtatctgct ggcgaaagaa 420
ctggcgtatg atgtggtgac cggccagacc gataaactga ccgcggcgct ggcgaaaacc 480
agcggcaaag atattgtgca gtttgcgaac gcggtgaaaa ttaccaacag caccattgat 540
ggcaaagtgt gcagcggcaa acatgcggcg ctggtgccga acaaaggcaa agattatgat 600
gcggatgcga aagaaagcaa caccaacgcg cataaaaccg cgcagtgcag cggcctggcg 660
gatagcgcgg cgaccggccc gaaaagcttt agcggctttg tgggcgcggt gaaagtgggc 720
gaaggcaaaa actggccgac cggccgcgcg gcgagcgcga ccagcaacga aaccgtggtg 780
ggcccgacca acagcaacgc gaccgcggtg gcgaaagatc tggtggcgct gaacagcgat 840
gaaaaaacca ttgtggcggg cctgctggcg aaaaccattg aaggcggcga agtggtggaa 900
attcgcgcgg tgagcagcac cagcgtgatg gtgaacgcgt gctatgatct gctgagcgaa 960
ggcctgggcg tggtgccgta tgcgtgcgtg ggcctgggcg gcaactttgt gggcgtggtg 1020
gatggccata ttaccccgaa actggcgtat cgcctgaaag cgggcctgag ctatcagctg 1080
agcccggaaa ttagcgcgtt tgcgggcggc ttttatcatc gcgtggtggg cgatggcgtg 1140
tatgatgatc tgccggcgca gcgcctggtg gatgatacca gcccggcggg ccgcaccaaa 1200
gataccgcga ttgcgaactt tagcatggcg tatgtgggcg gcgaatttgg cgtgcgcttt 1260
gcgttt 1266
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