b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备方法
阅读说明：本技术 b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备方法 (Preparation method of type b haemophilus influenzae capsular polysaccharide ) 是由 胡浩 刘佳 朱学军 沈向向 于旭博 于 2020-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备方法。该方法包括对发酵澄清液进行超滤浓缩得到第一浓缩液；将所述第一浓缩液与除核酸液共搅拌后,离心收集上清,超滤浓缩得到第二浓缩液；所述除核酸液为EDTA、醋酸钠和脱氧胆酸钠的30％～50％(v/v)的乙醇溶液；向所述第二浓缩液中加入CTAB至终浓度0.5％～1.5％(g/ml)共搅拌以提取荚膜多糖,离心收集沉淀,用65％～75％(v/v)的乙醇复溶沉淀使得所述荚膜多糖溶剂其中得到复合多糖提取液；对所述复合多糖提取液离心并收集上清,使用无机盐解离除去CTAB后醇沉荚膜多糖。(The invention relates to the technical field of biology, and particularly relates to a preparation method of a type b haemophilus influenzae capsular polysaccharide. The method comprises the steps of carrying out ultrafiltration concentration on fermented clarified liquid to obtain a first concentrated solution; after the first concentrated solution and the nucleic acid removing solution are stirred together, centrifuging and collecting supernatant, and performing ultrafiltration concentration to obtain a second concentrated solution; the nucleic acid removing liquid is 30-50% (v/v) ethanol solution of EDTA, sodium acetate and sodium deoxycholate; adding CTAB into the second concentrated solution to a final concentration of 0.5-1.5% (g/ml) and stirring to extract capsular polysaccharide, centrifuging to collect precipitate, and re-dissolving the precipitate with 65-75% (v/v) ethanol to obtain a compound polysaccharide extracting solution; and centrifuging the composite polysaccharide extracting solution, collecting supernatant, dissociating by using inorganic salt to remove CTAB, and then precipitating capsular polysaccharide by alcohol.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备方法。
背景技术
“b型流感嗜血杆菌”简称“Hib”，即b型流感嗜血细菌，是儿童鼻咽部常见的共生细菌，能够导致重症肺炎、脑膜炎和其他侵入性疾病。几乎所有患者都是5岁以下儿童，年龄为4至18个月的儿童尤为脆弱。它通过呼吸道从感染者传播到易感个体。B型流感嗜血杆菌也会对脸、嘴巴、血液、会厌、关节、心脏、骨头、腹膜和气管等部位造成潜在严重的炎症感染。在应用疫苗前，大多数儿童都会在某段时期携带Hib，有时携带数月，但细菌定植率依年龄与社会经济状况不同相差很大。在Hib疫苗接种率高的地区，由于Hib结合疫苗的群体免疫作用，细菌在鼻咽部的定植率非常低。
根据荚膜多糖抗原成分的不同，应用型特异性免疫血清作荚膜肿胀试验或其它血清学试验，可以将Hib分成6个(a、b、c、d、e、f)血清型。其中b型对婴幼儿的致病性最强，且最多见，f型次之。b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸盐。
过去的60年中，很多国家已经广泛开展了对Hib各方面的研究，目前现有技术已经先后研制了四种不同类型均具有良好免疫原性的Hib多糖-蛋白结合疫苗。疫苗的持续高覆盖率已经引起美国Hib疾病发病率大幅度下降。人群免疫力的产生是接种Hib疫苗对儿童直接保护的结果，而人群免疫力又防止了鼻咽带菌和阻断了Hib的传播。这些疫苗的使用使Hib脑膜炎和会厌炎的发病率显著下降。疫苗生产工艺中多糖纯化是非常重要的一步。根据现行版《中华人民共和国药典》中提供的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖纯化方法，采用了有毒易腐蚀试剂苯酚，并且CTAB用量很大，制备成本高；采用超速离心的方式去除内毒素，成本较高，难以量产。此外，提纯后蛋白质和核酸含量偏高，核糖纯度不高等问题依然存在。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备方法，包括：
a)对发酵澄清液进行超滤浓缩得到第一浓缩液；
b)向所述第一浓缩液加入除核酸液，搅拌后离心收集上清，超滤浓缩得到第二浓缩液；
所述除核酸液为含有0.001mol/L～0.003mol/L的EDTA、4％～8％(g/ml)醋酸钠和0.5％～1.5％(g/ml)脱氧胆酸钠的30％～50％(v/v)的乙醇溶液；
所述第一浓缩液和所述第二浓缩液的体积独立地选自所述发酵澄清液体积的1/10～1/3；
c)向所述第二浓缩液中加入CTAB至终浓度0.5％～1.5％(g/ml)共孵育以提取荚膜多糖，搅拌后离心收集沉淀，用65％～75％(v/v)的乙醇复溶沉淀使得所述荚膜多糖溶解其中得到复合多糖提取液；
d)对所述复合多糖提取液离心并收集上清，使用无机盐解离除去CTAB后醇沉荚膜多糖。
根据本发明的再一方面，本发明还涉及如上所述方法制备得到的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖。
本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中通过将发酵澄清液超滤浓缩，先去除一部分杂质减小后续除杂操作的压力，同时减小操作体积增加操作便利性；通过向发酵浓缩液中加入含特定浓度EDTA、醋酸钠、DOC的低浓度乙醇来去除大部分核酸、蛋白质和内毒素，从而取代苯酚抽提步骤，降低操作难度和操作安全风险；利用复合多糖溶于高浓度乙醇而杂质和CTAB结合物不溶的特性，对残余少量杂质进一步分离纯化，进而拿到精制Hib多糖，该方法具有产量高，产出稳定，杂质含量低等优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中所制备的得到的荚膜多糖的核磁共振氢谱图；
图2为本发明一个实施例中所制备的得到的荚膜多糖的核磁共振氢谱图；
图3为本发明一个实施例中所制备的得到的荚膜多糖的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备方法，包括：
a)对发酵澄清液进行超滤浓缩得到第一浓缩液；
b)向所述第一浓缩液加入除核酸液，搅拌后离心收集上清，超滤浓缩得到第二浓缩液；
所述除核酸液为含有0.001mol/L～0.003mol/L的EDTA、4％～8％(g/ml)醋酸钠和0.5％～1.5％(g/ml)脱氧胆酸钠的30％～50％(v/v)的乙醇溶液；
所述第一浓缩液和所述第二浓缩液的体积独立地选自所述发酵澄清液体积的1/10～1/3；
c)向所述第二浓缩液中加入CTAB至终浓度0.5％～1.5％(g/ml)共孵育以提取荚膜多糖，搅拌后离心收集沉淀，用65％～75％(v/v)的乙醇复溶沉淀使得所述荚膜多糖溶解其中得到复合多糖提取液；
d)对所述复合多糖提取液离心并收集上清，使用无机盐解离除去CTAB后醇沉荚膜多糖。
本发明中通过将发酵澄清液超滤浓缩，先去除一部分杂质减小后续除杂操作的压力，同时减小操作体积增加操作便利性；通过向发酵浓缩液中加入含特定浓度EDTA、醋酸钠、DOC的低浓度乙醇来去除大部分核酸、蛋白质和内毒素，从而取代苯酚抽提步骤，降低操作难度和操作安全风险；利用复合多糖溶于高浓度乙醇而杂质和CTAB结合物不溶的特性，对残余少量杂质进一步分离纯化，进而拿到精制Hib多糖，该方法具有产量高，产出稳定，杂质含量低等优势。
在一些实施方式中，所述发酵澄清液可采用公知的方法制备得到，例如在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，将已杀菌的培养液物，离心去菌体后收集上清。
在一些实施方式中，所述除核酸液为含有0.0015mol/L～0.0025mol/L的EDTA、5％～7％(g/ml)醋酸钠和0.7％～1.3％(g/ml)脱氧胆酸钠的35％～45％的乙醇溶液。
在一些实施方式中，所述除核酸液为含有0.002mol/L的EDTA、6％(g/ml)醋酸钠和1％(g/ml)脱氧胆酸钠的40％的乙醇溶液。
在一些实施方式中，所述CTAB以8％～12％(g/ml)的浓度加入所述第二浓缩液。
在一些实施方式中，所述CTAB的终浓度为0.7％～1.3％(g/ml)，也可以为1％。
在一些实施方式中，所述发酵浓缩液与所述除核酸液的体积比为1：(1.5～2.5)，也可以为1：2。
在一些实施方式中，所述解离除去CTAB的方法包括：
向上清液中加入氯化钠至终浓度0.4M～0.6M，2～8℃搅拌30min，离心，收集沉淀；
用含0.3M～0.5M氯化钠的30％～50％(v/v)的乙醇溶解沉淀，离心收集上清。
在一些实施方式中，步骤d)后还包括步骤e)：用水复溶醇沉得到的荚膜多糖，超滤浓缩，收集截留液并将其干燥。干燥的方法优选冷冻干燥。
在一些实施方式中，所述超滤浓缩所用率膜的截留分子量为90～110k，或者95k、105k，最优选100k。
在一些实施方式中，步骤b)中所述搅拌的时间为2h～4h。
在一些实施方式中，步骤c)中所述搅拌的时间为4h～8h。
在一些实施方式中，用65％～75％(v/v)的乙醇复溶沉淀在搅拌下进行，搅拌时间为8h～16h。
在本发明中，若非特别说明，则孵育、复溶等描述的搅拌时间优选在室温下计算，室温例如18℃～30℃，也可以为20℃、22℃、25℃、27℃；优选在低温下计算，低温例如2℃～8℃，也可以为3℃、4℃、5℃、6℃、7℃。
在一些实施方式中，所述b型流感嗜血杆菌的血清型选自a、b、c、d、e、f中的一种或多种。
本发明还涉及如上所述方法制备得到的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖。
本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的组合物。
该组合物多糖含量高，且蛋白质、核酸及内毒等杂质含量很低。纯度更高，使用更安全。
如前所述，本发明所提供的方法可以不采用传统荚膜多糖纯化工艺中常用的酚类、丙酮等有机试剂，CTAB由浓缩液中加入，用量更少，但提取效率更高。与此同时，最终产品的品质远超过药典的要求，蛋白质、核酸及其他杂质的含量更低，未来使用更加安全，所得产品可应用于疫苗的制备。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1第一批b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/5；
2.除核酸
向发酵浓缩液中按体积比为1：2加入40％乙醇溶液(0.002mol/L的EDTA、6％醋酸钠和1％)，室温搅拌3h；
3.收集粗制多糖
离心，收集上清，然后用100K膜包对上清进行超滤浓缩；
4.收集复合多糖
向超滤浓缩液中加入10％CTAB至终浓度1％；室温搅拌6h；离心，离心收集沉淀；用70％乙醇溶解复合多糖，室温搅拌12h；
5.收集复合多糖乙醇溶液
离心，收集上清；
6.收集盐沉多糖
向离心上清中加入2M氯化钠溶液至终浓度0.5M，2～8℃搅拌30min；离心，收集沉淀；
7.收集乙醇溶液
用30％～50％乙醇(含0.4M氯化钠)溶解盐沉多糖；离心收集上清；
8.醇沉多糖
补加乙醇至90％，混匀后静置过夜；离心，收集沉淀；
9.超滤
用纯化水进行复溶，然后用100K膜包进行超滤浓缩，收集截留液，即为多糖原液；
10.冻干
冷冻干燥，保存。
实施例2第二批b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/10；
2.除核酸
向发酵浓缩液中按体积比为1：1.4加入50％乙醇溶液(0.001mol/L的EDTA、8％醋酸钠和0.5％)，室温搅拌3h；
3.收集粗制多糖
离心，收集上清，然后用100K膜包对上清进行超滤浓缩；
4.收集复合多糖
向超滤浓缩液中加入10％CTAB至终浓度0.5％；室温搅拌6h；离心，离心收集沉淀；用65％乙醇溶解复合多糖，室温搅拌12h；
5.收集复合多糖乙醇溶液
离心，收集上清；
6.收集盐沉多糖
向离心上清中加入2M氯化钠溶液至终浓度0.6M，2～8℃搅拌30min；离心，收集沉淀；
7.收集乙醇溶液
用30％～50％乙醇(含0.3M氯化钠)溶解盐沉多糖；离心收集上清；
8.醇沉多糖
补加乙醇至90％，混匀后静置过夜；离心，收集沉淀；
9.超滤
用纯化水进行复溶，然后用100K膜包进行超滤浓缩，收集截留液，即为多糖原液；
10.冻干
冷冻干燥，保存。
实施例3第三批b型流感嗜血杆菌荚膜多糖制备
1.发酵澄清液超滤浓缩
采用100K膜包对发酵澄清液进行超滤浓缩，控制发酵浓缩液体积在发酵澄清液体积的1/3；
2.除核酸
向发酵浓缩液中按体积比为1：2.5加入30％乙醇溶液(0.003mol/L的EDTA、4％醋酸钠和1.5％)，室温搅拌3h；
3.收集粗制多糖
离心，收集上清，然后用100K膜包对上清进行超滤浓缩；
4.收集复合多糖
向超滤浓缩液中加入10％CTAB至终浓度1.5％；室温搅拌6h；离心，离心收集沉淀；用75％乙醇溶解复合多糖，室温搅拌12h；
5.收集复合多糖乙醇溶液
离心，收集上清；
6.收集盐沉多糖
向离心上清中加入2M氯化钠溶液至终浓度0.4M，2～8℃搅拌30min；离心，收集沉淀；
7.收集乙醇溶液
用30％～50％乙醇(含0.5M氯化钠)溶解盐沉多糖；离心收集上清；
8.醇沉多糖
补加乙醇至90％，混匀后静置过夜；离心，收集沉淀；
9.超滤
用纯化水进行复溶，然后用100K膜包进行超滤浓缩，收集截留液，即为多糖原液；
10.冻干
冷冻干燥，保存。
根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求对实施例1～3制备得到的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖进行检定。
从鉴定结果可知，本发明制备得到b型流感嗜血杆菌荚膜多糖，其蛋白质、核酸、内毒素含量第，多糖表达量在0.65g/L。
实施例1～3所制备的得到的荚膜多糖的核磁共振氢谱图依次如图1～图3所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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