一种酶法酯交换的技术
阅读说明：本技术 一种酶法酯交换的技术 (Technology for enzymatic transesterification ) 是由 王永华 何诗 戚穗坚 杨博 王卫飞 蓝东明 罗日明 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种酶法酯交换方法,包括以下步骤：在脂肪酶的作用下,甘油三酯A与甘油三酯B进行酯交换反应；所述甘油三酯A为短链甘油三酯、中链甘油三酯和长链甘油三酯中的至少一种；所述甘油三酯B为长链甘油三酯；所述脂肪酶为脂肪酶MAS1或MAS1-H108A。本发明方法可以同时高收率地实现短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换。(The invention relates to an enzymatic transesterification method, which comprises the following steps: under the action of lipase, triglyceride A and triglyceride B are subjected to transesterification reaction; the triglyceride A is at least one of short chain triglyceride, medium chain triglyceride and long chain triglyceride; the triglyceride B is long-chain triglyceride; the lipase is a lipase MAS1 or MAS 1-H108A. The process of the present invention can simultaneously achieve transesterification of short/medium/long triglycerides with long triglycerides in high yield.)
技术领域
本发明涉及化学领域，特别是涉及一种酶法酯交换方法。
背景技术
油脂广泛用于食品和工业用途。然而，由于天然的甘油三酯结构不能为产品提供理想的特性，因此大多数食用油脂的技术应用受到限制。为了增强天然食用油脂的技术特性，可以通过酯交换的过程来改变甘油三酯的结构，从而改变其理化性质。
酯交换有化学酯交换和酶法酯交换两种，化学酯交换通过随机酯交换对甘油三酯的结构组成进行改造，广泛用于工业生产中。但是酶法酯交换近年来受到了广泛关注，与传统的化学酯交换相比，酶法酯交换具有多种优势，因为酶作为催化剂反应，过程简单，灵活，不涉及使用有害化学物质且副产物较少，而且由于酶法酯交换的反应温度通常不高，抑制了对热不稳定的生物活性化合物和脂肪酸的降解。因此，可以获得具有更好营养品质和保质期的最终产品。
由于不同碳链的脂肪酸具有不同的功能，不同种类的脂肪酸的不同组合和定位形成不同的结构脂。在结构脂的制备中，主要包括短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸作为结构脂的功能性脂肪酸来源。
短长链结构脂中的长链和短链脂肪酸在甘油骨架上随机排列，在消化过程中短链脂肪酸会在肝脏中快速代谢，热量只有普通油脂的一半左右。因此，制备得到短长链甘油三酯具有广泛的应用意义。张晶等人以三乙酸甘油酯和三油酸甘油酯为原料，脂肪酶Lipozyme TL IM作催化剂，在水分含量1％，反应温度55℃，三乙酸甘油酯：三油酸甘油酯＝2:1(mol/mol)，反应时间18h，酶＝25IUN/g底物，有机溶剂正己烷，震荡速率50Hz下制备短长链结构脂的产率为76％(张晶,周家春,夏泉明.低热量油脂Salatrim研制[J].粮食与油脂,2004(01):22-24)。操丽丽使用Lipozyme RM IM作为催化剂，在无溶剂体系下，加酶量10％，水分含量1％，底物摩尔比2.5:1，反应温度为55℃，反应12h，进行酯交换反应，制备含有不饱和脂肪酸的结构脂(操丽丽.低热量结构脂质的酶法制备及特性研究[D].合肥工业大学,2015.)。
中链脂肪酸因为具有更小的体积和更好的溶解性可以直接通过门静脉进入肝脏。当中链脂肪酸进入小肠绒毛细胞后，不会重新酯化形成甘油三酯，所以不会形成脂肪积聚。因此，制备得到中长链甘油三酯具有广泛的应用意义。Yee Ying Lee等选用脂肪酶Lipozyme TL IM，以棕榈仁油和棕榈油为底物，进行酶法酯交换合成MLCT结构脂。通过响应面法优化得到最佳反应条件：棕榈仁油和棕榈油底物质量比为9:1，反应时间7.26h，温度50℃和加酶量5％，获得MLCT结构脂的含量为60％(Lee Yee-Ying etc,Journal of foodscience and technology,2015,52(2))。赵曼丽[6]以樟树籽仁油和茶油为反应底物，选用脂肪酶Lipozyme TL IM催化酯-酯交换制备MLCT结构脂，最优条件为反应温度60℃，反应3h，樟树籽仁油/茶油底物摩尔比为1:1.5，得到产物中MLCT结构脂含量为55.81％(赵曼丽.酶催化樟树籽油制备结构脂质的研究[D].南昌大学,2014.)。
此外，部分长链脂肪酸，对人体有很多有益作用。例如n-3多不饱和脂肪酸，n-3多不饱和脂肪酸的来源主要是在人体内将α-亚麻酸转化为少量的二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸，从海洋鱼类或鱼油中获取。甘油三酯型的多不饱和脂肪酸是天然存在形式之一，口感好，性质稳定。因此，制备得到含有n-3多不饱和脂肪酸的功能化甘油三酯具有广泛的应用意义。
但是，根据目前对酯交换制备结构脂的研究中，并没有一种酶法能够同时实现短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的高得率酯交换。即使是针对单一短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换研究中，也普遍存在着原料转化率较低，产品得率较低、酯交换过程复杂的问题，尤其是短长链甘油酯，例如三丁酸甘油酯，其在酯交换过程中生成的三丁酸，其对大部分脂肪酶的结构和活性会产生不利影响，从而使短长链甘油酯的酯交换效率和产物得率均很不理想，这大大限制了功能性结构酯的供应和应用。
此外，由于甘油三酯大多粘度高，脂肪酶在其中的活性会受到影响，因此，许多酶催化的酯交换反应往往必须在溶剂体系中才能具有比较好的催化产率，但是溶剂的使用往往会造成生产成本增加、环境不友好、步骤增加等缺点。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种酶法酯交换方法，该方法可以同时实现短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换，并且均可以实现良好的得率。
具体技术方案如下：
一种酶法酯交换方法，包括以下步骤：在脂肪酶的作用下，甘油三酯A与甘油三酯B进行酯交换反应；
所述甘油三酯A为短链甘油三酯、中链甘油三酯和长链甘油三酯中的至少一种；
所述甘油三酯B为长链甘油三酯；
所述脂肪酶为脂肪酶MAS1或MAS1-H108A。
在其中一些实施例中，所述脂肪酶为MAS1-H108A。
在其中一些实施例中，所述脂肪酶MAS1或MAS1-H108A来源于Streptomycetessp.Strain W007。
在其中一些实施例中，，所述甘油三酯A与甘油三酯B的质量之比为1：2.5～5；进一步地，所述甘油三酯A与甘油三酯B的质量之比为1：2.5～3.5。
在其中一些实施例中，所述反应的温度为55～75℃。
在其中一些实施例中，所述反应的温度为65～75℃。
在其中一些实施例中，所述脂肪酶为固定化的脂肪酶。
在其中一些实施例中，所述脂肪酶的添加量为20～100U/g底物。
在其中一些实施例中，所述短链甘油三酯为三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述中链甘油三酯为三辛酸甘油酯、三癸酸甘油酯和三月桂酸甘油酯中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述甘油三酯A中，所述长链甘油三酯为三棕榈酸酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、棕榈油、橄榄油、菜籽油、茶油、大豆油、核桃油、玉米油、牛油和猪油中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述甘油三酯B中，所述长链甘油三酯为三油酸甘油酯、三亚麻酸甘油酯、三亚油酸甘油酯、棕榈油、橄榄油、菜籽油、茶油、大豆油、核桃油、玉米油、牛油和猪油中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述反应体系为有溶剂反应体系或无溶剂反应体系。
在其中一些实施例中，所述反应体系为有溶剂反应体系时，反应溶剂为叔丁醇。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明得到了一种可以同时高得率地实现短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯进行酯交换的方法。即通过选择脂肪酶MAS1或MAS1-H108A作为催化酶，尤其是选择MAS1-H108A作为催化酶，结合合适的反应条件，最终同时实现了短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换高达65％～90％的收率。
此外，本发明方法不使用溶剂不会明显影响反应得率，可以兼容溶剂体系和无溶剂体系，适用范围广，操作简便，成本低，绿色可持续。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本实施方式提供一种酶法酯交换方法，包括以下步骤：在脂肪酶的作用下，甘油三酯A与甘油三酯B进行酯交换反应；
所述甘油三酯A为短链甘油三酯、中链甘油三酯和长链甘油三酯中的至少一种；
所述甘油三酯B为长链甘油三酯；
所述脂肪酶为脂肪酶MAS1或MAS1-H108A。
本发明所述脂肪酶MAS1为野生型，来源于放线菌Streptomycetes sp.StrainW007，脂肪酶MAS1-H108A是野生型脂肪酶MAS1的突变体。本发明方法所使用的脂肪酶MAS1或MAS1-H108A(固定化)，可以是购买或者按照本领域常规方法制备得到。
在其中一些实施方式中，所述脂肪酶为MAS1-H108A。本发明方法选用MAS1-H108A催化酯交换反应，具有更高的得率。
本发明的发明人在研究中意外发现，所述脂肪酶MAS1或MAS1-H108A只有在甘油三酯A与甘油三酯B的质量比为1：2.5～5，尤其是1：2.5～3.5时，才可以很好地催化其发生酯交换反应，并得到很好的得率。
进一步地，所述甘油三酯A与甘油三酯B的质量比为1：2.6～3.4，1：2.7～3.3，1：2.8～3.2，1：2.9～3.1，或1:3。
本发明方法选择脂肪酶为MAS1-H108A，并使甘油三酯A与甘油三酯B的质量比为1：2.5～3.5，反应温度为65～75℃，可以得到更高的酯交换得率，针对短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换收率高达86.9～89.7％。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体：其制备参考文献《李琳琳.固定化脂肪酶MAS1-H108A的制备及其催化合成富含α-亚麻酸甘油三酯的应用研究[D].华南理工大学,2019.》。
固定化脂肪酶MAS1野生型：其制备参考文献《汪秀妹.脂肪酶MAS1的固定化及其催化合成PUFA型功能性脂质的研究[D].华南理工大学,2017.》。
LipozymeTL IM：购于诺维信(天津)有限公司；
三乙酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三丙酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三丁酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三辛酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三癸酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三月桂酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三油酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三亚油酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三亚麻酸甘油酯：购于北京化夏化学试剂有限公司；
三棕榈酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
三硬脂酸甘油酯：购于上海阿拉丁(aladdin)有限公司；
茶油：购于当地市场
菜籽油：购于当地市场
棕榈油：购于当地市场
橄榄油：购于当地市场。
实施例1
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化三丁酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，在不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定短长链甘油三酯含量，以短长链甘油三酯得率作为酯交换程度的指标，具体数据见表1。
表1
实施例2
使用固定化脂肪酶MAS1野生型催化三丁酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，在不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定短长链甘油三酯含量，以短长链甘油三酯得率作为酯交换程度的指标，具体数据见表2。
表2
实施例3
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化三丁酸甘油酯与茶油反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，底物质量比1:3(三丁酸甘油酯/茶油(w/w))、反应温度70℃下进行酯交换反应。反应6h后，取反应液，通过LC-MS测定短长链甘油三酯含量，以短长链甘油三酯得率为81.9％。
实施例4
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化三辛酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定中长链甘油三酯含量，以中长链甘油三酯作为酯交换程度的指标，具体数据见表3。
表3
实施例5
使用固定化脂肪酶MAS1野生型催化三辛酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定中长链甘油三酯含量，以中长链甘油三酯作为酯交换程度的指标具体数据见表4。
表4
实施例6
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化三辛酸甘油酯与菜籽油反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，底物质量比1:3(三辛酸甘油酯/菜籽油(w/w))、反应温度为70℃下进行酯交换反应。反应6h后，取反应液，通过LC-MS测定中长链甘油三酯含量，中长链甘油三酯得率84.7％。
实施例7
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化三棕榈酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定不为单一脂肪酸的甘油三酯含量，以甘油骨架上不为单一脂肪酸的甘油三酯得率作为酯交换程度的指标，具体数据见表5。
表5
实施例8
使用固定化脂肪酶MAS1野生型催化三棕榈酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，不同底物质量比、反应温度下进行酯酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定不为单一脂肪酸的甘油三酯含量，以甘油骨架上不为单一脂肪酸的甘油三酯得率作为酯交换程度的指标，具体数据见表6。
表6
实施例9
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化棕榈油与橄榄油反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，底物质量比1:3(棕榈油/橄榄油(w/w))、反应温度70℃下进行酯交换反应。反应6h后，取反应液，通过LC-MS测定1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯(OPO)含量，OPO得率80.6％。
实施例10
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化三辛酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，加酶量为50U/g底物，溶剂为叔丁醇，在不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定中长链甘油三酯含量，以中长链甘油三酯作为酯交换程度的指标，具体数据见表7。
表7
实施例11
使用固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体催化三辛酸甘油酯与菜籽油反应，在加酶量为50U/g底物，添加叔丁醇，底物质量比1:3(三辛酸甘油酯/菜籽油(w/w))、反应温度70℃下进行酯交换反应。反应6h后，取反应液，通过LC-MS测定中长链甘油三酯含量，中长链甘油三酯得率82.7％。
对比例1
使用固定化脂肪酶LipozymeTL IM催化三丁酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，在不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定短长链甘油三酯含量，以短长链甘油三酯作为酯交换程度的指标，具体数据见表8。
表8
对比例2
使用固定化脂肪酶LipozymeTL IM催化三丁酸甘油酯与茶油反应，加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，在底物质量比1:2(三丁酸甘油酯/茶油(w/w))、反应温度60℃下进行酯交换反应。反应18h后，取反应液，通过LC-MS测定短长链甘油三酯含量，短长链甘油三酯得率61.9％。
对比例3
使用固定化脂肪酶LipozymeTL IM催化三辛酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，不同底物质量比、反应温度下进行酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定中长链甘油三酯含量，以中长链甘油三酯作为酯交换程度的指标，具体数据见表9。
表9
对比例4
使用固定化脂肪酶LipozymeTL IM催化三棕榈酸甘油酯与三油酸甘油酯反应，在加酶量为50U/g底物，不添加溶剂，不同底物质量比、反应温度下进行酯酯交换反应。反应完后，取反应液，通过LC-MS测定不为单一脂肪酸的甘油三酯含量，以甘油骨架上不为单一脂肪酸的甘油三酯得率作为酯交换程度的指标具体数据见表10。
表10
由上述结果可知，本发明方法选择MAS1-H108A突变体或MAS1野生型固定化脂肪酶作为酯交换催化酶，尤其是选择MAS1-H108A突变体，结合合适的反应条件，可以同时高得率地实现短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换。实施例1中短长链甘油三酯最高实现了88.3％的得率，实施例4中中长链甘油三酯最高实现了89.7％的得率，实施例7中非单一脂肪酸甘油三酯最高实现了86.9％的得率。
而对比例1-4中，选择固定化脂肪酶Lipozyme TL IM替换实施例1-11中的固定化脂肪酶MAS1-H108A突变体或MAS1野生型，发现其分别针对短、中、长链甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换的得率均低于实施例1-11，并且其针对短链甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换的催化得率最高仅为62.5％，催化效果明显低于针对中、长链甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换的催化效果(72.4％和73.0％)，不能同时高得率地实现短/中/长甘油三酯与长链甘油三酯的酯交换。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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