一种酶催化合成琥珀酸氯霉素的工艺方法
阅读说明：本技术 一种酶催化合成琥珀酸氯霉素的工艺方法 (Process method for synthesizing chloramphenicol succinate through enzyme catalysis ) 是由 胡惜朝 李自永 邓萌 范艳利 周双双 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种酶催化合成琥珀酸氯霉素的工艺方法,属于生物医药技术领域,所述工艺方法以氯霉素为原料,使氯霉素与琥珀酸酐在水解酶的作用下,在溶剂中适宜条件下发生反应,完全转化后经简单过滤、脱色、重结晶即得高纯度琥珀酸氯霉素。所述的水解酶为蛋白酶、脂肪酶、脂肪酶、酰基转移酶中的任一种或多种组合,其中酶可以是天然来源或通过基因工程技术重组获得。本发明采用的酶催化工艺与已有的工艺相比,更方便、安全,污染更小,质量更高,成本更低,更适合琥珀酸氯霉素的大规模工业化生产。(The invention relates to a process method for synthesizing chloramphenicol succinate through enzyme catalysis, which belongs to the technical field of biological medicine. The hydrolase is any one or combination of protease, lipase and acyltransferase, wherein the enzyme can be natural source or obtained by recombination through genetic engineering technology. Compared with the existing process, the enzyme catalysis process adopted by the invention is more convenient and safer, has less pollution, higher quality and lower cost, and is more suitable for large-scale industrial production of chloramphenicol succinate.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种琥珀酸氯霉素的合成方法。
背景技术
氯霉素(Chloramphenicol)是一种从委内瑞拉链霉菌中发现的酰胺醇类广谱抗生素。对革兰阳性及阴性菌、厌氧菌、螺旋体、衣原体和立克次体属均有抑制作用。临床上主要用于治疗伤寒、流感、肺炎、脑膜炎等，对百日咳、砂眼、细菌性痢疾及尿道感染等也有效。氯霉素类抗生素因其用途大且价廉易规模化合成制备，现在仍然是一线临床用药。
但氯霉素有抑制骨髓造血功能的严重不良反应，可使人体各类血细胞减少，甚至产生不可逆的再生障碍性贫血，因而限制了其扩大使用。因此，人们对氯霉素的结构进行改造，以期保持药效的同时降低毒副作用，其中琥珀酸氯霉素就是较成功的氯霉素衍生物。
琥珀酸氯霉素(Chloramphenicol Succinate)系统名为D-苏式-(-)-N-α-(羟基甲基)-β-羟基-对硝基苯乙基-2,2-二氯乙酰胺-α-琥珀酸酯，在体内能快速水解游离出氯霉素而产生作用，药效与氯霉素相同甚至更优，而副作用较氯霉素大大降低。其经典制备方法是由氯霉素和琥珀酸酐在有机碱催化下反应制得，在专利和论文等文献中相关化学合成方法报道较多，但传统化学合成方法原料用量多，产量较低，而且反应过程能耗高，反应试剂毒性大，污染环境，所用传统化学催化剂活性较低，导致反应选择性较差副产物较多，不仅产率不高而且产品质量较低，后处理精制困难。这些缺点限制了该方法的工业化应用。
综上，亟需开发一种成本更加低廉、操作更加方便、更加安全高效的琥珀酸氯霉素制备方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种酶催化合成琥珀酸氯霉素的工艺方法，采用水解酶催化氯霉素与琥珀酸酐进行酯化反应生成琥珀酸氯霉素，生产效率和产品质量更高，具备操作方便、成本低廉、环境友好、安全高效等优点。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种酶催化合成琥珀酸氯霉素的工艺方法，包括以下步骤：
步骤一、氯霉素和琥珀酸酐在生物酶催化下反应生成琥珀酸氯霉素：
将氯霉素和琥珀酸酐混溶入溶剂中，再加入水解酶，水浴控温0-60℃进行混合反应，监测至氯霉素转化完毕，则停止反应；回收酶催化剂，反应溶液加活性碳脱色，抽滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，得白色固体产物；
所述琥珀酸酐和氯霉素的摩尔比为1-1.2：1；所述水解酶为蛋白酶、脂肪酶和酰基转移酶中的一种或多种，所述水解酶的加入量为氯霉素质量的5％-50％；
步骤二、精制：
向步骤一所得白色固体产物中加入良溶剂，室温搅拌至溶解，然后缓慢加入不良溶剂；或，向步骤一所得白色固体产物中加入由良溶剂和不良溶剂组成的结晶溶剂；缓慢降温至0～5℃，恒温静置，析出白色针状晶体，过滤，所得晶体50℃真空干燥2小时得精制产品；
所述良溶剂为甲醇、乙醇或丙酮中的任一种或多种混合溶剂；所述不良溶剂为水；所述良溶剂与不良溶剂的体积比为1:1，所述良溶剂和不良溶剂的总加入量为所述白色固体产物质量的8-12倍。
步骤一中，所述溶剂为丙酮、乙腈、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二氧六环、甲苯、异丙醚中任意一种或多种的混合物，优选丙酮。
步骤一中，所述脂肪酶为来源于嗜热真菌、米黑根毛霉菌、南极假丝酵母、皱落假丝酵母、洋葱假单胞菌、荧光假单胞菌、黑曲霉、枯草杆菌以及米根霉菌中的任意一种或多种。更优选地，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶CALB或米黑根毛霉脂肪酶RML。最优选地，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶CALB。
步骤一中，所述水解酶为固定化酶。
步骤一中，所述水解酶的加入量为氯霉素质量的10％-20％。
步骤一中，所述水浴控温40℃进行混合反应。
步骤一中，所述混合反应是在釜式搅拌反应器、酶填充固定床反应器或摇床中进行。
步骤一中，在所述混合反应之前，向反应体系中加入吸水剂。优选地，所述吸水剂为分子筛、硅胶、藻土或无水硫酸钠，所述吸水剂的加入量为溶剂质量的5％。
步骤二中，所述精制的具体过程为：在20～40℃条件下，先加入甲醇搅拌溶解琥珀酸氯霉素白色固体产物粗品，然后缓慢加入纯净水，再缓慢降温到0～5℃，最后静置2～6小时析晶。
有益效果：
本发明采用水解酶催化氯霉素与琥珀酸之间的酯化反应过程，与现有技术相比，生产效率和产品质量更高，具备操作方便、成本低廉、环境友好、安全高效等优点，更适合工业化生产琥珀酸氯霉素。
附图说明
图1是实施例1所述反应的反应方程式；
图2是实施例2所述反应的反应方程式；
图3是实施例3所述反应的反应方程式；
图4是实施例4所述反应的反应方程式；
图5是实施例5所述反应的反应方程式；
图6是采用本发明制备的琥珀酸氯霉素的色谱图。
具体实施方式
一种酶催化合成琥珀酸氯霉素的工艺方法，包括以下步骤：
步骤一、氯霉素和琥珀酸酐在生物酶催化下反应生成琥珀酸氯霉素：
将一定比例的氯霉素和琥珀酸酐混溶入溶剂中，再加入水解酶，水浴控温混合反应，监测至氯霉素转化完毕，则停止反应；回收酶催化剂，反应溶液加活性碳脱色，抽滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，得白色固体产物；
步骤二、精制：
向步骤一所得白色固体产物中加入良溶剂，室温搅拌至溶解，然后缓慢加入不良溶剂至产物饱和，缓慢降温至4℃，恒温静置，析出白色针状晶体，过滤，所得晶体50℃真空干燥2小时得精制产品。
步骤一中，所述水解酶为蛋白酶、脂肪酶和酰基转移酶中的一种或多种。
进一步地，所述脂肪酶来源于嗜热真菌(Thermomyces lanuginosa)、米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)、南极假丝酵母(Candida Antarctica)、皱落假丝酵母(Candidarugosa)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)以及米根霉菌(Rhizopus oryzae)中的任意一种或多种。更优选地，所用的脂肪酶是南极假丝酵母脂肪酶CALB和米黑根毛霉脂肪酶RML。最优选地，所用的脂肪酶是南极假丝酵母脂肪酶CALB。
根据本发明，采用的水解酶并不局限于天然来源，还包括通过分子生微学手段重组的酶。所用的酶形态并没有限制要求，既可以是干粉也可以是固定化的，由于使用固定化的酶，后续处理方便，且可以回收重复使用，因此，水解酶特别优选为固定化酶。在以上众多的脂肪酶中，我们发现来源于南极假丝酵母(Candida Antarctica)和米黑根毛霉菌(Rhizomucor miehei)的脂肪酶对氯霉素和琥珀酸酐的选择性酯化反应具有更好的活性。一般采用固定化的酶，使酶更稳定，后处理方便且可重复利用，例如，可选用大孔吸附树脂固定的南极假丝酵母脂肪酶B(Novozym 435)和离子交换树脂固定的米黑根毛霉脂肪酶(Lipozyme RM IM)。
步骤一中，所述溶剂为丙酮、乙腈、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二氧六环、甲苯、异丙醚中任意一种或其混合物。在多个实例中，以丙酮作为溶剂酶催化活性更高，转化率更完全，且其沸点较低，易蒸馏回收，所以我们选择丙酮作为溶剂，但不限于丙酮。
步骤一中，加入原料琥珀酸酐与氯霉素的摩尔比可为1～1.2，因酶催化反应的高活性和高选择性，副反应少，琥珀酸酐与氯霉素的可以按理论量1:1摩尔比完全反应，实际过程使价格较低的原料琥珀酸酐稍过量，优选摩尔比为1.1。
步骤一中，以固定化脂肪酶的比酶活10000U/g为标准，其加入脂肪酶质量与氯霉素的质量比为5％～50％，如果不考虑酶的回收再利用，更优选质量比为10％～20％,最优选15％。固定化脂肪酶催化反应在温度可选用0～60℃下进行，较低温度条件下酶更稳定不易失活，但催化活性较低，反应较慢；较高温度下，酶活较高，反应快，但酶不稳定，易失活。综合考虑脂肪酶的稳定性、催化活性和能耗，优选反应温为40℃，可以在保证在15％的固定化脂肪酶加入量下，使琥珀酸酐和氯霉素之间的酯化反应在8小时内完全转化。
本技术发明是脂肪酶催化的氯霉素与琥珀酸酐之间的酯化反应过程，脂肪酶是水解酶的一种，也可以催化酯水解，所以必须保证体系无水。在工艺步骤(1)中，可以使用分子筛、硅胶、藻土、无水硫酸钠等吸水剂，除去溶剂带入的少量水，最大限度降低水解逆反应，促进酯化反应，提高反应转化率。
根据本发明，在工艺步骤(1)中，活性碳脱色方法为本领域专业人员所熟知。具体的，活性碳可用粉状，加入质量为氯霉素原料质量的5％，加热沸腾并搅拌10分钟即可。
根据本发明，在工艺步骤(1)中，酶催化反应过程，一般使用釜式搅拌反应器，考虑到搅拌过程中的剪切力可能使酶失活，也可以在摇床中振荡反应。特别是对固定化酶来说，最优方法是使用固定化酶填充床反应器，可使琥珀酸氯霉素生产过程连续化，并最大限度的减少酶的失活，提高重复利用率。
根据本发明，步骤(2)中用一定比例的良溶剂和不良溶剂的混合溶剂作为琥珀酸氯霉素精制时的结晶溶剂，良溶剂可选用甲醇、乙醇、丙酮中任一种或其混合溶剂，不良溶剂是水。实例中优选甲醇/水按体积比1:1的比例混合用作结晶溶剂，混合溶剂加入量为所需精制结晶的琥珀酸氯霉素固体质量的8～12倍，优选10倍量。
根据本发明步骤(2)结晶过程，是在20～40℃条件下，先加入甲醇搅拌溶解琥珀酸氯霉素固体粗品，然后缓慢加入纯净水，再缓慢降温到0～5℃，最后静置2～6小时析晶。
实例中优选溶解温度30℃，静置结晶温度4℃，静置结晶时间4小时。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例中转化率用高效液相色谱测定：Agilent 1200液相色谱仪，色谱柱：C182.1mm×250mm，流动相：水/乙腈＝85/15，流速0.5mL/min,检测波长：280nm，柱温：室温。转化率＝产物峰面积/(残留氯霉素峰面积+产物峰面积)×100％。
实施例中所用的脂肪酶参见表1。
表1：脂肪酶种类及其来源表。
代号
酶
来源
E01
Lipozyme RMIM
Rhizomucor miehei
E02
Lipozyme TLIM
Thermomyces lanuginosa
E03
Novozyme 435
Candida Antarctica
E04
Lipase PS
Pseudomonas cepacia
E05
Lipase AK
Pseudomonas fluorescens
E06
Lipase AYS
Candida rugosa
E07
Lipase AS
Aspergillus niger
E08
IMMOZYME CALA
Candida Antarctica
实施例1
酶筛选试验：0.32g(1mmol)氯霉素，0.11g(1.1mmol)琥珀酸酐，0.065g脂肪酶，5mL乙腈，室温下搅拌反应4h，反应方程式如图1所示，所用酶及对应转化率见下表2。
表2：所用酶及其转化率对应表。
Lipase
E01
E02
E03
E04
E05
E06
E07
E08
Conv.％
52％
38％
74％
25％
0
5％
12％
45％
实施例2
溶剂筛选试验：.32g(1mmol)氯霉素，0.11g(1.1mmol)琥珀酸酐，0.065g脂肪酶E03，5mL丙酮，室温下搅拌反应4h，反应方程式如图2所示，所用溶剂及对应转化率见下表3。
表3：所用溶剂及对应转化率表。
Solvent
CH<sub>3</sub>CN
toluene
acetone
THF
dioxane
MeOtBu
iPr<sub>2</sub>O
Conv.％
74％
15％
80％
51％
32％
60％％
67％％
实施例3
无水试验：0.32g(1mmol)氯霉素，0.11g(1.1mmol)琥珀酸酐，0.065g脂肪酶E03，干燥剂(溶剂质量的5％)和5mL丙酮，室温下搅拌反应4h，反应方程式如图3所示，所用干燥剂及对应转化率见下表4。
表4：所用干燥剂及对应转化率表。
desiccant
Silica gel
4A M.S.
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
MgSO<sub>4</sub>
CuSO<sub>4</sub>
Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>
Conv.％
85％
88％
80％
76％
70％
82％％
实施例4
温度试验：0.32g(1mmol)氯霉素，0.11g(1.1mmol)琥珀酸酐，0.065g脂肪酶E03，4A分子筛(溶剂质量的5％)和5mL丙酮，控温搅拌反应4h，反应方程式如图4所示，所用温度及对应转化率见下表5。
表5：所用温度及对应转化率表。
Temp.
30℃
35℃
40℃
45℃
50℃
Conv.％
88％
90％
93％
94％
85％
实施例5
酶加入量试验：0.32g(1mmol)氯霉素，0.11g(1.1mmol)琥珀酸酐，加入不同量的脂肪酶E03，4A分子筛(溶剂质量的5％)和5mL丙酮，40℃反应8h，反应方程式如图5所示，所用酶的量及对应转化率见下表6。
表6：所用酶量及对应转化率表。
实施例6
小试试验：3.23g(10mmol)氯霉素，1.1g(11mmol)琥珀酸酐，0.48g脂肪酶E03，15粒4A分子筛和50mL丙酮，40℃搅拌反应8h，过滤，滤液加0.2g活性碳，加热搅拌10min，过滤，滤液减压除去溶剂，得白色固体产物。粗产品在室温下加5mL甲醇溶解，边搅拌边缓慢加入5mL纯净水，然后缓慢降温至4℃，恒温静置6h，析出白色针状晶体，过滤，所得晶体50℃真空干燥2小时，得琥珀酸氯霉素纯品3.1g，产率73％，纯度>99％。
实施例7
本实施例提供一种酶催化合成琥珀酸氯霉素工艺技术，包括如下过程：
(1)反应过程：32.3g(100mmol)氯霉素，11g(110mmol)琥珀酸酐，4.8g脂肪酶，150粒4A分子筛和500mL丙酮，40℃搅拌反应12h，过滤，滤液中加2g活性碳，加热搅拌10min脱色，过滤，滤液减压除去溶剂，得白色固体产物。
(2)精制过程：粗产品在室温下加50mL甲醇溶解，边搅拌边缓慢加入50mL纯净水，然后缓慢降温至4℃，恒温静置8h，析出白色针状晶体，过滤，所得晶体50℃真空干燥2小时，得琥珀酸氯霉素纯品34.2g，产率79％，纯度>99％。
对采用本发明所述方法制备的琥珀酸氯霉素进行色谱分析，结果如图6所示，由图6可知，所述琥珀酸氯霉素纯品的纯度较高。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
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