一种复合材料、其制备方法和在治疗泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染中的应用
阅读说明：本技术 一种复合材料、其制备方法和在治疗泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染中的应用 (Composite material, preparation method thereof and application of composite material in treatment of deep tissue infection caused by pan-drug-resistant acinetobacter baumannii ) 是由 陈卓 刘雯珍 宋晓荣 陈学元 张宇翔 于 2020-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种复合材料、其制备方法和在治疗泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染中的应用。所述复合材料包括稀土掺杂的上转换纳米颗粒、修饰剂和光敏剂,结合了稀土掺杂的上转换纳米颗粒与光动力抗菌化学疗法的优势,弥补了传统光敏剂激发波长在可见光范围而造成的组织穿透性差的缺陷,可有效地治疗深部组织内的细菌或真菌感染,特别是泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的感染。(The invention provides a composite material, a preparation method thereof and application thereof in treating deep tissue infection caused by pan-drug-resistant acinetobacter baumannii. The composite material comprises rare earth-doped up-conversion nanoparticles, a modifier and a photosensitizer, combines the advantages of the rare earth-doped up-conversion nanoparticles and photodynamic antibacterial chemotherapy, makes up the defect of poor tissue penetrability caused by the fact that the excitation wavelength of the traditional photosensitizer is in the visible light range, and can effectively treat bacterial or fungal infection in deep tissues, particularly infection caused by pan-drug-resistant acinetobacter baumannii.)
技术领域
本发明属于上转换纳米颗粒
技术领域
，特别涉及一种复合材料、其制备方法和在治疗泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染中的应用。背景技术
鲍曼不动杆菌是医院感染的重要病原菌，主要危害重症患者，可引起呼吸道感染、败血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎等。近年来，鲍曼不动杆菌引起的感染日益增多，由于其在染色体上存在天生耐药基因并且具有很强的从外界吸收耐药基因的能力，因此，鲍曼不动杆菌耐药性的发展速度十分之快，已经出现了广泛性耐药的鲍曼不动杆菌。因此，迫切地需要研制出新的抗菌剂或抗菌方法来对抗这种细菌引起的感染。
光动力抗菌化学疗法的发展让我们看到了新的希望。光动力抗菌的基本原理是：光敏剂在接收特定波长的光激发后与附近的氧气发生反应产生活性氧，进而破坏细菌的基本结构，导致细菌死亡。但是，目前所应用的光敏剂的激发波长大多在可见光范围内，可见光的波长较短，且生物体的一些组分如：黑色素、血红蛋白等对可见光有较高吸收和散射，导致可见光的组织穿透性较差。而鲍曼不动杆菌主要感染患有严重外伤、烧伤或经历过外科手术和介入治疗的患者，因此，鲍曼不动杆菌主要定植在感染宿主较深部的组织内。光敏剂激发光的组织穿透力差限制了光敏剂在泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染中的应用。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本发明提供一种稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料、其制备方法和在治疗细菌或真菌感染，例如鲍曼不动杆菌特别是泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染中的应用。稀土掺杂的上转换纳米颗粒(up-conversionnanoparticles,UCNPs)由于其独特的发光特性在生物医学研究中被广泛使用，稀土掺杂的上转换纳米颗粒能够在能量较低的长波辐射光的激发下发射出能量较高的短波辐射光。因此，基于所述稀土掺杂的上转换纳米颗粒和光敏剂的复合材料兼具上转换功能和光动力作用，可以很好地解决传统光动力抗菌疗法中激发光的组织穿透性差的问题，可有效地治疗细菌或真菌感染，例如泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染。所述复合材料在近红外光的激发下可以将980nm波长的光转换成668nm波长和550nm波长的光，而550nm波长的光可以激活光敏剂孟加拉玫瑰红(rose bengal,RB)产生大量的活性氧(ROS)，或者668nm波长的光可以激活光敏剂酞菁产生大量的活性氧，达到杀死目标细菌或真菌的目的。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
一种复合材料，其包括稀土掺杂的上转换纳米颗粒、修饰剂和光敏剂，所述稀土掺杂的上转换纳米颗粒表面通过配位作用连接修饰剂，所述光敏剂通过静电相互作用吸附到连接有修饰剂的稀土掺杂的上转换纳米颗粒表面。
根据本发明，所述复合材料具有核壳结构，所述核包括稀土掺杂的上转换纳米颗粒，所述壳包括修饰剂和光敏剂，所述壳包覆在所述核外表面。
根据本发明，所述稀土掺杂的上转换纳米颗粒为实心结构。
根据本发明，所述光敏剂通过其表面的负电荷与稀土掺杂的上转换纳米颗粒表面的正电荷之间的静电相互作用而被吸附到连接有修饰剂的稀土掺杂的上转换纳米颗粒表面。光敏剂可以位于修饰剂层内，也可以位于修饰剂层外表面，或者两者兼有。
根据本发明，所述修饰剂的引入可以增加稀土掺杂的上转换纳米颗粒的水溶性和生物相容性。
根据本发明，所述稀土掺杂的上转换纳米颗粒的化学式为AREF4:Yb,Er；其中，A为碱金属元素，选自锂(Li)、钠(Na)和钾(K)中的一种；RE为稀土元素，选自钇(Y)、钪(Sc)、镧(La)、钆(Gd)和镥(Lu)中的一种。例如，A为Na或Li，RE为Y和Gd中的一种。示例性地，所述稀土掺杂的上转换纳米颗粒的化学式为LiYF4:Yb,Er。
其中，在所述稀土掺杂的上转换纳米颗粒中，AREF4为基质，镱离子(Yb3+)为敏化剂，铒离子(Er3+)为激活剂。
根据本发明，所述稀土掺杂的上转换纳米颗粒的粒径可以为10-100nm，例如15-80nm，20-60nm。
根据本发明，所述修饰剂可以选自高分子聚合物型有机配体，例如选自聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚乙二醇等中的一种、两种或更多种。
根据本发明，所述复合材料中修饰剂的用量没有特别的限定，可依据对稀土掺杂的上转换纳米颗粒的水溶性和/或生物相容性的需求而调整。
根据本发明，所述光敏剂是能够吸收稀土掺杂的上转换纳米颗粒在近红外光照射下发出的可见光而产生单线态氧的光敏剂。优选地，选自酞菁或者孟加拉玫瑰红，其中，所述酞菁可以在668nm波长的激发光下被激发，所述孟加拉玫瑰红可以在550nm波长的激发光下被激发。
根据本发明，所述复合材料中光敏剂的负载率为0.1-5wt％(即重量百分比)，例如0.3-4wt％，0.5-3wt％，0.7-2wt％，例如，0.8wt％、1.0wt％、1.2wt％、1.4wt％、1.6wt％或1.8wt％。所述光敏剂的负载率是指光敏剂在所述复合材料中的重量百分比，其可以通过一定波长下的吸光值计算而得到，或者通过紫外可见吸收谱计算而得，例如测试550nm波长下的吸光值，可以测试得到孟加拉玫瑰红的负载率，还例如测试668nm波长下的吸光值，可以测试得到酞菁的负载率。
根据本发明，所述复合材料中的稀土掺杂的上转换纳米颗粒与光敏剂之间的能量传递主要时通过荧光共振能量转移的方式，传递效率为31.11％。以下面实施例1中制备的复合材料UCNPs-PVP-RB为例，从荧光寿命的变化计算得到，计算公式为η＝1-τ1/τ0，其中τ1、τ0分别为UCNPs-PVP-RB和UCNPs中Er离子4S3/2能级的荧光寿命。
根据本发明，所述复合材料的粒径可以为10-150nm，例如15-120nm，20-100nm，20-80nm，20-60nm。
根据本发明，所述复合材料的ζ-电势大小可以为-10-50mV，例如10-30mV，15-25mV，如23.1mV。
根据本发明，所述复合材料可以在近红外光的激发下将980nm波长的光转换成550nm波长的光，这是由Er离子的4S3/2→4I15/2之间的能级跃迁产生的，与RB在550nm波长处吸收刚好匹配。因此，在980nm的光照下，稀土掺杂的上转换纳米颗粒将550nm波长的光传递给RB，而被激活的RB进一步与周围的氧气发生反应产生了大量的活性氧(ROS)，进而快速地氧化蛋白质、核酸等生物分子从而有效地杀死目标细菌。
同理，所述复合材料可以在近红外光的激发下将980nm波长的光转换成668nm波长的光，这是由Er离子的4F9/2→4I15/2之间的能级跃迁产生的，与酞菁在668nm波长处吸收刚好匹配。因此，在980nm的光照下，稀土掺杂的上转换纳米颗粒将668nm波长的光传递给酞菁，而被激活的酞菁进一步与周围的氧气发生反应产生了大量的活性氧(ROS)，进而快速地氧化蛋白质、核酸等生物分子从而有效地杀死目标细菌。
本发明还提供上述复合材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒与修饰剂混合，通过配位作用得到表面修饰有修饰剂的稀土掺杂的上转换纳米颗粒；
(2)将步骤(1)的表面修饰有修饰剂的稀土掺杂的上转换纳米颗粒与光敏剂混合，通过静电作用得到所述复合材料。
根据本发明，步骤(1)中，所述水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒可根据本领域已知的方法制备，或者可以通过如下方法制备得到：
将油溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒进行酸洗，去除油溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒表面包覆的油酸和油胺。
其中，所述油溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒可根据本领域已知的方法制备，例如可以是通过高温热分解法制备得到的。
其中，所述的酸洗例如可以是用无机酸如盐酸、磷酸、硝酸、硫酸进行酸洗。
其中，所述的酸洗例如是在醇溶剂中进行的，例如将油溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒分散在乙醇溶液中，随后加入盐酸进行酸洗。
其中，所述酸洗之后还可包括水洗，例如可以用去离子水对酸洗之后的稀土掺杂的上转换纳米颗粒进行水洗，得到水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒。
根据本发明，步骤(1)中，所述混合可在室温下进行，混合时间可为4-12小时，例如为5-8小时，如6小时。
根据本发明，步骤(1)中，所述混合可以在水溶液中进行，例如将水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒、修饰剂和水混合。
根据本发明，步骤(1)中，所述水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒和修饰剂的重量比可以为1:(5-20)，例如为1:(8-15)，如1:10。
根据本发明，步骤(1)中，所述混合可以例如在搅拌条件下进行，所述搅拌可以是例如用磁力搅拌器进行。
根据本发明，步骤(1)中，所述的修饰剂为高分子聚合物型有机配体，例如选自聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚丙烯酸、聚乙二醇中的一种、两种或更多种。
根据本发明，步骤(1)中，所述混合结束后还可包括分离、水洗步骤。
根据本发明，步骤(2)中，所述混合可在室温下进行，混合时间可为4-12小时，例如为5-8小时，如6小时。
根据本发明，步骤(2)中，所述混合可以在水溶液中进行，例如将表面修饰有修饰剂的稀土掺杂的上转换纳米颗粒、光敏剂和水混合。
根据本发明，步骤(2)中，所述表面修饰有修饰剂的稀土掺杂的上转换纳米颗粒和光敏剂的重量比可以为(5-15):1，例如为(8-12):1，如10:1。
根据本发明，步骤(2)中，所述混合可在例如搅拌条件下进行，所述搅拌可以是例如用磁力搅拌器进行。
根据本发明，步骤(2)中，所述的光敏剂可以为孟加拉玫瑰红和/或酞菁。
根据本发明，步骤(2)中，所述混合结束后还可包括分离、水洗步骤。
本发明还提供上述复合材料的用途，其用于制备治疗细菌或真菌感染的治疗剂，例如制备治疗鲍曼不动杆菌特别是泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染的治疗剂。
本发明还提供一种治疗人或动物的细菌或真菌感染的方法，包括将治疗有效量的上述复合材料给予需要所述治疗的人或动物。优选地，所述细菌或真菌感染是由鲍曼不动杆菌引起的感染，特别是由泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种基于稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料、其制备方法和在治疗细菌或真菌感染，特别是泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染中的应用。本发明结合了稀土掺杂的上转换纳米颗粒与光动力抗菌化学疗法的优势，光动力抗菌化学疗法可以轻而易举的杀死耐药性细菌，且光动力作用后的细菌在传达培养10代后，细菌仍然没有对光动力作用产生耐药性。这为治疗耐药菌引起的感染带来了新的希望。且引入的稀土掺杂的上转换纳米颗粒弥补了传统光敏剂激发波长在可见光范围而造成的组织穿透性差的缺陷。因此，这种复合材料可以有效地治疗深部组织内细菌或真菌感染，特别是泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的感染。
附图说明
图1为本发明的复合材料UCNPs-PVP-RB的制备过程和抗菌原理示意图。
图2为实施例1的稀土掺杂的上转换纳米颗粒UCNPs——LiYF4:Yb,Er的透射电镜图，其中(a)是低分辨率下的UCNPs透射电镜图，(b)是高分辨率下的UCNPs透射电镜图。
图3为实施例1中的UCNPs、UCNPs-PVP和UCNPs-PVP-RB的上转换发光谱图(左侧纵坐标为980nm激光激发下的荧光相对强度)以及RB的吸收谱图(右侧纵坐标为吸光度)，其中“RB”指单纯的光敏剂孟加拉玫瑰红，“UCNPs”指水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒LiYF4:Yb,Er，“UCNPs-PVP”指表面修饰了PVP的稀土掺杂的上转换纳米颗粒，“UCNPs-PVP-RB”指稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料。
图4为实施例1的UCNPs-PVP-RB的ROS产量图，其中，“DCFH-DA”指未作处理的只包含了DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)的水溶液，“DCFH-DA+980nm”指经过980nm波长的光照的DCFH-DA水溶液，“DCFH-DA+UCNPs-PVP-RB”指包含了DCFH-DA和UCNPs-PVP-RB的水溶液，“DCFH-DA+UCNPs-PVP-RB+980nm”指经过980nm波长的光照的DCFH-DA和UCNPs-PVP-RB的混合水溶液。
图5为实施例2中所描述的UCNPs-PVP-RB对泛耐药性鲍曼不动杆菌的体外抗菌效果图，图5中的(a)为不同浓度UCNPs-PVP-RB下的体外抗菌效果图，其中，“UCNPs-PVP-RB”指未采用激发光激发的稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料，“UCNPs-PVP-RB+980nm”指采用980nm波长的光激发的稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料；图5中(b)为比较用猪肉组织有否阻挡激发光情况下的UCNPs-PVP-RB的体外抗菌效果图，其中“对照”是指没有猪肉阻挡、没有稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料下，单纯用980nm波长或者550nm波长的光照射，“550nm”是指用550nm波长的光激发稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料，“980nm”是指用980nm波长的光激发稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料。
图6为实施例2中所描述的UCNPs-PVP-RB对泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的小鼠局部伤口感染的治疗效果图，其中，“对照组”是指未做治疗的小鼠，“UCNPs-PVP-RB+550nm”指利用550nm波长的光激发稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料治疗的小鼠，“UCNPs-PVP-RB+980nm”指利用980nm波长的光激发稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料治疗的小鼠，“UCNPs-PVP-RB+550nm+猪肉组织”指在猪肉组织阻挡激发光的情况下，利用550nm波长的光激发稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料治疗的小鼠。“UCNPs-PVP-RB+980nm+猪肉组织”指在猪肉组织阻挡激发光的情况下，利用980nm波长的光激发稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料治疗的小鼠。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的制备方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料UCNPs-PVP-RB的制备第一步：稀土掺杂的上转换纳米颗粒LiYF4:Yb,Er的制备
(1)称取0.78mmol Y(CF3COO)3·4H2O、0.2mmol Yb(CF3COO)3·4H2O、0.02mmol Er(CF3COO)3·4H2O、1mmol CF3COOLi·H2O于50mL三口烧瓶中，同时加入8mL油酸和6mL油胺混合均匀；
(2)将装有混合液的双口烧瓶连通氮气后置于加热套中，调节电压升温至120℃搅拌至澄清溶液，保持此温度半小时以便充分排除装置内的水分和氧气；
(3)然后迅速将上述澄清溶液快速地升温到325℃，并保持该温度反应1.5小时；
(4)反应结束后在保持氮气连通的情况下撤走加热装置，使反应体系快速降温至室温，在反应体系中加入无水乙醇至澄清溶液变浑浊，将上述溶液分装至EP管中12000rpm离心5min，倒掉上清液，加入环己烷重悬，再次加入无水乙醇，12000rpm离心5min，得到的沉淀物即为油溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒LiYF4:Yb,Er，可溶解于环己烷中在-20℃冰箱中长期保存。
第二步：复合材料UCNPs-PVP-RB的制备
(1)利用酸洗法去除油溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒LiYF4:Yb,Er表面的油酸和油胺，制备水溶性的稀土掺杂的上转换的纳米颗粒LiYF4:Yb,Er。具体步骤如下：将20mg的油酸包裹的纳米颗粒LiYF4:Yb,Er分散在2mL、pH＝1的无水乙醇溶液中(在5mL的无水乙醇中加入40μL的盐酸即得到pH＝1的无水乙醇溶液)超声20min，13000转离心5min后又重悬在pH＝1的无水乙醇溶液中继续超声20min。13000转离心得到的沉淀再分别用pH＝4和pH＝7的无水乙醇溶液按上述方式清洗两遍，最后将离心得到的沉淀物用纯水清洗两遍以上，去除上述步骤残留下来的无水乙醇，最后离心得到的沉淀物则为水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒UCNPs——LiYF4:Yb,Er。
(2)将上述水溶性的稀土掺杂的上转换纳米颗粒UCNPs——LiYF4:Yb,Er加入到2mL含有100mg PVP的水溶液中，并将混合后的溶液置于磁力搅拌器上室温下持续搅拌6h，13000转离心后得到的沉淀物用纯水清洗3遍后分散在纯水中。通过上述步骤即可得到表面修饰了PVP的稀土掺杂的上转换纳米颗粒UCNPs-PVP。
(3)在溶于水中的UCNPs-PVP溶液中加入1mg孟加拉玫瑰红并置于室温下避光持续搅拌6h，13000转离心后得到的沉淀用纯水清洗3遍后分散在纯水中。通过上述步骤即可得到稀土掺杂的上转换纳米颗粒光敏剂复合材料UCNPs-PVP-RB，其中RB的负载率为1.8wt％。
实施例2：UCNPs-PVP-RB用于泛耐药性鲍曼不动杆菌的抗菌研究
体外实验：从-80℃的冰箱中取出2μL保存在甘油中的泛耐药性鲍曼不动杆菌加入到2mL的LB(Luria-Bertani)培养基中培养12h，从上述菌液中吸取2μL重新加入到2mL的LB培养基中培养4h，直到细菌生长到对数期(约108CFU/mL)。将上述菌液稀释到106后加入不同浓度的实施例1的UCNPs-PVP-RB避光孵育10min，用980nm的激光照射上述混合溶液后吸取100μL涂于固体琼脂板上并置于37℃培养箱中培养过夜。最后通过平板计数法考察UCNPs-PVP-RB对于泛耐药性鲍曼不动杆菌的体外抗菌作用。结果显示，在浓度达到50μg/mL时，其抗菌效果可达到4.7log10。此外，利用5mm的猪肉组织阻挡980nm的激光来考察UCNPs-PVP-RB对深部组织的泛耐药性鲍曼不动杆菌的抗菌能力，结果显示，在猪肉组织的遮挡下，980nm激光仍然可以激发纳米材料产生光动力抗菌作用。
动物实验：采取小鼠局部伤口组织感染模型来评估实施例1的复合材料UCNPs-PVP-RB对泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染的治疗效果。首先，在小鼠背部切除一块1cm×1cm的皮肤组织，吸取20μL浓度为108CFU/mL的菌液孵育在小鼠背部伤口位置10min。接着，吸取20μL浓度为1mg/mL的复合材料孵育在小鼠伤口位置，10min后将小鼠伤口部位(覆盖5mm猪肉组织)固定在980nm激光下照射10min。最后将小鼠正常饲养并每日观察小鼠伤口愈合情况。同时设立空白对照组(生理盐水替代复合材料)、UCNPs-PVP-RB+980nm组、UCNPs-PVP-RB+550nm组和UCNPs-PVP-RB+550nm+猪肉组织组。结果显示，在存在猪肉组织的情况下，980nm激光仍然可以激活RB产生光动力作用，杀死伤口上的细菌，促进伤口愈合。证明在980nm的激发下UCNPs-PVP-RB可以有效地治疗泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的深部组织感染。
图2为本发明实施例1的稀土掺杂的上转换纳米颗粒LiYF4:Yb,Er的透射电镜图。从图2中可以看出，合成了的LiYF4:Yb,Er为四方相，大小为50±5nm×35±5nm，且纳米颗粒呈单分散、形貌大小均一。高分辨透射电镜图片展示出明显的(101面)晶格条纹，证明合成的纳米颗粒晶化程度较好，晶格之间的距离大约为0.41nm。
图3为本发明实施例1的UCNPs、UCNPs-PVP和UCNPs-PVP-RB的上转换发光谱图。从图3中可以看出，在980nm激光的照射下，纳米颗粒UCNPs在550nm和668nm附近有较强的发光，这是由Er离子的4S3/2→4I15/2和2F9/2→4I15/2之间的能级跃迁产生的。PVP层的修饰并没有对纳米材料的上转换发光产生影响，而装载上RB上之后可以看到与668nm处的发光相比，550nm处的发光明显减弱，这说明纳米材料与RB之间发生了能量传递，这是因为Er离子4S3/2→4I15/2处的发光与RB在550nm处吸收刚好匹配，这是发生能量传递的基础。
图4为本发明实施例1的UCNPs-PVP-RB的ROS产量图。其中纵坐标表示DCF位于520nm处的荧光值，利用DCF的荧光可以检测活性氧的生成水平。DCFH-DA本身没有荧光，可以被水解生成DCFH。而无荧光的DCFH可以被活性氧氧化生成有荧光的DCF。从图4中可以看出，加入UCNPs-PVP-RB后，随着照射时间的延长，位于520nm处的荧光值不断上升。在照射10min后，与单纯光照组(DCFH-DA+980nm)、单纯加药组(DCFH-DA+UCNPs-PVP-RB)以及对照组(DCFH-DA)相比，加药光照组(DCFH-DA+UCNPs-PVP-RB+980nm)在520nm处的荧光值增加了6.7倍(9374/1215-1＝6.7)。表明了在980nm的光照下，UCNPs将980nm的光传递给了RB，而被激活的RB进一步与周围的氧气发生反应产生了大量的ROS。
图5为本发明实施例2的UCNPs-PVP-RB对泛耐药性鲍曼不动杆菌的体外抗菌效果图。从图5中的(a)可以看出，在980nm的光照下，随着UCNPs-PVP-RB的浓度不断增加，细菌的存活数不断下降，在达到50μg/mL时，UCNPs-PVP-RB的杀菌效果达到4.72log10，而单纯的光照和UCNPs-PVP-RB并未对细菌的存活数产生影响。说明在980nm的光照下，UCNPs-PVP-RB可以产生大量的ROS杀死目标细菌。从图5中的(b)可以看到，在没有猪肉组织(即猪肉组织厚度为0mm的情况)阻挡激发光的情况下，550nm和980nm的光都可以激活UCNPs-PVP-RB产生ROS杀死细菌，而在有猪肉组织(即猪肉组织厚度为5mm的情况)阻挡激发光的情况下，550nm的光不能穿透猪肉组织激活UCNPs-PVP-RB产生光动力作用，而980nm的光可以穿透猪肉组织继续激活UCNPs-PVP-RB产生光动力作用。同时，对照组表明单纯的550nm波长或980nm波长的激光照射不会产生抗菌作用。说明UNCPs-PVP-RB在980nm的光激发下可以杀死深部组织的泛耐药性鲍曼不动杆菌。
图6为本发明实施例1的UCNPs-PVP-RB对泛耐药性鲍曼不动杆菌引起的小鼠局部伤口感染的治疗效果图。
从图6中可以看出，“UCNPs-PVP-RB+550nm+猪肉组织”组的小鼠伤口愈合速度与对照组相比没有明显的差异，而“UCNPs-PVP-RB+980nm”组、“UCNPs-PVP-RB+550nm”组和“UCNPs-PVP-RB+550nm+猪肉组织”组的小鼠伤口愈合速度与对照组相比有明显增快的趋势，说明即使在猪肉组织阻挡的情况下，980nm的光仍然可以激活UCNPs-PVP-RB产生光动力作用，杀死深部组织的泛耐药性鲍曼不动杆菌，从而促进小鼠伤口的愈合。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。