具体实施方式

本披露至少部分地基于包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列的腺病毒载体的鉴定，该核苷酸序列与包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒(CMV)启动子的核苷酸序列可操作地连接，从而允许经济高效地大规模制造包含寨卡病毒M和Env抗原的腺病毒颗粒。不受理论的限制，据信寨卡病毒M和Env抗原的表达导致低水平的腺病毒颗粒产生。在CMV启动子上添加TetO基序允许更高水平的腺病毒颗粒产生。

在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献各自通过援引以其全文并入本文。包括在本说明书中的对文件、法案、材料、装置、制品等的讨论用于提供本发明的背景的目的。这种讨论不承认任何或所有这些事项形成关于所披露或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。

除非另外定义，否则本文所用的所有科学和技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文所用的某些术语具有说明书中阐述的含义。

必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种”和“该”包括复数指示物。

除非另有说明，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围，应被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，数值典型地包括列举值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，数值范围的使用明确地包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括值的这些范围内的整数和分数，除非上下文另有明确指示。

除非另外指明，否则在一系列要素前面的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个要素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验便确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等同方案。这些等同方案也旨在包括在本发明中。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其他变化，将被理解为意味着包括所述整数或整数组，而不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放性的。例如，包含元件的清单的组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备不一定限制于仅那些元件，而可以包括不是此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或设备明确列出的或固有的其他元件。此外，除非明确地说明是相反的，否则“或”是指包括在内的或，而不是指排他性的或。例如，以下项中的任一者满足条件A或B：A是真(或存在)并且B是假(或不存在)，A是假(或不存在)并且B是真(或存在)，以及A和B二者都是真(或存在)。

如本文所用，多个引用的要素之间的连接术语“和/或”应被理解为涵盖单独的和组合的选项两者。例如，当两种要素由和/或连接时，第一选项是指在不具有第二要素的情况下第一要素的应用。第二选项是指在不具有第一要素的情况下第二要素的应用。第三选项是指第一要素和第二要素一起的应用。这些选项中的任一个应被理解为属于该含义之内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。这些选项中的多于一个的同时应用也应被理解为属于该含义之内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

如本文所用，贯穿说明书和权利要求书所用的术语“由……组成”或变型指示包括任何列举的整数或整数组，而且没有另外的整数或整数组可以添加至指定方法、结构、或组合物。

如本文所用，贯穿说明书和权利要求书所用的术语“基本上由……组成”或变型指示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不实质性改变所指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。

如本文所用，“受试者”或“患者”意指将要或已经对其施用了包含本发明的腺病毒载体/腺病毒颗粒的药物组合物和/或疫苗的任何动物，优选为哺乳动物，最优选为人。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更优选地是人。

如本文所用，“提供安全施用的方法”意指当施用给受试者时，有效产生针对寨卡病毒的免疫应答而不会引起不可接受的不良事件的施用方法。

如本文所用，短语“不可接受的不良事件”和“不可接受的不良反应”应意指与施用药物组合物或治疗剂相关或由施用药物组合物或治疗剂引起的所有有害或不希望的结果，并且这些有害或不希望的结果达到如此严重的程度，以致于监管机构认为该药物组合物或治疗剂不可接受用于建议用途。当在施用包含编码寨卡病毒抗原的核酸分子的腺病毒颗粒的情况下使用时，不可接受的不良事件或反应的实例可包括但不限于肿胀、注射侧疼痛、头痛、不适、肌肉酸痛、恶心和发烧。

在某些实施例中，当就包含编码寨卡病毒抗原的核酸分子的腺病毒载体的施用而使用时“安全治疗”和“安全施用”意指减少不良事件，包括但不限于肿胀、注射侧疼痛、头痛、不适、肌肉酸痛、恶心和发烧。

词语“右”、“左”、“下”和“上”表示所参考的附图中的方向。

应当理解的是，当提及优选的发明的组分的规格或特征时，本文使用的术语“约”、“大约”、“总体上”、“基本上”、以及类似术语，指示描述的规格/特征不具有严格的界限或参数，并且并不从其排除功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员将理解的那样。在最低程度上，包括数值参数的此类引用将包括使用本领域接受的数学的和产业的原理(例如化整误差、测量误差或其他系统误差、制造公差等)，不会改变最低有效位数的变化。

在两个或更多个核酸序列或多肽序列(例如，腺病毒载体、寨卡病毒M和Env多肽以及编码M和Env多肽的核苷酸序列、巨细胞病毒启动子核苷酸序列和四环素操纵子(TetO)序列)的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查所测量的，相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。

对于序列比较，典型地，一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。在使用序列比较算法时，把测试序列和参考序列输入计算机，如有必要，则指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后该序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

可以例如，通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过计算机执行这些算法(威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，575科学博士，威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))，或通过目视检查(总体上参见，CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学实验指南],F.M.Ausubel等人编辑，Current Protocols[实验指南]，格林出版联合公司(Greene Publishing Associates,Inc.)与约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)之间的合资企业，(1995增刊)奥苏贝尔(Ausubel))来进行用于比较的序列的最佳比对。

适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，这些算法分别在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402中有描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，这些序列对匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻近字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始的邻近字命中将作为种子，以用于启动搜索以发现包含它们的更长的HSP。然后，只要累积比对得分可以增加，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。

对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当存在以下情况时，停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其达到的最大值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用11的字长(W)、10的期望值(E)、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长(W)、10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。

除了计算百分比序列同一性之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性，如下所述。因此，例如，如果某多肽和第二多肽仅因保守取代而不同，则两种肽通常基本上相同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下彼此杂交。

如本文所用，术语“免疫应答”或“保护性免疫应答”意指接种疫苗的受试者能够控制对其进行了疫苗接种的致病因子(例如，ZIKV M和Env抗原)的感染(例如，寨卡病毒(ZIKV)感染)。致病因子可以是例如抗原基因产物或抗原蛋白，或其片段。通常，已经发展了“免疫应答”或“保护性免疫应答”的受试者仅发展轻度至中度临床症状或根本没有症状。通常，已经产生针对寨卡病毒的“免疫应答”或“保护性免疫应答”的受试者将不会发展疾病表现或那些疾病表现会较轻，并且最终该受试者不会因感染所述病毒而死亡。另外，已经产生针对寨卡病毒的“免疫应答”或“保护性免疫应答”的受试者，在她的子宫内暴露于病毒的婴儿中，脑部异常的机会将降低。

“产生免疫应答”或“促进免疫应答”或“引起免疫应答”意指在已经向其施用了药物组合物(例如，免疫原性组合物或疫苗)的受试者中引发针对例如一种或多种感染因子(例如，病毒(例如，ZIKV))或蛋白质靶标的体液应答(例如，抗体的产生)或细胞应答(例如，T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和/或自然杀伤细胞的活化)。

“免疫原”或“抗原”意指在施用后可在受试者中诱导免疫应答的任何多肽。在一些实施例中，免疫原或抗原由可掺入例如本发明的腺病毒载体中，以用于随后表达免疫原或抗原(例如，目标基因产物或其片段(例如，多肽))的核酸分子编码。在一些实施例中，抗原源自ZIKV(例如，来自亚洲和/或非洲谱系的ZIKV(例如，ZIKV毒株BeH815744(登录号KU365780))。在一些实施例中，在表达源自ZIKV的多肽(例如，来自亚洲和/或非洲谱系的ZIKV(例如，ZIKV毒株BeH815744(登录号KU365780))的ZIKV M和Env抗原)的核酸分子的背景下施用抗原。

如本文所用的术语“免疫原性组合物”或“药物组合物”定义为用于产生免疫应答的材料，并且可以在将免疫原性组合物施用于受试者后赋予免疫力。

“分离的”意指从其天然环境的组分中分开的、回收的或纯化的。例如，本发明的核酸分子或多肽可以从其自然环境的组分中分离1％(2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或更多。

本发明的腺病毒、核酸分子和多肽

在标题为“Compositions and Methods for Preventing and Treating ZikaVirus Infection[用于预防和治疗寨卡病毒感染的组合物和方法]”的WO 2017/214596中，披露了寨卡病毒(ZIKV)多肽，当施用于感染了ZIKV或可能暴露于ZIKV感染的受试者(例如，小鼠或猴子)时，其可用于引发针对ZIKV感染的保护性免疫应答。在制备用于施用的药物组合物中使用的ZIKV多肽可包括M-Env、prM-Env、prM-Env.dTM、prM-Env.dStem、Env、Env.dTM和/或Env.dStem或其一部分。替代性地，ZIKV多肽可由载体(例如，腺病毒载体)内包含的核酸分子编码。

本文提供了包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列的腺病毒载体。编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列可以例如与包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒(CMV)启动子可操作地连接。在某些实施例中，CMV启动子包含一个、两个、三个、四个或五个TetO基序。CMV启动子可以例如选自由下表1中提供的SEQ ID NO:3-5组成的组。

表1：可用于控制腺病毒载体中的寨卡病毒M和Env抗原的表达的含TetO的CMV启动子。

在某些实施例中，寨卡病毒M和Env抗原包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列包含SEQ ID NO:2。

核酸分子的核苷酸序列与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中任一个的全部或部分具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。替代性地，分离的核酸分子具有编码ZIKV M和Env抗原的核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1的全部或部分具有至少85％(例如，至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性。

本发明的核酸分子可以进一步优化，诸如通过密码子优化，以在靶向的哺乳动物受试者(例如，人)中表达。

核酸分子也可以插入表达载体，诸如腺病毒载体中，并掺入本发明的组合物中。术语“腺病毒载体(adenovirus vector)”和“腺病毒载体(adenoviral vector)”和“腺病毒颗粒”可互换使用，是指经基因工程改造的腺病毒，其设计为将目标多核苷酸(例如，编码ZIKVM和Env抗原的多核苷酸)插入真核细胞中，使得该多核苷酸随后表达。可用作本发明的病毒载体的腺病毒的实例包括具有或衍生自血清型Ad2、Ad 4、Ad5、Ad11、Ad12、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad40、Ad48、Ad49、Ad50、Ad52(例如，RhAd52)和Pan9(也称为AdC68)的那些腺病毒；这些载体可以源自例如人、黑猩猩(例如，ChAd1、ChAd3、ChAd7、ChAd8、ChAd21、ChAd22、ChAd23、ChAd24、ChAd25、ChAd26、ChAd27.1、ChAd28.1、ChAd29、ChAd30、ChAd31.1、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35.1、ChAd36、ChAd37.2、ChAd39、ChAd40.1、ChAd41.1、ChAd42.1、ChAd43、ChAd44、ChAd45、ChAd46、ChAd48、ChAd49、ChAd49、ChAd50、ChAd67或SA7P)或恒河猴腺病毒(例如rhAd51、rhAd52或rhAd53)。

如本文中可互换使用的“核酸分子”或“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，则可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，例如通过与标记缀合。

“异源核酸分子”意指可以编码源自或获自病原生物(诸如病毒)的蛋白质，可以掺入本发明的多核苷酸或载体中的核苷酸序列。异源核酸还可以编码构建为诱导免疫的合成或人工蛋白质，诸如免疫原性表位。异源核酸分子的实例是编码一种或多种源自寨卡病毒的免疫原性肽或多肽(例如，ZIKV M和Env抗原)的核酸分子。异源核酸分子是通常不与在其中掺入该异源核酸分子的多核苷酸或载体中发现的其他核酸分子缔合的核酸分子。

“核酸疫苗”或“DNA疫苗”是指包括在启动子的控制下用于在受试者中表达的异源核酸分子的疫苗。可以将异源核酸分子掺入表达载体，诸如腺病毒载体中。

如本文所用，术语“疫苗”定义为用于引起免疫应答并且在疫苗施用于受试者后的一段时间内赋予免疫力的材料。

“启动子”是使得信使RNA中的基因序列的转录能够起始的核酸序列，此类转录是通过在启动子上或启动子附近的RNA聚合酶的结合而起始的。

如本文提供的，在某些实施例中，启动子是包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒启动子。TetO基序可以称为“调控序列”或“调控元件”，如本文所用，是指调节与之操作性连接的核酸的转录，并且因此充当转录调节因子的核酸区段，典型地是但不限于DNA。调控序列通常包含作为转录结合结构域的核酸序列，这些转录结合结构域被转录蛋白和/或转录因子、增强子或阻遏子等的核酸结合结构域识别。例如，可以将阻遏子序列与启动子可操作地偶联，该阻遏子序列可以被阻遏子蛋白结合，该阻遏子蛋白可以减少或阻止转基因在表达该阻遏子蛋白的生产细胞系中的表达。当传代时和/或当其在生产细胞系中大量产生时，这可以改进核酸分子的遗传稳定性和/或表达水平。本领域已经描述了此类系统。调控序列可以包括一个或多个四环素操纵子(TetO)基序/序列，使得在四环素阻遏子蛋白(TetR)存在下表达受到抑制。在不存在四环素的情况下，TetR蛋白能够与TetO位点结合并抑制与TetO基序/序列可操作地连接的转基因(例如，ZIKV M和Env抗原)的转录。然而，在四环素的存在下，TetR蛋白的构象变化阻止其结合至TetO序列，允许发生可操作地连接的转基因的转录。在某些实施例中，编码ZIKV M和Env抗原的核酸，当存在于腺病毒载体中时，与包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒(CMV)启动子可操作地连接，使得ZIKV M和Env抗原的表达在其中表达TetR蛋白的生产细胞系中产生的重组腺病毒中受到抑制。随后，在引入受试者或不表达TetR蛋白的细胞中的重组腺病毒载体中，表达不会受到抑制。

如本文所用，术语“阻遏子”是指具有抑制、干扰、阻滞和/或阻遏重组表达载体(例如，腺病毒载体)的异源蛋白质产物产生的能力的分子(例如，蛋白质)。阻遏子可以通过干扰在沿着表达载体的适当位置(诸如在表达盒中)的结合位点来抑制表达(例如，TetR可以结合CMV启动子中的TetO基序)。在载体繁殖期间阻遏载体转基因表达可以防止转基因的不稳定性并且可以在生产期间增加具有转基因的载体的产量。

当核酸与另一核酸序列处于结构或功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，一个DNA区段与另一个DNA区段可操作地连接，条件是它们相对于彼此位于同一连续DNA分子上并且具有结构或功能关系，诸如启动子或增强子相对于编码序列定位以便促进编码序列的转录；核糖体结合位点相对于编码序列定位以便促进翻译；或前序列或分泌前导序列相对于编码序列定位以便促进前蛋白(例如，参与编码的多肽的分泌的前蛋白)的表达。在其他实例中，可操作地连接的核酸序列不是连续的，而是以这样的方式定位，使得它们彼此具有作为核酸或由这些核酸表达的蛋白质的功能关系。例如，增强子不必是连续的。可以通过在方便的限制性位点连接或通过使用合成的寡核苷酸衔接子或接头来实现连接。

根据本发明的腺病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)，并且优选地是属于哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属的一种。它可以是人腺病毒，但也可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、猪腺病毒(例如PAdV3或PAdV5)、或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，诸如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，腺病毒是人腺病毒(HAdV或AdHu；在本发明中，如果提及腺病毒但是没有指示物种的情况下，即指人腺病毒，例如简短符号“Ad5”意指与HAdV5(人腺病毒血清型5)相同)或猿猴腺病毒(诸如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV))。

已使用人腺病毒进行大多数高级研究，并且根据本发明的某些方面，人腺病毒是优选的。在某些优选的实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于人腺病毒。在优选的实施例中，该重组腺病毒基于人腺病毒血清型4、5、11、26、34、35、48、49或50。根据本发明的特别优选的实施例，腺病毒是血清型26或35之一的人腺病毒。

这些血清型的优点是在人群中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴度。例如在WO 2007/104792中和在Abbink等人，(2007)Virol[病毒学]81(9):4654-63中描述了rAd26载体的制备，两者均通过援引以其全文并入本文。Ad26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。例如，在美国专利号7,270,811中，在WO 00/70071中以及在Vogels等人，(2003)，J Virol[病毒学杂志]77(15):8263-71中，描述了rAd35载体的制备，其全部通过援引以其全文并入本文。Ad35的示例性基因组序列发现于GenBank登录号AC_000019中和WO 00/70071的图6中。

猿猴腺病毒总体上也具有在人群体中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价，并且已经报道了大量使用黑猩猩腺病毒载体的工作(例如，US6083716；WO 2005/071093；WO 2010/086189；WO 2010085984；Farina等人，2001，J Virol[病毒学杂志]75:11603-13；Cohen等人，2002，J Gen Virol[普通病毒学杂志]83:151-55；Kobinger等人，2006，Virology[病毒学]346:394-401；Tatsis等人，2007，Molecular Therapy[分子治疗]15:608-17；还参见Bangari和Mittal,2006,Vaccine[疫苗]24:849-62的综述；以及Lasaro和Ertl,2009,Mol Ther[分子治疗]17:1333-39的综述)。因此，在其他优选的实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒基于猿猴腺病毒类型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P。

腺病毒载体rAd26

在根据本发明的一个优选的实施例中，腺病毒载体包含来自两种罕见血清型的衣壳蛋白：Ad26或Ad35。在典型实施例中，该载体是rAd26病毒。

本领域的技术人员将认识到源自多个血清型的元件可以被组合在单一的重组腺病毒载体中。因此，可以产生组合了来自不同血清型的所希望性质的嵌合腺病毒。因此，在一些实施例中，本发明的嵌合腺病毒可以将Ad26血清型的预先存在的免疫性的缺失与以下特征相结合：诸如温度稳定性、组装、锚定、产量、重定向或改善的感染、靶细胞中DNA的稳定性等。

在某些实施例中，本发明中有用的重组腺病毒载体主要或完全源自Ad26(即，该载体是rAd26)。在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷型的，例如，因为它包含基因组的E1区域中的缺失。对于源自Ad26的本发明的腺病毒，典型的是将腺病毒的E4-orf6编码序列与人类亚群C的腺病毒(诸如Ad5)的E4-orf6交换。这允许此类腺病毒在表达Ad5的E1基因的熟知的互补细胞系中繁殖，如例如HEK293细胞或细胞等(参见，例如Havenga等人，2006，J Gen Virol[普通病毒学杂志]87:2135-43；WO 03/104467)。在某些实施例中，腺病毒是血清型35的人腺病毒，其具有已经将编码抗原的核酸克隆到其中的E1区中的缺失，并具有Ad5的E4 orf6区。在某些实施例中，腺病毒是血清型26的人腺病毒，其具有已经将编码抗原的核酸克隆到其中的E1区中的缺失，并具有Ad5的E4 orf6区。对于Ad35腺病毒，典型的是将E1B 55K开放阅读框的3’末端保留在腺病毒中，例如pIX开放阅读框直接上游的166bp或包含这166bp的片段，诸如pIX起始密码子直接上游的243bp片段(在5'末端Bsu36I限制性位点标记)，因为pIX基因的启动子部分留在该区域，这增加了腺病毒的稳定性(参见，例如Havenga等人，2006，同上；WO 2004/001032)。重组腺病毒载体的制备在本领域中是熟知的。

例如在WO 2007/104792中和在Abbink等人，(2007)Virol[病毒学]81(9):4654-63中描述了rAd26载体的制备。Ad26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO:1中。例如，在美国专利号7,270,811中以及在Vogels等人，(2003)，J Virol[病毒学杂志]77(15):8263-71中，描述了rAd35载体的制备。Ad35的示例性基因组序列发现于GenBank登录号AC_000019中。

在本发明的一个实施例中，可用于本发明的载体包括WO 2012/082918中描述的那些载体，其披露内容通过援引以其全文并入本文。

典型地，使用核酸来产生本发明中有用的载体，该核酸包含整个重组腺病毒基因组(例如，质粒、粘粒、或杆状病毒载体)。因此，本发明还提供了分离的核酸分子，这些分离的核酸分子编码本发明的这些腺病毒载体。本发明的核酸分子可以呈RNA形式或呈通过克隆而获得或以合成方式而产生的DNA形式。DNA可以是双链的或单链的。

本发明中有用的这些腺病毒载体典型地是复制缺陷型的。在这些实施例中，通过使对病毒复制关键的区域(诸如E1区域)缺失或失活而致使病毒为复制缺陷型。这些区域可以通过例如插入目标基因(通常与启动子连接)而基本上缺失或失活。在一些实施例中，本发明的载体可以含有其他区域诸如E2、E3或E4区域中的缺失，或与启动子连接的异源基因的插入。对于E2-和/或E4-突变的腺病毒，通常使用E2-和/或E4互补细胞系来产生重组腺病毒。该腺病毒的E3区域中的突变不需要被细胞系补充，因为E3不是复制需要的。

典型地使用包装细胞系来生产足够量的本发明的腺病毒载体。包装细胞是包含在复制缺陷型载体中缺失或失活的那些基因的细胞，因此允许该病毒在该细胞中复制。合适的细胞系包括，例如，911、293和E1 A549。

在某些实施例中，包装细胞系或宿主细胞系进一步包含编码四环素阻遏子(TetR)蛋白的核苷酸序列。编码TetR蛋白的核苷酸序列可以例如整合在包装细胞系或宿主细胞系的基因组中。举例来说，编码TetR蛋白的核苷酸序列可以整合在1号染色体中。包装细胞系/宿主细胞系可以是例如包装细胞系/宿主细胞系。

在某些实施例中，本文提供了产生包含寨卡病毒M和Env抗原的腺病毒颗粒的方法。这些方法包括(a)使本发明的宿主细胞与本发明的腺病毒载体接触，并且(b)使宿主细胞在产生包含寨卡M和Env抗原的腺病毒颗粒的条件下生长。

在某些实施例中，腺病毒载体包含转基因。“转基因”是指异源核酸，是并非天然存在于载体中的核酸，并且根据本发明，转基因可编码在受试者中引发免疫应答的抗原性基因产物或抗原性蛋白(例如，ZIKV M和Env抗原)。转基因可以例如通过标准分子生物学技术引入载体中。例如，可将转基因克隆到腺病毒载体的缺失的E1或E3区域中，或E4区域与rITR之间的区域中。通常，转基因可操作地连接至表达控制序列。在优选的实施例中，转基因插入转基因插入位点。

药物组合物

在另一个总体方面，本发明涉及药物组合物，这些药物组合物包含本发明的腺病毒载体(或腺病毒颗粒)(即，包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核酸分子的腺病毒载体或腺病毒颗粒)和药学上可接受的载剂。本发明的腺病毒载体(或颗粒)和包含它们的组合物也可用于制造用于本文提及的治疗应用的药物。

“药物组合物”意指含有治疗或生物活性剂的任何组合物，诸如本发明的免疫原性组合物或疫苗(例如，包含ZIKV核酸分子和/或本发明的多肽/抗原的腺病毒颗粒)，其优选地包括编码目标抗原基因产物的核苷酸序列或其片段，该目标抗原基因产物适合施用于受试者并且治疗或预防疾病(例如，ZIKV感染)或减轻或改善该疾病的一种或多种症状(例如，ZIKV病毒滴度、病毒传播、感染和/或细胞融合)。为了本发明的目的，药物组合物包括疫苗，并且适合递送治疗或生物活性剂的药物组合物包括，例如片剂、软胶囊、胶囊、丸剂、粉末、颗粒、混悬剂、乳液、溶液、凝胶、水凝胶、口服凝胶、糊状、滴眼剂、软膏、乳膏、膏药、灌服剂、递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入剂、喷雾剂或气雾剂。这些配制品中的任何一种都可以通过本领域熟知且被接受的方法来制备。参见，例如，Remington:The Science andPractice of Pharmacy[雷明顿：药学的科学与实践](第21版)，A.R.Gennaro编辑，利平科特·威廉姆斯和威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)，2005和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology[制药技术百科全书]，J.Swarbrick编辑，信息医疗出版社(Informa Healthcare),2006，其各自特此通过援引并入。

如本文所用，术语“载剂”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质的囊泡、微球、脂质体包封物或本领域中熟知的用于药物配制品中的其他材料。应理解，载剂、赋形剂或稀释剂的特征将取决于特定应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指不会干扰根据本发明的组合物的有效性或根据本发明的组合物的生物活性的无毒材料。根据特定实施例，鉴于本披露内容，适合用于药物组合物中的任何药学上可接受的载剂均可用于本发明中。

用于本发明的药学上可接受的酸式盐/阴离子盐包括(并且不限于)乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、枸橼酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(glyceptate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘苯砷酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚酸盐(hexylresorcinate)、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐和三乙基碘(triethiodide)。有机酸或无机酸也包括(并且不限于)氢碘酸、高氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羟基乙磺酸、草酸、2萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、糖精酸或三氟乙酸。

药学上可接受的碱式盐/阳离子盐包括但不限于铝、2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(也称为三(羟甲基)氨基甲烷、三羟甲烷或“TRIS”)、氨、苄星青霉素、叔丁胺、钙、氯普鲁卡因、胆碱、环己胺、二乙醇胺、乙二胺、锂、L-赖氨酸、镁、葡甲胺、N-甲基-D-葡萄糖胺、哌啶、钾、普鲁卡因、奎宁、钠、三乙醇胺或锌盐。

在本发明的一些实施例中，提供了包含本发明的腺病毒颗粒的药物组合物，腺病毒颗粒的量为每剂约1×10¹⁰、约2×10¹⁰、约3×10¹⁰、约4×10¹⁰、约5×10¹⁰、约6×10¹⁰、约7×10¹⁰、约8×10¹⁰、约9×10¹⁰、约1×10¹¹、约2×10¹¹、约3×10¹¹、约4×10¹¹或约5×10¹¹个病毒颗粒。在本发明的某些实施例中，该药物组合物每剂包含约1×10¹⁰个腺病毒颗粒至约5×10¹¹个腺病毒颗粒。在本发明的某些实施例中，该药物组合物每剂包含约1×10¹⁰个腺病毒颗粒至约1×10¹²个腺病毒颗粒。在本发明的某些实施例中，该药物组合物每剂包含约5×10¹⁰个腺病毒颗粒至约1×10¹¹个腺病毒颗粒。在本发明的某些实施例中，该药物组合物每剂包含约5×10¹⁰个腺病毒颗粒。在本发明的某些实施例中，该药物组合物每剂包含约1×10¹¹个腺病毒颗粒。

该药物组合物可以具有约3.0至约10，例如约3至约7，或约5至约9的pH。该配制品还可包含至少一种选自由以下组成的组的成分：缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。

在某些实施例中，向受试者施用单剂量的药物组合物。在某些实施例中，向受试者施用双剂量的药物组合物。当施用双剂量时，第一和第二剂量的药物组合物可间隔约四周、约八周、约十二周、约三个月、约六个月、约九个月、约一年、约两年、约三年、约四年、约五年或约十年施用于受试者。

药物活性成分与药学上可接受的载剂的配制品是本领域已知的，例如雷明顿：药学的科学与实践(例如，第21版(2005年)以及后来的任何版本)。其他成分的非限制性实例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载剂可以用于配制本发明的药物组合物。

在本发明的一个实施例中，药物组合物是液体配制品。液体配制品的优选实例是水性配制品，即包含水的配制品。液体配制品可以包含溶液、混悬剂、乳液、微乳液、凝胶等。水性配制品典型地包含至少50％w/w的水，或至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％w/w的水。

在一个实施例中，可以将药物组合物配制成可以注射的，例如可以经由注射器或输液泵注射的注射剂。例如，注射剂可以皮下、肌内、腹膜内或静脉内递送。

在另一个实施例中，药物组合物是固体配制品，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可以原样使用，或在使用前医师或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂(诸如压制片剂和/或包衣片剂)和胶囊(例如，硬明胶或软明胶胶囊)。药物组合物也可以是例如小袋、糖衣丸、粉末、颗粒、锭剂或用于重构的粉末的形式。

剂型可以是立即释放型，在这种情况下，它们可以包含水溶性或分散性载剂，或者它们可以是延迟释放型、持续释放型或调节释放型，在这种情况下，它们可以包含调节该剂型在胃肠道中的溶解速率的水不溶性聚合物。

在其他实施例中，药物组合物可以鼻内、颊内或舌下递送。

水性配制品中的pH可以在pH 3和pH 10之间。在本发明的一个实施例中，配制品的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施例中，配制品的pH为约3.0至约7.0。

在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性实例包括：精氨酸、天冬氨酸、二甘氨酸(bicine)、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸、酒石酸、三甲基甘氨酸(tricine)和三(羟甲基)-氨基甲烷及其混合物。缓冲剂可以单独地或以聚集物的形式存在，其浓度为约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定缓冲剂中的每一种缓冲剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。

在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含防腐剂。防腐剂的非限制性实例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、溴酚、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯甘醚(chlorphenesin)、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞及其混合物。防腐剂可以单独地或以聚集物的形式存在，其浓度为约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定防腐剂中的每一种防腐剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。

在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含等渗剂。实施例的非限制性实例包括盐(诸如氯化钠)、氨基酸(诸如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、醛醇(诸如甘油、1,2-丙烷二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。等渗剂的另一个实例包括糖。糖的非限制性实例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖酐、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个实例是糖醇，其中术语“糖醇”定义为具有至少一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性实例包括甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。等渗剂可以单独地或以聚集物的形式存在，其浓度为约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定等渗剂中的每一种等渗剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。

在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性实例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)的盐及其混合物。螯合剂可以单独地或以聚集物的形式存在，其浓度为约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定螯合剂中的每一种螯合剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。

在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性实例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。

在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂是羧基-/羟基纤维素及其衍生物(诸如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲基硫代乙醇、聚乙二醇(诸如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐(诸如氯化钠)、含硫物质(诸如单硫代甘油)或巯基乙酸。稳定剂可以单独地或以聚集物的形式存在，其浓度为约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定稳定剂中的每一种稳定剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。

在本发明的其他实施例中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂，至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水性)部分和脂溶性(亲脂性)部分组成的任何分子或离子。表面活性剂可以例如选自由阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂组成的组。表面活性剂可以单独地或以聚集物的形式存在，其浓度为约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定表面活性剂中的每一种表面活性剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。

在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如EDTA(乙二胺四乙酸)和/或盐酸(HCl)苯甲脒。蛋白酶抑制剂可以单独地或以聚集物的形式存在，其浓度为约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种蛋白酶抑制剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。

本发明的药物组合物可以包含一定量的氨基酸碱，其足以在组合物储存期间减少多肽的聚集物形成。术语“氨基酸碱”是指一种或多种氨基酸(诸如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)或其类似物。任何氨基酸都可以其游离碱形式或以其盐形式存在。氨基酸碱的任何立体异构体(即L、D或其混合物)都可以存在。氨基酸碱可以单独地存在或与其他氨基酸碱组合存在，其浓度为约0.01mg/mL至约50mg/mL，例如约0.1mg/mL至约20mg/mL。包含这些特定氨基酸碱中的每一种氨基酸碱的药物组合物构成本发明的替代实施例。

对于本领域技术人员也显而易见的是，包含编码本发明的寨卡病毒M和Env抗原的核酸分子的腺病毒颗粒或其药物组合物的治疗有效剂量将根据预期效果而变化。因此，要施用的最佳剂量可以容易地由本领域技术人员确定，并且将随着所用的特定腺病毒颗粒、施用模式、制剂的强度以及疾病状况(例如，寨卡病毒感染)的进展而变化。另外，与所治疗的特定受试者相关的因素，包括受试者年龄、体重、饮食以及施用时间，将导致需要调节剂量以达到适当的治疗水平。

本发明的腺病毒颗粒的药学上可接受的盐包括由无机酸或碱或有机酸或碱形成的常规无毒盐或季铵盐。此类酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、十二烷基硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐和酒石酸盐。碱式盐包括铵盐、碱金属盐(诸如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(诸如钙盐和镁盐)、与有机碱的盐(诸如二环己基氨基盐)以及与氨基酸(诸如精氨酸)的盐。另外，碱性含氮基团可以用例如烷基卤化物季铵化。

本发明的药物组合物可以通过实现其预期目的的任何方式施用。如本文所用，“施用”是指向受试者给予一定剂量的药物组合物(例如，免疫原性组合物(例如，疫苗(例如，寨卡病毒(ZIKV)疫苗)))的方法。在本文所述方法中利用的组合物可以例如通过肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、外用、肿瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局部、吸入、注射、输注、连续输注、局部灌注、直接沐浴靶细胞、经导管、灌洗、管饲、以乳膏或以脂质组合物的形式来施用。优选的施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的组合物的组分和所治疗疾病的严重程度)而变化。

使用方法

本发明提供了用于在有需要的人类受试者中产生针对寨卡病毒的免疫应答的方法。这些方法包括向该受试者施用药物组合物，该药物组合物包含：包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核酸序列的腺病毒载体以及药学上可接受的载剂。这些方法用于预防、治疗寨卡病毒感染，延迟寨卡病毒感染的发作，或缓解寨卡病毒感染或所述寨卡病毒感染的任何一种或多种症状，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的药物组合物。

根据特定的实施例，免疫原性量或有效量或保护量是指足以实现以下作用中的一种、两种、三种、四种或更多种的免疫原的量：(i)降低或改善待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的严重程度；(ii)减少待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的进展；(iv)引起待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的消退；(v)预防待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的发展或发作；(vi)预防待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的复发；(vii)减少具有待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的受试者的住院；(viii)减少具有待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的受试者的住院长度；(ix)增加具有待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中的待治疗的寨卡病毒感染或与其相关的症状；和/或(xii)增强或改良另一种疗法的一种或多种预防或治疗作用；(xiii)预防寨卡病毒通过性途径和母婴途径传播；(xiv)预防和/或降低与寨卡病毒相关的胎儿脑部异常的严重程度。

可以使用本发明的组合物预防的由病毒感染(诸如ZIKV)引起的疾病症状的实例包括例如，发烧、关节痛、皮疹、结膜炎、肌肉痛、头痛、眶后痛、水肿、淋巴结病、不适、乏力、喉咙痛、咳嗽、恶心、呕吐、腹泻和血性精液。这些症状及其在治疗过程中的消退可以由例如医师在身体检查期间或通过本领域已知的其他测试和方法来测量。

免疫原性或有效量或剂量可以根据各种因素而变化，诸如待治疗的寨卡病毒感染、施用方式、靶位点、受试者的生理状态(包括年龄、体重、健康)，受试者是人类还是动物，施用的其他用药、以及治疗是预防性的还是治疗性的。最佳滴定治疗剂量以优化安全性和功效。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”均旨在指改善或逆转与寨卡病毒感染有关的至少一个可测量的物理参数，该寨卡病毒感染在受试者中不一定可辨别，但是可以在受试者中辨别。术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还可以指引起寨卡病毒感染的消退，防止寨卡病毒感染的进展，或至少减缓寨卡病毒感染的进展。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻、预防与寨卡病毒感染相关的一种或多种症状的发展或发作或减少与寨卡病毒感染相关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指预防寨卡病毒感染的复发。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指患有寨卡病毒感染的受试者的存活的增加。在一个特定的实施例中，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指消除受试者的寨卡病毒感染。

在某些实施例中，施用免疫原性量或有效量的本发明的药物组合物使从患有ZIKV感染的受试者测定的ZIKV血清病毒载量与施用有效量的本发明的组合物之前从受试者测定的病毒载量相比降低至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些情况下，施用有效量的本发明的组合物使血清病毒载量与施用有效量的本发明的组合物之前从受试者测定的病毒载量相比降低至无法检测的水平。在一些情况下，施用有效量的本发明的组合物导致降低的和/或无法检测的血清病毒载量，其可以维持至少约1、2、3、4、5、6、7天；1、2、3、4周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月；或1年或更长。

另外，可以向受试者给予本发明的组合物的单次或多次施用(暴露前或暴露后和/或诊断前或诊断后)(例如，一次施用或两次或更多次施用)。例如，对例如病毒感染(例如，ZIKV感染)特别敏感的受试者可能需要多次施用本发明的组合物以建立和/或维持对病毒的防护。本文描述的药物组合物所提供的诱导免疫水平可以通过例如测量中和分泌抗体和血清抗体的量来监测。然后可以根据需要调整或重复剂量，以触发预期的免疫应答水平。例如，由本发明组合物的单次施用(初免)引发的免疫应答可能不足以强效和/或持久地提供有效保护。因此，在一些实施例中，重复施用(加强)使得建立初免加强方案，可以显著增强对组合物抗原的体液应答和细胞应答。

替代性地，可以在施用本发明的药物组合物后，通过监测在受试者(例如人)中表达的抗原性或治疗性基因产物或其片段的水平来确定治疗的功效。例如，可以使用例如本领域已知的标准测定法来测试受试者的血液或淋巴液的抗原性或治疗性基因产物或其片段。

在一些情况下，可以通过监测在施用有效量的本发明药物组合物之前和之后从受试者获得的样品的血清病毒载量的变化来确定治疗的功效。与施用有效量的本发明组合物之前从受试者中测定的病毒载量相比，血清病毒载量减少至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，可以表明受试者正在从治疗中受益。如果在施用本发明的组合物后病毒载量没有降低至少约10％、20％、30％或更多，则可以增加待施用的组合物的剂量。例如，通过增加基于腺病毒载体的疫苗的病毒颗粒(VP)的数目。

如果将本发明的药物组合物与免疫刺激剂和/或佐剂共同施用，则可以提高本发明药物组合物的免疫原性。本领域技术人员熟知的合适的佐剂包括，例如，磷酸铝、氢氧化铝、QS21、Quil A(及其衍生物和组分)、磷酸钙、氢氧化钙、氢氧化锌、糖脂类似物、氨基酸的十八烷基酯、胞壁酰二肽、聚磷腈、脂蛋白、ISCOM基质、DC-Chol、DDA、细胞因子和其他佐剂及其衍生物。

术语“免疫刺激剂”是指通过诱导其任何组分的活化或增加其任何组分的活性来刺激免疫系统的物质(例如，药物和营养物)。免疫刺激剂包括细胞因子(例如，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和干扰素(例如，IFN-α和/或IFN-γ)。

术语“佐剂”定义为改变其他试剂(例如，ZIKV抗原)的作用而在单独施用时几乎没有直接作用的药理剂或免疫剂。佐剂可以是一种或多种引起免疫系统刺激的物质。在此上下文中，使用佐剂来增强对本发明的腺病毒颗粒的免疫应答。

试剂盒

本文还提供了试剂盒，这些试剂盒包含(a)本发明的腺病毒载体和(b)本发明的宿主细胞。在某些实施例中，腺病毒载体包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列，其中编码该寨卡病毒M和Env抗原的该核苷酸序列与包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒(CMV)启动子可操作地连接。该腺病毒载体可包含选自由SEQ ID NO:9-11和SEQID NO:15组成的组的核苷酸序列。

在某些实施例中，该宿主细胞包含编码四环素阻遏子(TetR)蛋白的核苷酸序列。编码该TetR蛋白的该核苷酸序列可以例如整合在该宿主细胞的基因组中。编码该TetR蛋白的该核苷酸序列可以整合在1号染色体中。在某些实施例中，宿主细胞是宿主细胞。

实施例

本发明还提供了以下非限制性实施例。

实施例1是一种包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列的腺病毒载体，其中编码该寨卡病毒M和Env抗原的该核苷酸序列与包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒(CMV)启动子可操作地连接。

实施例2是如实施例1所述的腺病毒载体，其中该寨卡病毒M和Env抗原包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

实施例3是如实施例1或2所述的腺病毒载体，其中包含至少一个TetO基序的CMV启动子包含选自SEQ ID NO:3-5的核苷酸序列。

实施例4是如实施例1至3中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体选自由ChAd3、SAdV、rhAd51、rhAd52、rhAd53、hAd4、hAd5、hAd26和hAd35组成的组。

实施例5是如实施例4所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体是Ad26。

实施例6是如实施例1-5中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:9-11和SEQ ID NO:15组成的组的核苷酸序列。

实施例7是一种重组细胞，该宿主细胞包含如实施例1至6中任一项所述的腺病毒载体。

实施例8是如实施例7所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含编码四环素阻遏子(TetR)蛋白的核苷酸序列。

实施例9是如实施例8所述的宿主细胞，其中编码该TetR蛋白的该核苷酸序列整合在该宿主细胞的基因组中。

实施例10是如实施例9所述的宿主细胞，其中编码该TetR蛋白的该核苷酸序列整合在1号染色体中。

实施例11是如实施例7至10中任一项所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是宿主细胞。

实施例12是一种药物组合物，该药物组合物包含如实施例1至6中任一项所述的腺病毒载体和药学上可接受的载剂。

实施例13是一种产生包含寨卡病毒M和Env抗原的腺病毒颗粒的方法，其中该方法包括：

a.使宿主细胞与包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列的腺病毒载体接触，其中编码该寨卡病毒M和Env抗原的该核苷酸序列与包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒(CMV)启动子可操作地连接；以及

b.使该宿主细胞在产生包含该寨卡M和Env抗原的该腺病毒颗粒的条件下生长。

实施例14是如实施例13所述的方法，其中该寨卡病毒M和Env抗原包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

实施例15是如实施例13或14所述的方法，其中包含至少一个TetO基序的CMV启动子包含选自SEQ ID NO:3-5的核苷酸序列。

实施例16是如实施例13至15中任一项所述的方法，其中该腺病毒载体选自由ChAd3、SAdV、rhAd51、rhAd52、rhAd53、hAd4、hAd5、hAd26和hAd35组成的组。

实施例17是如实施例16所述的方法，其中该腺病毒载体是hAd26。

实施例18是如实施例13至17中任一项所述的腺病毒载体，其中该腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:9-11和SEQ ID NO:15组成的组的核苷酸序列。

实施例19是如实施例13所述的方法，其中该宿主细胞进一步包含编码四环素阻遏子(TetR)蛋白的核苷酸序列。

实施例20是如实施例19所述的方法，其中编码该TetR蛋白的该核苷酸序列整合在该宿主细胞的基因组中。

实施例21是如实施例20所述的方法，其中编码该TetR蛋白的该核苷酸序列整合在1号染色体中。

实施例22是如实施例19至21中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是宿主细胞。

实施例23是一种药物组合物，该药物组合物包含通过如实施例13至22中任一项所述的方法产生的腺病毒颗粒和药学上可接受的载剂。

实施例24是一种用于在有需要的人类受试者中预防寨卡病毒感染或寨卡病毒感染进展的方法，该方法包括向该有需要的受试者施用如实施例23所述的药物组合物。

实施例25是如实施例24所述的方法，其中该药物组合物通过肌内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病变内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、外用、肿瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、口服、外用、局部、吸入、注射、输注、连续输注、局部灌注、经导管、灌洗或管饲来施用。

实施例26是一种试剂盒，该试剂盒包含：

a.包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列的腺病毒载体，其中编码该寨卡病毒M和Env抗原的该核苷酸序列与包含至少一个四环素操纵子(TetO)基序的巨细胞病毒(CMV)启动子可操作地连接；以及

b.包含编码四环素阻遏子(TetR)蛋白的核苷酸序列的宿主细胞。

实施例27是如实施例26所述的试剂盒，其中该寨卡病毒M和Env抗原包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

实施例28是如实施例26或27所述的试剂盒，其中包含至少一个TetO基序的CMV启动子包含选自由SEQ ID NO:3-5组成的组的核苷酸序列。

实施例29是如实施例26至28中任一项所述的试剂盒，其中该腺病毒载体选自由ChAd3、SAdV、rhAd51、rhAd52、rhAd53、hAd4、hAd5、hAd26和hAd35组成的组。

实施例30是如实施例29所述的试剂盒，其中所述腺病毒载体是hAd26。

实施例31是如实施例26至30中任一项所述的试剂盒，其中该腺病毒载体包含选自由SEQ ID NO:9-11和SEQ ID NO:15组成的组的核苷酸序列。

实施例32是如实施例26至31中任一项所述的试剂盒，其中编码该TetR蛋白的该核苷酸序列整合在该宿主细胞的基因组中。

实施例33是如实施例32所述的试剂盒，其中编码该TetR蛋白的该核苷酸序列整合在1号染色体中。

实施例34是如实施例26至33中任一项所述的试剂盒，其中该宿主细胞是宿主细胞

实例

实例1：可被TetR强烈阻遏的新型且强效的带有单个TetO基序的CMV启动子变体

根据Abbink等人先前描述的方法(J Virol.[病毒学杂志]2007年5月；81(9):4654-63)，生成了E1和E3缺失的基于Ad26的腺病毒载体，其包含编码寨卡病毒M和Env抗原的核苷酸序列。在该载体(本文命名为Ad26.ZIKV.001)中，寨卡病毒抗原的表达受强大的组成活性巨细胞病毒(CMV)启动子驱动，该启动子先前用于驱动由其他腺病毒疫苗载体编码的抗原的表达(Abbink等人，J Virol.[病毒学杂志]2007年5月；81(9):4654-63)。不幸的是，虽然可以生成Ad26.ZIKV.001并批量生产用于临床前免疫原性测试，但是发现与其他腺病毒疫苗载体相比，该载体在E1互补性生产细胞如上显示出生长受损，例如得到病毒颗粒产生滴度比良好生产基准的基于Ad26的载体的滴度低约10倍。

为了解决Ad26.ZIKV.001所见的生产率问题，生成了此载体的新型式，其中寨卡病毒抗原的表达受可被TetR阻遏的CMV启动子控制。在表达TetR的生产细胞中，此类载体将表达较低水平的寨卡病毒抗原，因此由于避免了高水平寨卡病毒抗原表达可能对载体产生所具有的任何抑制作用而可以表现出提高的生产率。优选地，与Ad26.ZIKV.001中使用的CMV启动子相比，新的编码寨卡病毒抗原的载体中使用的TetR阻遏性CMV启动子将仅带有最小的修饰，使得最终载体的整体性质和效力将保持与Ad26.ZIKV.001相同。因此，为了实现这一点，由于靠近CMV启动子转录起始位点引入了单个tetO序列，因此将一组新的启动子设计并构建成TetR阻遏性的。随后测试这些启动子的TetR阻遏性和启动子强度，并将它们与已知的TetR阻遏性启动子“CMVtetO”(SEQ ID NO:8)进行比较，后者在本文中也称为CMVtetO型式1(CMVtetO v1)。该启动子源自人CMV启动子，但经修饰为在其TATA盒的正下游携带54-bp序列插入，该序列插入包含两个拷贝的19-bp TetO基序(TCCCTATCAGTGATAGAGA)(SEQ IDNO:20)。

测试了一组通过CMV启动子核心区的修饰而设计为TetR阻遏性的CMV启动子变体，并且发现这些中的几种是TetR阻遏性的。图1示出了TetR阻遏性CMV启动子变体2A1、2A2、2B1、3A和3B的启动子核心区的设计。这些变体与亲本CMV启动子的不同之处在于图1所展示的取代。这些变体中的每一种均携带单个TetO序列，该序列通过一组取代引入，其保留了保守性CMV启动子元件例如TATA盒与起始元件(Inr)之间的天然相对位置。在变体2A1、2A2和2B1中，通过取代天然转录起始位点(TSS)周围的核苷酸残基来引入该单个TetO序列，而在变体3A和3B中，这是通过取代所述TSS下游的残基来实现的。具有共有序列YYANWYY的Inr基序部分保留(2A1、2A2、2B1)或全部(3A、3B)完整。这些带有单个TetO的CMV启动子的长度保持与Ad26.ZIK.001中存在的非带有TetO的亲本CMV启动子的长度相同。带有TetO的CMV启动子变体2A1、2A2、2B1、3A和3B的完整序列分别在SEQ ID NO:3-7中列出。

如果要用于驱动在Ad疫苗载体中的转基因(TG)表达，则认为与先前已经广泛使用并且在腺病毒载体的背景下测试会驱动抗原表达，并且存在于Ad26.ZIK.001中的非带有tetO的标准CMV启动子相比，所达到的TG表达水平(效力)不受损是有利的。此外，重要的是，新的带有TetO的CMV启动子的TetR阻遏性必须足够高，以避免抗原对表达TetR的生产细胞中的载体产生的任何抑制作用。

因此，为了研究新的TetO启动子是否具有在Ad疫苗载体中作为驱动抗原表达的启动子的效用，使用基于瞬时转染的双重报告基因测定对它们进行启动子效力和TetR阻遏性测试。简要地，合成启动子序列(由基因技术股份公司(GeneArt)合成)，并通过标准分子技术引入先前在PCT/EP2018/053201中描述的pDualLuc中，以驱动高斯荧光素酶(GL)的表达。在高斯荧光素酶盒旁边，该质粒携带红色萤火虫荧光素酶(RFL)表达盒，用于高斯荧光素酶信号归一化。为了测试新的启动子，将细胞和表达TetR的细胞系PER.C6-hCMV.TetR(先前在PCT/EP2018/053201中有描述)用新的报告基因构建体或用对照构建体转染，在对照构建体中GL受CMV或CMVtetO v1控制。随后如先前在PCT/EP2018/053201中所述，测定GLuc和红色萤火虫荧光素酶(RFL)的活性。对于每种测试的启动子变体，图2示出了在和细胞中获得的(RFL归一化的)GLuc表达相对于通过CMV获得的表达水平。数据显示，在中，五种带有单个tetO的启动子全部表现出接近于标准CMV的表达水平，其中启动子2A1、2B1和3A给出最高值。这三种变体显示出比原始CMVtetO启动子(CMVtetO v1)略高的表达水平，而原始CMVtetO启动子始终展示出比CMV略低的表达水平(在图2中且数据未示出)。在表达TetR的细胞中，通过所有五种新的含TetO的启动子获得的表达水平均降低，其中2A1、2A2和2B1所见到的降低水平与带有2x TetO的启动子CMVtetO型式1所见到的水平接近，指示强效的TetR阻遏性。相比之下，变体3A和3B展示出比这三种启动子明显更低的TetR阻遏性水平(图2)。

总的来说，将带有单个TetO基序的启动子2A1、2A2和2B1鉴定为具有高水平TetR阻遏性的强效启动子。引入CMV启动子中以产生这些启动子的该组有限的核苷酸残基取代似乎没有影响启动子效力，但它们成功地使CMV启动子可被TetR强烈阻遏。出于这些原因，认为2A1、2A2和2B1代表可用于驱动腺病毒载体中的转基因的有用的强效替代性的TetR阻遏性启动子。这些新的启动子与表达TetR的生产细胞(如PER.C6-TetR)组合，应允许编码抑制性转基因的腺病毒载体的有效产生。具体而言，这些启动子可用于解决Ad26.ZIKV.001的生产率问题，方法是用这些中的一种置换该载体中的CMV启动子，并在表达TetR的细胞系上产生所得载体。

实例2：腺病毒载体的生成

pAdApt26.CMVTO2A1.prM-Env载体的产生

为了生成在含TetO的CMV启动子的控制下编码M和Env蛋白的衔接子质粒pAdApt26.CMVTO2A1.prM-Env(SEQ ID NO:16)，将pAdApt26.ZIK.001(SEQ ID NO:17)的CMV启动子用质粒pMK-RQ.CMVTO2A1_GL_Ao_RFL(SEQ ID NO:18)的含TetO的CMV启动子(SEQ IDNO:3)置换。为此目的，通过PCR扩增pMK-RQ.CMVTO2A1_GL_Ao_RFL的相关CMVTO2A1片段，并使用限制酶HindIII-HF和AvrII消化所得的DNA片段和pAdApt26.ZIK.001。随后的连接步骤导致生成pAdApt26.CMVTO2A1.prM-Env(SEQ ID NO:16)。

包含带有含2A1 TetO的CMV启动子(SEQ ID NO:9)的ME寨卡转基因表达盒的 Ad26.ZIKV.002载体的产生

对pAdapt26.CMVTO2A1.prM-Env质粒DNA(其中腺病毒的E1基因已被ZIKV M和Env表达盒置换)进行DNA清洗和DNA序列分析，然后在(先前在PCT/EP2018/053201中作为PER.C6-hCMV.TetR进行描述)中生成Ad26载体。

为了生成Ad26.ZIKV.002载体(SEQ ID NO:15)，将衔接子质粒与粘粒一起共转染，该粘粒含有Ad26基因组的剩余部分，其中Ad26 E3基因已部分缺失(pWe.Ad26.dE3.5orf6.粘粒(SEQ ID NO:19))。在相同粘粒中，已将Ad26 E4开放阅读框6(E4orf6)和E4orf6/7的一部分交换为腺病毒血清型5(Ad5)的那些，以允许在Ad5 E1互补细胞系如HEK293、或HER96细胞中产生无复制能力的Ad26载体。2种DNA载体pAdapt26和粘粒之间的同源重组导致腺病毒基因组的形成，该基因组含有形成完整病毒颗粒所需的所有病毒基因。

通过噬菌斑纯化在覆盖有琼脂糖的单层细胞上分离单个噬菌斑。使噬菌斑在细胞上扩增，并测试腺病毒基因组的完整性和同一性以及转基因的正确表达。使来自噬菌斑#1的腺病毒在细胞上进一步扩增，随后进行CsCl纯化。

实例3：Ad26.ZIKV.002载体的可制造性评估

由每毫升病毒颗粒数(vp/mL)表示的滴度所定义的生产率对于扩大生物反应器中的载体生产规模而为不同的下游工艺步骤提供足够的材料至关重要。因此，在小规模实验中，通过将Ad26.ZIKV.002载体(SEQ ID NO:15)与几种编码不同转基因的内部基准Ad26载体进行比较来评估悬浮细胞和悬浮细胞中的生产率。先前在PCT/EP2018/053201中将作为PER.C6-AoHV.TetR进行了描述。

生成Ad26.ZIKV.002，并在小规模细胞和模型中测试了相对生产率(图3)。将以1×10⁶个细胞/mL的密度接种在摇瓶中的总体积为10mL的补充了4mM L-谷氨酰胺(龙沙集团(Lonza))的培养基(龙沙集团；瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))中的细胞和细胞培养物用不同的载体以不同的病毒颗粒(VP)-细胞比感染，然后温育4天。简言之，用70、300和900vp/细胞的纯化Ad26.ZIKV.002腺病毒颗粒或三种内部Ad26对照(基准)之一转导细胞或细胞，从先前的研究已知这些对照是良好、中等或低生产者。在感染后第0、1、2、3和4天取样，并通过VP-qPCR测定腺病毒载体滴度。如图3所示，当在细胞上产生时，Ad26.ZIKV.002在70、300和900vp/细胞下显示出与低产对照同等的生产率。当在细胞上产生时，Ad26.ZIKV.002在70、300和900vp/细胞下显示出与良好生产对照同等的生产率。虽然在细胞上制造时，含TetO的Ad26.ZIKV.002载体与低生产者同等，但产率提高，使得在小规模摇瓶模型中在上制造时，Ad26.ZIKV.002载体与良好生产者同等。

还使用小规模模型测试了Ad26.ZIKV.002在细胞和中的生产率，该模型可预测较大规模下的病毒生产(图4)。简言之，用300vp/细胞的纯化研究批量材料Ad26.ZIKV.002或含有(非抑制性)荧光素酶转基因的Ad26，在带有TetO的CMV启动子的控制下转导细胞或细胞。在感染后第3天通过(六邻体)vp-qPCR测量病毒滴度。Ad26.ZIKV.002在中的生产率比细胞中的生产率高≥1Log₁₀。

10/50升规模下Ad26.ZIKV.002在sPER.C6-TetR中的生产率

以高细胞密度在10L和50L规模下，在10L生物反应器中使用70vp/细胞和300vp/细胞以及在50L生物反应器中使用300vp/细胞评估Ad26.ZIKV.002在中的生产率(图5)。感染后第3天进行收获，并通过毛细管电泳测量病毒颗粒(vp)滴度。第3天在中达到的病毒颗粒滴度比中的Ad26.ZIKV.001高1.5-2Log₁₀。

实例4：Ad26.ZIKV.002在非人灵长类动物中具有免疫原性并且赋予针对ZIKV挑战的保护

用10¹¹vp Ad26.ZIKV.002肌肉注射一次使非人灵长类动物(NHP，猕猴(Rhesusmacaques))免疫，或者用配制缓冲液(虚假物)免疫。免疫后四周，给动物放血，并用10³pfuZIKV-BR皮下挑战。

Ad26.ZIKV.002在NHP中诱导了体液免疫应答，如Env结合抗体滴度的诱导(图6，左图)和ZIKV-PR中和抗体滴度的诱导(图6，右图)所示。

挑战后，所有注射虚假物的NHP均在血浆中显示出病毒载量。相比之下，用Ad26.ZIKV.002免疫的NHP都受到针对ZIKV-BR挑战的保护，正如这些动物的血浆样品中无法检测到的病毒RNA载量所证明的(图7，上图)。

另外，在ZIKV-BR挑战后第3天和第7天测量了脑脊液(CSF)中的病毒载量。尽管在所有虚假免疫动物的CSF样品中均可检测到ZIKV RNA，但在Ad26.ZIKV.002免疫动物的CSF样品中无法检测到病毒(图7，下图)。

本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的广泛发明构思的情况下，可以对上述实施例进行改变。因此，应当理解，本发明不限于所披露的特定实施例，而是旨在涵盖由本说明书限定的本发明的精神和范围内的修改。

序列表

<110> 扬森疫苗与预防公司

<120> 以提高的生产率表达寨卡抗原的重组腺病毒载体

<130> 688097.511US

<160> 20

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 603

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 寨卡病毒M和Env抗原

<400> 1

Met Gly Lys Arg Ser Ala Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala Ser Leu Ala

1 5 10 15

Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Ala Val Thr Leu Pro Ser His Ser

20 25 30

Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu Glu Ser Arg Glu

35 40 45

Tyr Thr Lys His Leu Ile Arg Val Glu Asn Trp Ile Phe Arg Asn Pro

50 55 60

Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile Ala Trp Leu Leu Gly Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile Leu Leu Ile Ala Pro

85 90 95

Ala Tyr Ser Ile Arg Cys Ile Gly Val Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu

100 105 110

Gly Met Ser Gly Gly Thr Trp Val Asp Val Val Leu Glu His Gly Gly

115 120 125

Cys Val Thr Val Met Ala Gln Asp Lys Pro Thr Val Asp Ile Glu Leu

130 135 140

Val Thr Thr Thr Val Ser Asn Met Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr

145 150 155 160

Glu Ala Ser Ile Ser Asp Met Ala Ser Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln

165 170 175

Gly Glu Ala Tyr Leu Asp Lys Gln Ser Asp Thr Gln Tyr Val Cys Lys

180 185 190

Arg Thr Leu Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly

195 200 205

Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Lys Lys Met

210 215 220

Thr Gly Lys Ser Ile Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Arg Ile Met Leu

225 230 235 240

Ser Val His Gly Ser Gln His Ser Gly Met Ile Val Asn Asp Thr Gly

245 250 255

His Glu Thr Asp Glu Asn Arg Ala Lys Val Glu Ile Thr Pro Asn Ser

260 265 270

Pro Arg Ala Glu Ala Thr Leu Gly Gly Phe Gly Ser Leu Gly Leu Asp

275 280 285

Cys Glu Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Ser Asp Leu Tyr Tyr Leu Thr

290 295 300

Met Asn Asn Lys His Trp Leu Val His Lys Glu Trp Phe His Asp Ile

305 310 315 320

Pro Leu Pro Trp His Ala Gly Ala Asp Thr Gly Thr Pro His Trp Asn

325 330 335

Asn Lys Glu Ala Leu Val Glu Phe Lys Asp Ala His Ala Lys Arg Gln

340 345 350

Thr Val Val Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Val His Thr Ala Leu

355 360 365

Ala Gly Ala Leu Glu Ala Glu Met Asp Gly Ala Lys Gly Arg Leu Ser

370 375 380

Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Arg Leu Lys

385 390 395 400

Gly Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile

405 410 415

Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala

420 425 430

Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met

435 440 445

Gln Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile

450 455 460

Thr Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro

465 470 475 480

Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr

485 490 495

His His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala

500 505 510

Thr Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp

515 520 525

Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile

530 535 540

His Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser

545 550 555 560

Trp Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu

565 570 575

Asn Thr Lys Asn Gly Ser Ile Ser Leu Met Cys Leu Ala Leu Gly Gly

580 585 590

Val Leu Ile Phe Leu Ser Thr Ala Val Ser Ala

595 600

<210> 2

<211> 1809

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寨卡病毒M和Env抗原

<400> 2

atgggcaaaa gatccgccgg cagcatcatg tggctggcca gtctggctgt cgtgatcgcc 60

tgtgctggcg ccgctgtgac actgcctagc cacagcaccc ggaagctgca gaccagaagc 120

cagacctggc tggaaagcag agagtacacc aagcacctga tccgggtgga aaactggatc 180

ttccggaacc ccggcttcgc cctggccgct gctgctattg cttggctgct gggcagcagc 240

accagccaga aagtgatcta cctcgtgatg atcctgctga tcgcccctgc ctacagcatc 300

cggtgtatcg gcgtgtccaa ccgggacttc gtggaaggca tgagcggcgg cacatgggtg 360

gacgtggtgc tggaacatgg cggctgcgtg acagtgatgg cccaggacaa gcccaccgtg 420

gacatcgagc tcgtgaccac caccgtgtcc aatatggccg aagtgcggag ctactgctac 480

gaggccagca tcagcgacat ggccagcgac agcagatgcc ctacacaggg cgaggcctac 540

ctggacaagc agtccgacac ccagtacgtg tgcaagcgga ccctggtgga tagaggctgg 600

ggcaatggct gcggcctgtt tggcaagggc agcctcgtga cctgcgccaa gttcgcctgc 660

agcaagaaga tgaccggcaa gagcatccag cccgagaacc tggaataccg gatcatgctg 720

agcgtgcacg gcagccagca ctccggcatg atcgtgaacg acaccggcca cgagacagac 780

gagaaccggg ccaaggtgga aatcaccccc aacagcccta gagccgaggc cacactgggc 840

ggctttggat ctctgggcct ggactgcgag cctagaaccg gcctggattt cagcgacctg 900

tactacctga ccatgaacaa caaacactgg ctggtgcaca aagagtggtt ccacgacatc 960

cccctgccct ggcatgccgg cgctgataca ggcacacccc actggaacaa caaagaggcc 1020

ctggtggagt tcaaggacgc ccacgccaag aggcagaccg tggtggtgct gggatctcag 1080

gaaggcgccg tgcatacagc tctggctggc gccctggaag ccgaaatgga tggcgctaag 1140

ggcagactgt ccagcggcca cctgaagtgc cggctgaaga tggacaagct gcggctgaag 1200

ggcgtgtcct acagcctgtg taccgccgcc ttcaccttca ccaagatccc cgccgagaca 1260

ctgcacggca ccgtgactgt ggaagtgcag tacgccggca ccgacggccc ttgtaaagtg 1320

cctgctcaga tggccgtgga tatgcagacc ctgacccctg tgggcaggct gatcaccgcc 1380

aaccctgtga tcaccgagag caccgagaac agcaagatga tgctggaact ggacccaccc 1440

ttcggcgaca gctacatcgt gatcggcgtg ggagagaaga agatcaccca ccactggcac 1500

agaagcggca gcaccatcgg caaggccttt gaggctacag tgcggggagc caagagaatg 1560

gccgtgctgg gagataccgc ctgggacttt ggctctgtgg gcggagccct gaactctctg 1620

ggcaagggaa tccaccagat cttcggcgct gccttcaaga gcctgttcgg cggcatgagc 1680

tggttcagcc agatcctgat cggcaccctg ctgatgtggc tgggcctgaa caccaagaac 1740

ggctccatca gcctgatgtg cctggctctg ggaggcgtgc tgatcttcct gagcacagcc 1800

gtgtccgcc 1809

<210> 3

<211> 829

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CMVTetO2A1启动子

<400> 3

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120

aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 660

cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720

tcgtttagtt ccctatcagt gatagagaag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 780

aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattgga 829

<210> 4

<211> 829

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CMVTetO2A2启动子

<400> 4

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120

aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300

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<211> 2655

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与ME寨卡抗原可操作地连接的CMVTetO3B启动子

<400> 13

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<210> 14

<211> 2709

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 与ME寨卡抗原可操作地连接的CMVTetO v1启动子

<400> 14

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<210> 15

<211> 31171

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ad26.ZIKV.002腺病毒载体

<400> 15

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tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 540

ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 600

aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 660

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 720

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 780

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 840

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 900

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caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 1080

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agaagccaga cctggctgga aagcagagag tacaccaagc acctgatccg ggtggaaaac 1500

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agcagcacca gccagaaagt gatctacctc gtgatgatcc tgctgatcgc ccctgcctac 1620

agcatccggt gtatcggcgt gtccaaccgg gacttcgtgg aaggcatgag cggcggcaca 1680

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accgtggaca tcgagctcgt gaccaccacc gtgtccaata tggccgaagt gcggagctac 1800

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acagacgaga accgggccaa ggtggaaatc acccccaaca gccctagagc cgaggccaca 2160

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gacctgtact acctgaccat gaacaacaaa cactggctgg tgcacaaaga gtggttccac 2280

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ccttgtaggg acagcagccc ttctccacgg ggagggcgta agcttgagcg gccttgcgga 7020

gcgaggtgtg cgtcagggca aaggtgtccc tgaccatgac tttcaagaac tggtacttga 7080

agtccgagtc gtcgcagccg ccgtgctccc agagctcgaa atcggtgcgc ttcttcgaga 7140

gggggttagg cagagcgaaa gtgacgtcat tgaagagaat cttgcctgcc cgcggcatga 7200

aattgcgggt gatgcggaaa gggcccggga cggaggctcg gttgttgatg acctgggcgg 7260

cgaggacgat ctcgtcaaag ccgttgatgt tgtgcccgac gatgtagagt tccatgaatc 7320

gcgggcggcc tttgatgtgc ggcagctttt tgagctcctc gtaggtgagg tcctcggggc 7380

attgcaggcc gtgctgctcg agcgcccact cctggagatg tgggttggct tgcatgaagg 7440

aagcccagag ctcgcgggcc atgagggtct ggagctcgtc gcgaaagagg cggaactgct 7500

ggcccacggc catcttttct ggggtgacgc agtagaaggt gagggggtcc cgctcccagc 7560

gatcccagcg taaacgcacg gcgagatcgc gagcgagggc gaccagctct gggtccccgg 7620

agaatttcat gaccagcatg aaggggacga gctgcttgcc gaaggacccc atccaggtgt 7680

aggtttctac atcgtaggtg acaaagagcc gctccgtgcg aggatgagag ccgattggga 7740

agaactggat ttcctgccac cagttggacg agtggctgtt gatgtgatga aagtagaaat 7800

cccgccggcg aaccgagcac tcgtgctgat gcttgtaaaa gcgtccgcag tactcgcagc 7860

gctgcacggg ctgtacctca tccacgagat acacagcgcg tcccttgagg aggaacttca 7920

ggagtggcgg ccctggctgg tggttttcat gttcgcctgc gtgggactca ccctggggct 7980

cctcgaggac ggagaggctg acgagcccgc gcgggagcca ggtccagatc tcggcgcggc 8040

gggggcggag agcgaagacg agggcgcgca gttgggagct gtccatggtg tcgcggagat 8100

ccaggtccgg gggcagggtt ctgaggttga cctcgtagag gcgggtgagg gcgtgcttga 8160

gatgcagatg gtacttgatt tctacgggtg agttggtggt cgtgtccacg cattgcatga 8220

gcccgtagct gcgcggggcc acgaccgtgc cgcggtgcgc ttttagaagc ggtgtcgcgg 8280

acgcgctccc ggcggcagcg gcggttccgg ccccgcgggc aggggcggca gaggcacgtc 8340

ggcgtggcgc tcgggcaggt cccggtgctg cgccctgaga gcgctggcgt gcgcgacgac 8400

gcggcggttg acatcctgga tctgccgcct ctgcgtgaag accacgggcc ccgtgacttt 8460

gaacctgaaa gacagttcaa cagaatcaat ctctgcgtca ttgacggcgg cctgacgcag 8520

gatctcttgc acgtcgcccg agttgtcctg gtaggcgatc tcggacatga actgttcgat 8580

ctcctcctcc tggagatcgc cgcggcccgc gcgctccacg gtggcggcga ggtcattgga 8640

gatgcgaccc atgagctgcg agaaggcgcc caggccgctc tcgttccaga cgcggctgta 8700

gaccacgtcc ccgtcggcgt cgcgcgcgcg catgaccacc tgcgcgaggt tgagctccac 8760

gtgccgcgca aagacggcgt agttgcgcag gcgctggaag aggtagttga gggtggtggc 8820

gatgtgctcg gtgacgaaga agtacatgat ccagcggcgc aggggcatct cgctgatgtc 8880

gccgatggct tccagccttt ccatggcctc gtagaagtcc acggcgaagt tgaaaaactg 8940

ggcgttgcgg gccgagaccg tgagctcgtc ttccaggagc cggatgagtt cggcgatggt 9000

ggcgcgcacc tcgcgctcga aatccccggg ggcctcctcc tcttcctctt cttccatgac 9060

gacctcttct tctatttctt cctctggggg cggtggtggt ggcgggggcc gacgacgacg 9120

gcgacgcacc gggagacggt cgacgaagcg ctcgatcatc tccccgcggc ggcgacgcat 9180

ggtttcggtg acggcgcgac cccgttcgcg aggacgcagc gtgaagacgc cgccggtcat 9240

ctcccggtaa tggggcgggt ccccattggg cagcgatagg gcgctgacga tgcatcttat 9300

caattgcggt gtaggggacg tgagcgcgtc gagatcgacc ggatcggaga atctttcgag 9360

gaaagcgtct agccaatcgc agtcgcaagg taagctcaaa cacgtagcag ccctgcggac 9420

gctgttagaa ttgcggttgc tgatgatgta attgaagtag gcgtttttga ggcggcggat 9480

ggtggcgagg aggaccaggt ccttgggtcc agcttgctgg atgcggagcc gctcggccat 9540

gccccaggcc tggccctgac accggctcag gttcttgtag tagtcatgca tgagcctctc 9600

aatgtcatca ctggctgagg cggagtcttc catgcgggtg accccgacgc ccctgagcgg 9660

ctgcacgagc gccaggtcgg cgacgacgcg ctcggcgagg atggcctgtt gcacgcgggt 9720

gagggtgtcc tggaagtcgt ccatgtcgac gaagcggtga taggccccgg tgttgatggt 9780

gtaggtgcag ttggccatga gcgaccagtt gacggtctgc aggcctggct gcacgacctc 9840

ggagtacctg agccgcgaga aggcgcgcga gtcgaagacg tagtcgttgc aggtgcgcac 9900

gaggtactgg tatccgacta ggaagtgcgg cggcggctgg cggtagagcg gccagcgctg 9960

ggtggccggc gcgcccgggg ccaggtcctc gagcatgagg cggtggtagc cgtagaggta 10020

gcgggacatc caggtgatgc cggcggcggt ggtggaggcg cgcgggaact cgcggacgcg 10080

gttccagatg ttgcgcagcg gcaggaaata gtccatggtc ggcacggtct ggccggtgag 10140

acgcgcgcag tcattgacgc tctagaggca aaaacgaaag cggttgagcg ggctcttcct 10200

ccgtagcctg gcggaacgca aacgggttag gccgcgtgtg taccccggtt cgagtcccct 10260

cgaatcaggc tggagccgcg actaacgtgg tattggcact cccgtctcga cccgagcccg 10320

atagccgcca ggatacggcg gagagccctt tttgccggcc gagtggggtc gctagacttg 10380

aaagcgaccg aaaaccctgc cgggtagtgg ctcgcgcccg tagtctggag aagcatcgcc 10440

agggttgagt cgcggcagaa cccggttcga ggacggccgc ggcgagcggg acttggtcac 10500

cccgccgata taaagaccca cagccagccg acttctccag ttacgggagc gagccccctt 10560

ttttcttttt gccagatgca tcccgtcctg cgccaaatgc gtcccacccc cccggcgacc 10620

accgcgaccg cggccgtagc aggcgccggc gctagccagc caccacagac agagatggac 10680

ttggaagagg gcgaagggct ggcaagactg ggggcgccgt ccccggagcg acatccccgc 10740

gtgcagctgc agaaggacgt gcgcccggcg tacgtgccta cgcagaacct gttcagggac 10800

cgcagcgggg aggagcccga ggagatgcgc gactgccggt ttcgggcggg cagggagctg 10860

cgcgagggcc tggaccgcca gcgcgtgctg cgcgacgagg atttcgagcc gaacgagcag 10920

acggggatca gccccgcacg cgcgcacgtg gcggcagcca acctggtgac ggcctacgag 10980

cagacggtga agcaggagcg caacttccaa aagagtttca acaaccacgt gcgcaccctg 11040

atcgcgcgcg aggaggtggc cctgggcctg atgcacctgt gggacctggc ggaggccatc 11100

gtgcagaacc cggacagcaa gcctctgacg gcgcagctgt tcctggtggt gcagcacagc 11160

agggacaacg aggcgttcag ggaggcgctg ctgaacatcg ccgagcccga gggtcgctgg 11220

ctgctggagc tgattaacat cttgcagagc atcgtagtgc aggagcgcag cctgagcctg 11280

gccgagaagg tggcggcgat caactactcg gtgctgagcc tgggcaagtt ttacgcgcgc 11340

aagatttaca agacgccgta cgtgcccata gacaaggagg tgaagataga cagcttttac 11400

atgcgcatgg cgctcaaggt gctgacgctg agcgacgacc tgggcgtgta ccgcaacgac 11460

cgcatccaca aggccgtgag cacgagccgg cggcgcgagc tgagcgaccg cgagctgatg 11520

ctgagtctgc gccgggcgct ggtagggggc gccgccggcg gcgaggagtc ctacttcgac 11580

atgggtgcgg acctgcattg gcagccgagc cggcgcgcct tggaggccgc ctacggttca 11640

gaggacttgg atgaggaaga ggaagaggag gaggatgcac ccgctgcggg gtactgacgc 11700

ctccgtgatg tgtttttaga tgtcccagca agccccggac cccgccataa gggcggcgct 11760

gcaaagccag ccgtccggtc tagcatcgga cgactgggag gccgcgatgc aacgcatcat 11820

ggccctgacg acccgcaacc ccgagtcctt tagacaacag ccgcaggcca acagactctc 11880

ggccattctg gaggcggtgg tcccctctcg gaccaacccc acgcacgaga aggtgctggc 11940

gatcgtgaac gcgctggcgg agaacaaggc catccgtccc gacgaggccg ggctggtgta 12000

caacgccctg ctggagcgcg tgggccgcta caacagcacg aacgtgcagt ccaacctgga 12060

tcggctggtg acggacgtgc gcgaggccgt ggcgcagcgc gagcggttca agaacgaggg 12120

cctgggctcg ctggtggcgc tgaacgcctt cctggcgacg cagccggcga acgtgccgcg 12180

cgggcaggac gattacacca actttatcag cgcgctgcgg ctgatggtga ccgaggtgcc 12240

ccagagcgag gtgtaccagt ctggcccgga ctactttttc cagacgagcc ggcagggctt 12300

gcagacggtg aacctgagcc aggctttcaa gaatctgcgc gggctgtggg gcgtgcaggc 12360

gcccgtgggc gaccggtcaa cggtgagcag cttgctgacg cccaactcgc ggctgctgct 12420

gctgctgatc gcgcccttca ccgacagcgg cagcgtgaac cgcaactcgt acctgggcca 12480

tctgctgacg ctgtaccgcg aggccatagg ccaggcgcag gtggacgagc agaccttcca 12540

ggagatcact agcgtgagcc gcgcgctggg gcagaacgac accgacagtc tgagggccac 12600

cctgaacttt ttgctgacca atagacagca gaagatcccg gcgcagtacg cactgtcggc 12660

cgaggaggaa aggattctga gatatgtgca gcagagcgta gggctgttcc tgatgcagga 12720

gggtgccacc cccagcgccg cgctggacat gaccgcgcgc aacatggaac ctagcatgta 12780

cgccgccaac cggccgttca tcaataagct gatggactac ttgcaccgcg cggcggccat 12840

gaacacggac tactttacca acgccatcct gaacccgcac tggctcccgc cgccggggtt 12900

ctacacgggc gagtacgaca tgcccgaccc caacgacggg ttcctgtggg acgacgtgga 12960

cagcgcggtg ttctcgccga cctttcaaaa gcgccaggag gcgccgccga gcgagggcgc 13020

ggtggggagg agcccctttc ctagcttagg gagtttgcat agcttgccgg gctcggtgaa 13080

cagcggcagg gtgagccggc cgcgcttgct gggcgaggac gagtacctga acgactcgct 13140

gctgcagccg ccgcgggcca agaacgccat ggccaataac gggatagaga gtctggtgga 13200

caaactgaac cgctggaaga cctacgctca ggaccatagg gacgcgcccg cgccgcggcg 13260

acagcgccac gaccggcagc ggggcctggt gtgggacgac gaggactcgg ccgacgatag 13320

cagcgtgttg gacttgggcg ggagcggtgg ggtcaacccg ttcgcgcatc tgcagcccaa 13380

actggggcga cggatgtttt gaatgaaata aaactcacca aggccatagc gtgcgttctc 13440

ttccttgtta gagatgaggc gcgcggtggt gtcttcctct cctcctccct cgtacgagag 13500

cgtgatggcg caggcgaccc tggaggttcc gtttgtgcct ccgcggtata tggctcctac 13560

ggagggcaga aacagcattc gttactcgga gctggctccg cagtacgaca ccactcgcgt 13620

gtacttggtg gacaacaagt cggcggacat cgcttccctg aactaccaaa acgaccacag 13680

caacttcctg accacggtgg tgcagaacaa cgatttcacc cccgccgagg ccagcacgca 13740

gacgataaat tttgacgagc ggtcgcggtg gggcggtgat ctgaagacca ttctgcacac 13800

taacatgccc aatgtgaacg agtacatgtt caccagcaag tttaaggcgc gggtgatggt 13860

gtctaggaag catccagagg gggtagttga aacagatttg agtcaggata agcttgaata 13920

tgagtggttt gagtttaccc tgcccgaggg aaacttttcc gagaccatga ccatagacct 13980

gatgaacaac gccatcttgg aaaactactt gcaagtgggg cggcagaatg gcgtgctgga 14040

gagcgatatc ggagtcaagt ttgacagcag aaatttcaag ctgggctggg acccggtgac 14100

caagctggtg atgccagggg tctacaccta cgaggccttc cacccggacg tggtgctgct 14160

gccgggctgc ggggtggact tcaccgagag ccgcctgagc aacctcctgg gcattcgcaa 14220

gaagcaacct ttccaagagg gcttcagaat catgtatgag gatctagaag gtggcaacat 14280

ccccgccctc cttgatgtgc ccaagtactt ggaaagcaag aagaaagttg aagacgaaac 14340

taaaaatgca gctgcggcca cagccgatac aaccactagg ggtgatacat ttgcaactcc 14400

agcgcaagag acagcagctg ataagaaggt agaagtcttg cccattgaaa aggatgagag 14460

tggtagaagt tacaacctga tccaggggac ccacgacacg ctgtaccgca gttggtacct 14520

gtcctatacc tacggggacc ccgagaaggg ggtgcagtcg tggacgctgc tcaccacccc 14580

ggacgttacc tgcggcgcgg agcaagtcta ctggtcactg ccggacctca tgcaagaccc 14640

cgtcaccttc cgctccaccc agcaagtcag caactacccc gtggtcggcg ccgagctcat 14700

gcccttccgc gccaagagct tttacaacga cctcgccgtc tactcccagc tcatccgcag 14760

ctacacctcc ctcacccacg tcttcaaccg cttccccgac aaccagatcc tctgccgccc 14820

gcccgcgccc accatcacca ccgtcagtga aaacgtgcct gctctcacag atcacgggac 14880

gctaccgctg cgcagcagta tccgcggagt ccagcgagtg accgtcactg acgcccgtcg 14940

ccgcacctgt ccctacgtct acaaggccct gggcatagtc gcgccgcgcg tgctttccag 15000

tcgcaccttc taaaaaaatg tctattctca tctcgcccag caataacacc ggctggggtc 15060

ttactagacc cagcaccatg tacggaggag ccaagaagcg ctcccagcag caccccgtcc 15120

gcgtccgcgg ccacttccgc gctccctggg gcgcatacaa gcgcgggcgg acttccaccg 15180

ccgccgtgcg caccaccgtc gacgacgtca tcgactcggt ggtcgccgac gcgcgcaact 15240

atacccccgc cccctccacc gtggacgcgg tcatcgacag cgtggtggcc gacgcgcgcg 15300

actatgccag acgcaagagc cggcggcgac ggatcgccag gcgccaccgg agcacgcccg 15360

ccatgcgcgc cgcccgggct ctgctgcgcc gcgccagacg cacgggccgc cgggccatga 15420

tgcgagccgc gcgccgcgct gccactgcac ccacccccgc aggcaggact cgcagacgag 15480

cggccgccgc cgccgctgcg gccatctcta gcatgaccag acccaggcgc ggaaacgtgt 15540

actgggtgcg cgactccgtc acgggcgtgc gcgtgcccgt gcgcacccgt cctcctcgtc 15600

cctgatctaa tgcttgtgtc ctcccccgca agcgacgatg tcaaagcgca aaatcaagga 15660

ggagatgctc caggtcgtcg ccccggagat ttacggacca ccccaggcgg accagaaacc 15720

ccgcaaaatc aagcgggtta aaaaaaagga tgaggtggac gagggggcag tagagtttgt 15780

gcgcgagttc gctccgcggc ggcgcgtaaa ttggaagggg cgcagggtgc agcgcgtgtt 15840

gcggcccggc acggcggtgg tgttcacgcc cggcgagcgg tcctcggtca ggagcaagcg 15900

tagctatgac gaggtgtacg gcgacgacga catcctggac caggcggcgg agcgggcggg 15960

cgagttcgcc tacgggaagc ggtcgcgcga agaggagctg atctcgctgc cgctggacga 16020

aagcaacccc acgccgagcc tgaagcccgt gaccctgcag caggtgctgc cccaggcggt 16080

gctgctgccg agccgcgggg tcaagcgcga gggcgagagc atgtacccga ccatgcagat 16140

catggtgccc aagcgccggc gcgtggagga cgtgctggac accgtgaaaa tggatgtgga 16200

gcccgaggtc aaggtgcgcc ccatcaagca ggtggcgccg ggcctgggcg tgcaaaccgt 16260

ggacattcag atccccaccg acatggatgt cgacaaaaaa ccctcgacca gcatcgaggt 16320

gcaaaccgac ccctggctcc cagcctccac cgctaccgtc tccacttcta ccgccgccac 16380

ggctaccgag cctcccagga ggcgaagatg gggcgccgcc agccggctga tgcccaacta 16440

cgtgttgcat ccttccatca tcccgacgcc gggctaccgc ggcacccggt actacgccag 16500

ccgccggcgc ccagccagca aacgccgccg ccgcaccgcc acccgccgcc gtctggcccc 16560

cgcccgcgtg cgccgcgtga ccacgcgccg gggccgctcg ctcgttctgc ccaccgtgcg 16620

ctaccacccc agcatccttt aatccgtgtg ctgtgatact gttgcagaga gatggctctc 16680

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atggcaggca gcggcctgaa ccgccgccgg cggcgggcca tgcgcaggcg cctgagtggc 16800

ggctttctgc ccgcgctcat ccccataatc gccgcggcca ttggcacgat cccgggcata 16860

gcttccgttg cgctgcaggc gtcgcagcgc cgttgatgtg cgaataaagc ctctttagac 16920

tctgacacac ctggtcctgt atatttttag aatggaagac atcaattttg cgtccctggc 16980

tccgcggcac ggcacgcggc cgttcatggg cacctggaac gagatcggca ccagccagct 17040

gaacgggggc gccttcaatt ggagcagtgt ctggagcggg cttaaaaatt tcggctcgac 17100

gctccggacc tatgggaaca aggcctggaa tagtagcacg gggcagttgt tgagggaaaa 17160

gctcaaagac cagaacttcc agcagaaggt ggtggacggg ctggcctcgg gcattaacgg 17220

ggtggtggac atcgcgaacc aggccgtgca gcgcgagata aacagccgcc tggacccgcg 17280

accgcccacg gtggtggaga tggaagatgc aactcttccg ccgcccaagg gcgagaagcg 17340

gccgcggccc gacgcggagg agacgatcct gcaggtggac gagccgccct cgtacgagga 17400

ggccgtcaag gccggcatgc ccaccacgcg catcatcgcg ccgctggcca cgggtgtaat 17460

gaaacccgcc acccttgacc tgcctccacc acccgcgccc gctccaccga aggcaactcc 17520

ggttgtgcag gcccccccgg tggcgaccgc cgtgcgccgc gtccccgccc gccgccaggc 17580

ccagaactgg cagagcacgc tgcacagtat cgtgggcctg ggagtgaaaa gtctgaagcg 17640

ccgccgatgc tattgagaga gaggaaagag gacactaaag ggagagctta acttgtatgt 17700

gccttaccgc cagagaacgc gcgaagatgg ccaccccctc gatgatgccg cagtgggcgt 17760

acatgcacat cgccgggcag gacgcctcgg agtacctgag cccgggtctg gtgcagtttg 17820

cccgcgccac cgacacgtac ttcagcctgg gcaacaagtt taggaacccc acggtggccc 17880

cgacccacga tgtgaccacg gaccggtccc agcgtctgac gctgcgcttc gtgcccgtgg 17940

atcgcgagga caccacgtac tcgtacaagg cgcgcttcac tctggccgtg ggcgacaacc 18000

gggtgctaga catggccagc acttactttg acatccgcgg cgtcctggac cgcggtccca 18060

gcttcaaacc ctactcgggc acggcctaca acagcctggc tcccaagggt gcccccaatc 18120

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tgttactagg aactgacgaa accgctgaga atggcaaaaa agacatttat gcagacaaga 18300

ctttccagcc agaacctcaa gttggagaag aaaactggca ggaaaatgaa gccttctatg 18360

gaggaagggc tcttaaaaag gacactaaaa tgaaaccatg ctatggatct tttgctagac 18420

ctactaatga gaaaggaggt caggcaaagt tcaaaccagt taatgaagga gaacaaccta 18480

aagatctgga tatagatttt gcttactttg acgtccctgg cggaagtcct ccagcaggtg 18540

gtagtgggga agaatacaaa gcagatataa ttttgtacac tgaaaatgtt aatcttgaaa 18600

caccagacac tcatgtggtt tacaagccag gaacttcaga taacagttca gaaatcaatc 18660

tggttcagca gtccatgcca aacagaccca actacattgg ctttagggac aactttgtag 18720

gtctcatgta ttacaacagc accggaaata tgggtgtgct ggctggtcag gcttctcagt 18780

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attctctggg tgacagaacc agatacttta gcatgtggaa ctctgcggtg gacagttacg 18900

atccagatgt caggatcatt gaaaatcacg gtgtggaaga tgaacttcca aactattgct 18960

tcccattgaa tggcactgga accaattcca cttatcaagg tgtaaagatt acaaatggta 19020

atgatggtgc tgaagaaagt gagtgggaga aagacgatgc aatttctaga caaaaccaaa 19080

tctgcaaggg caatgtctac gccatggaga tcaacctgca ggccaacctg tggaagagtt 19140

ttctgtactc gaacgtggcc ctgtacctgc ccgactccta caagtacacg ccggccaacg 19200

tcaagctgcc cgccaacacc aacacctacg agtacatgaa cggccgcgtg gtagccccct 19260

cgctggtgga cgcctacatc aacatcggcg cccgctggtc gttggacccc atggacaacg 19320

tcaacccctt caaccaccac cgcaatgcgg gcctgcgcta ccgctccatg ctgctgggca 19380

acggccgcta cgtgcccttc cacatccaag tgccccaaaa gttctttgcc atcaagaacc 19440

tgctcctgct cccgggctcc tacacctacg agtggaactt ccgcaaggac gtcaacatga 19500

tcctgcagag ttccctcggc aacgacctgc gcgtcgacgg cgcctccgtc cgcttcgaca 19560

gcgtcaacct atacgccact ttcttcccca tggcgcacaa caccgcttca accttggaag 19620

ccatgctgcg caacgacacc aacgaccagt ccttcaacga ctacctctcg gccgccaaca 19680

tgctctaccc catcccggcc aaggccacca acgtgcccat ctccatccca tcgcgcaact 19740

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gctcgggttt cgacccctac tttgtctact cgggctccat cccctacctc gacgggacct 19860

tctacctcaa ccacaccttc aagaaggtct ccatcatgtt cgactcctcg gtcagctggc 19920

ccggcaacga ccggctgctc acgccgaacg agttcgagat caagcgcagc gtcgacgggg 19980

agggctacaa cgtggcccaa tgcaacatga ccaaggactg gttcctcgtc cagatgctct 20040

cccactacaa catcggctac cagggcttcc acgtgcccga gggctacaag gaccgcatgt 20100

actccttctt ccgcaacttc cagcccatga gcaggcaggt ggtcgatgag atcaactaca 20160

aggactacaa ggccgtcacc ctgcccttcc agcacaataa ctcgggcttc accggctacc 20220

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tgctctacgc caactcggcc cacgcgctcg acatgacctt cgaggtggac cccatggatg 20460

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cctaagcatg agcggctcca gcgaacgaga gctcgcggcc atcgtgcgcg acctgggctg 20640

cgggccctac tttttgggca cccacgacaa gcgcttcccg ggctttctcg ccggcgacaa 20700

gctggcctgc gccatcgtca acacggccgg ccgcgagacc ggaggcgtgc actggctcgc 20760

cttcggctgg aacccgcgct cgcgcacctg ctacatgttc gacccctttg ggttctcgga 20820

ccgccggctc aagcagattt acagcttcga gtacgaggcc atgctgcgcc gcagcgccct 20880

ggcctcctcg cccgaccgct gtctcagcct cgagcagtcc actcagaccg tgcaggggcc 20940

cgactccgcc gcctgcggac tcttctgttg catgttcttg catgccttcg tgcactggcc 21000

cgaccgaccc atggacggaa accccaccat gaacttgctg acgggggtgc ccaacggcat 21060

gctacaatcg ccacaggtgc tgcccaccct caggcgcaac caggaggaac tctaccgctt 21120

cctcgcgcgc cactcccctt actttcgctc ccaccgcgcc gccatcgaac acgccaccgc 21180

ttttgacaaa atgaaacaac tgcgtgtatc tcaataaaca gcacttttat tttacatgca 21240

ctggagtata tgcaagttat ttaaaagtcg aaggggttct cgcgctcgtc gttgtgcgcc 21300

gcgctgggga gggccacgtt gcggtactgg tacttgggct gccacttgaa ctcggggatc 21360

accagtttgg gcactggggt ctcggggaag gtctcgctcc acatgcgccg gctcatctgc 21420

agggcgccca gcatgtccgg ggcggagatc ttgaaatcgc agttggggcc ggtgctctgc 21480

gcgcgcgagt tgcggtacac ggggttgcag cactggaaca ccatcagact ggggtacttc 21540

acactagcca gcacgctctt gtcgctgatc tgatccttgt ccagatcctc ggcgttgctc 21600

aggccgaacg gggtcatctt gcacagctgg cgtcccagga agggcacgct ctgaggcttg 21660

tggttacact cgcagtgcac gggcatcagc atcatccccg cgccgcgctg catattcggg 21720

tagagggcct tgacaaaggc cgcgatctgc ttgaaagctt gctgggcctt ggccccctcg 21780

ctgaaaaaca ggccgcagct cttcccgctg aactggttat tcccacaccc ggcatcctgc 21840

acgcagcagc gcgcgtcatg gctggtcagt tgcaccacgc tccgtcccca gcggttctgg 21900

gtcaccttag ccttgctggg ctgctccttc aacgcgcgct gcccgttctc gctggtcaca 21960

tccatctcca ccacgtggtc cttgtggatc atcatcgtcc cgtgcagaca cttgagctgg 22020

ccttccacct cggtgcagcc gtgatcccac agggcgcaac cggtgcactc ccagttcttg 22080

tgcgcaatcc cgctgtggct gaagatgtaa ccttgcaaca tgcggcccat gatggtgcta 22140

aatgctttct gggtggtgaa ggtcagttgc atcccgcggg cctcctcgtt catccaggtc 22200

tggcacatct tctggaagat ctcggtctgc tcgggcatga gcttgtaagc atcgcgcagg 22260

ccgctgtcga cgcggtagcg ttccatcagc acgttcatgg tatccatgcc cttctcccag 22320

gacgagacca gaggcagact cagagggttg cgtacgttca ggacaccggg ggtcgcgggc 22380

tcgacgatgc gttttccgtc cttgccttcc ttcaatagaa ccggcggctg gctgaatccc 22440

actcccacga tcacggcatc ttcctggggc atctcttcgt cggggtctac cttggtcaca 22500

tgcttggtct ttctggcttg cttctttttt ggagggctgt ccacggggag cacgtcctcc 22560

tcggaagacc cggagcccac ccgctgatac tttcggcgct tggtgggcag aggaggtggc 22620

ggcgaggggc tcctctcctg ctccggcgga tagcgcgccg acccgtggcc ccggggcgga 22680

gtggcctctc ggcccatgaa ccggcgcacg tcctgactgc cgccggccat tgtttcctag 22740

gggaagatgg aggagcagcc gcgtaagcag gagcaggagg aggacttaac cacccacgag 22800

caacccaaaa tcgagcagga cctgggcttc gaagagccgg ctcgtctaga acccccacag 22860

gatgaacagg agcacgagca agacgcaggc caggaggaga ccgacgctgg gctcgagcat 22920

ggctacctgg gaggagagga ggatgtgctg ctgaaacacc tgcagcgcca gtccctcatc 22980

ctccgggacg ccctggccga ccggagcgaa acccccctca gcgtcgagga gctgtgtcgg 23040

gcctacgagc tcaacctctt ctcgccgcgc gtacccccca aacgccagcc caacggcacc 23100

tgcgagccca acccgcgtct caacttctat cccgtctttg cggtccccga agccctcgcc 23160

acctatcaca tctttttcaa gaaccaaaag atccccgtct cctgccgcgc caaccgcacc 23220

agcgccgacg cgctcctcgc tttggggccc ggcgcgcgca tacctgatat cgcttccctg 23280

gaagaggtgc ccaagatctt cgaagggctc ggtcgggacg agacgcgcgc ggcgaacgct 23340

ctgaaagaaa cagcagagga agagggtcac actagcgccc tggtagagtt ggaaggcgac 23400

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gtcaacctcc cgcccaaggt catgcgtcgc atcatggatc agctcatcat gccccacatc 23520

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ctcatgctgg ccgtggtcct ggtcaccctt gagctcgaat gcatgcgccg ctttttcagc 23700

gaccccgaga ccctgcgcaa ggtcgaggag accctgcact acactttcag gcacggtttc 23760

gtcaggcagg cctgcaagat ctccaacgtg gagctgacca acctggtctc ctgcctgggg 23820

atcctgcacg agaaccgcct gggccagacc gtgctccact ctaccctgaa gggcgaggcg 23880

cggcgggact atgtccgcga ctgcgtcttt ctctttctct gccacacatg gcaagcggcc 23940

atgggcgtgt ggcagcagtg tctcgaggac gagaacctaa aggagctgga caagcttctt 24000

gctagaaacc ttaaaaagct gtggacgggc ttcgacgagc gcaccgtcgc ctcggacctg 24060

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gacgtgatcg aggacgtgag cggcgagggg ctgctcgagt gccactgtcg ctgcaacctg 24360

tgctccccgc atcgctccct ggtctgcaac ccccagctcc tgagcgagac ccaggtcatc 24420

ggtaccttcg agctgcaagg tccgcaggag tccaccgctc cgctgaaact cacgccgggg 24480

ttgtggactt ccgcgtacct gcgcaaattt gtacccgaag actaccacgc ccatgagata 24540

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aaaaagggta gaggggtcta cctggacccc cagacgggcg aggtgctcaa cccgggtctc 24720

ccccagcatg ccgaggaaga agcaggagcc gctagtggag gagatggaag aagaatggga 24780

cagccaggca gaggaggacg aatgggagga ggagacagag gaggaagaat tggaagaggt 24840

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ggtcacggat acaacctccg ctccggtcaa gcctcctcgt agatgggatc aagtgaaggg 24960

tgacggtaag cacgagcggc agggctaccg atcatggagg gcccacaaag ccgcgatcat 25020

cgcctgcttg caagactgcg gggggaacat cgctttcgcc cgccgctacc tgctcttcca 25080

ccgcggggtg aacatccccc gcaacgtgtt gcattactac cgtcaccttc acagctaaga 25140

aaaagcaagt caaaggagtc gccggaggag gaggaggagg cctgaggatc gcggcgaacg 25200

agcccttgac caccagggag ctgaggaacc ggatcttccc cactctttat gccatttttc 25260

agcagagtcg aggtcagcag caagagctca aagtaaaaaa ccggtctctg cgctcgctca 25320

cccgcagttg cttgtaccac aaaaacgaag atcagctgca gcgcactctc gaagacgccg 25380

aggctctgtt ccacaagtac tgcgcgctca ctcttaaaga ctaaggcgcg cccacccgga 25440

aaaaaggcgg gaattacctc atcgccacca tgagcaagga gattcccacc ccttacatgt 25500

ggagctatca gccccaaatg ggcctggccg cgggcgcctc ccaggactac tccacccgca 25560

tgaactggct cagtgccggc ccctcgatga tctcacgggt caacggggtc cgcagtcatc 25620

gaaaccagat attgttggag caggcggcgg tcacctccac gcccagggca aagctcaacc 25680

cgcgtaattg gccctccacc ctggtgtatc aggaaatccc cgggccgact accgtactac 25740

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gcgcttcccg gtgcccgctc cgcccacaat cgggtataaa aaccctggtg atccgaggca 25860

gaggcacaca gctcaacgac gagttggtga gctcttcgat cggtctgcga ccggacggag 25920

tgttccaact agccggagcc gggagatcct ccttcactcc caaccaggcc tacctgacct 25980

tgcagagcag ctcttcggag cctcgctccg gaggcatcgg aaccctccag tttgtggagg 26040

agtttgtgcc ctcggtctac ttcaacccct tctcgggatc gccaggcctc tacccggacg 26100

agttcatacc gaacttcgac gcagtgagag aagcggtgga cggctacgac tgaatgtccc 26160

atggtgactc ggctgagctc gctcggttga ggcatctgga ccactgccgc cgcctgcgct 26220

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tcttcaccca gcaacccttc ctggtcgagc gggaccgggg cgccaccacc tacaccgtct 26400

actgcatctg tccaaccccg aagttgcatg agaatttttg ttgtactctt tgtggtgagt 26460

ttaataaaag ctaaactctt gcaatactct ggaccttgtc gtcgtcaact caacgagacc 26520

gtctacctca ccaaccagac tgaggtaaaa ctcacctgca gaccacacaa gacctatatc 26580

atctggttct tcgagaacac ctcatttgca gtctccaaca ctcactgcac tagtccatga 26640

actgatgttg attaaaagcc caaaaaccaa tcagcccctt cccccatttc cccatccccc 26700

aattactcat aaaaaataaa tcattggaat taatcattca ataaagatca cttacttgaa 26760

atctgaaagt atgtctctgg tgtagttgtt cagcagcacc tcggtaccct cctcccagct 26820

ctggtactcc agtccccggc gggcggcgaa cttcctccac accttgaaag ggatgtcaaa 26880

ttcctggtcc acaattttca ttgtcttccc tctcagatgg caaagaggct ccgggtggaa 26940

gatgacttca accccgtcta cccctatggc tacgcgcgga atcagaatat ccccttcctc 27000

actcccccct ttgtctcctc cgatggattc aaaaacttcc cccctggggt cctgtcactt 27060

aaactggctg atccaatcac catcaacaat ggggatgtct cacttaaggt gggaggggga 27120

cttgctgtag agcaacagac tggtaaccta agcgtaaacc ctgatgcacc cttgcaagtt 27180

gcaagtgata agctacagct tgctctggct cctccattcg aggtcagaga tggaaagctt 27240

gctttaaagg caggtaatgg attaaaagta ctagataatt ccattactgg attgactgga 27300

ttattgaata cacttgtggt attaactgga aggggaatag gaacggagga attaaaaaat 27360

gacgatggtg taacaaacaa aggagtcggc ttgcgtgtaa gacttggaga tgacggcggg 27420

ctgacatttg ataaaaaggg tgatttagta gcctggaata aaaaagatga caggcgcacc 27480

ctgtggacaa cccctgacac atctccaaat tgcaaaatga gtacagaaaa ggattctaaa 27540

cttacgttga cacttacaaa gtgtggaagt caggttctgg gaaatgtatc tttacttgca 27600

gttacaggtg aatatcatca aatgactgct actacaaaga aggatgtaaa aatatcttta 27660

ctatttgatg agaatggaat tctattacca tcttcgtccc ttagcaaaga ttattggaat 27720

tacagaagtg atgattctat tgtatctcaa aaatataata atgcagttcc attcatgcca 27780

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atcataagta atgtctactt aggtgctctt acctaccaac ctgtaattat cactattgca 27900

tttaatcagg aaactgaaaa tggatgtgct tattctataa catttacctt cacttggcaa 27960

aaagactatt ctgcccaaca gtttgatgtt acatctttta ccttctcata tcttacccaa 28020

gagaacaaag acaaagacta ataaaatgtt ttgaactgaa tttatgaatc tttatttatt 28080

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cgccgctccg tcctgcagga atacaacatg gcagtggtct cctcagcgat gattcgcacc 28500

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aggtagatta agtggcgacc cctcataaac acgctggaca taaacattac ctcttttggc 28740

atgttgtaat tcaccacctc ccggtaccat ataaacctct gattaaacat ggcgccatcc 28800

accaccatcc taaaccagct ggccaaaacc tgcccgccgg ctatacactg cagggaaccg 28860

ggactggaac aatgacagtg gagagcccag gactcgtaac catggatcat catgctcgtc 28920

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ctgccagcag aaagtggctc gggaacagca gatacctttc ctcctgctgt ccttccgctg 29340

ctgacgctca gtcatccaac tgaagtacag ccattcccgc aggttctcca gcagctcctg 29400

tgcatctgat gaaacaaaag tcccgtcgat gcggattccc cttaaaacat cagccaggac 29460

attgtaggcc atcccaatcc agttaatgca tcctgatcta tcatgaagag gaggtggggg 29520

aagaactgga agaaccattt ttattccaag cggtctcgaa ggacgataaa gtgcaagtca 29580

cgcaggtgac agcgttcccc gccgctgtgc tggtggaaac agacagccag gtcaaaaccc 29640

actctatttt caaggtgctc gactgtggct tcgagcagtg gctctacgcg tacatccagc 29700

ataagaatca cattaaaggc tggacctcca tcgatttcat caatcatcag gttacactca 29760

ttcaccatcc ccaggtaatt ctcatttttc cagccttgga ttatttctac aaattgttgg 29820

tgtaagtcca ctccgcacat gtggaaaagt tcccacagcg ccccctccac tttcataatc 29880

aggcagacct tcatattaga aacagatcct gctgctccac cacctgcagc gtgttcaaaa 29940

caacaagatt caatgaggtt ctgccctctg ccctcagctc acgtctcagc gtcagctgca 30000

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tggaataagc tctctttgtg tcaccggtga tgccttccaa taggtgagtg ataaagcgag 30180

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caggaaccac aatgtggtag ctgacagcgt gtcgctcaag catggttagt agagatgaga 30300

gtctgaaaaa cagaaagcat gcactaaacc agagttgcca gtctcactga aggaaaaatc 30360

actctctcca gcagcaaagt gcccactggg tggccctctc ggacatacaa aaatcgatcc 30420

gtgtggttaa agagcagcac agttagctcc tgtcttctcc cagcaaagat cacatcggac 30480

tgggttagta tgcccctgga atggtagtca ttcaaggcca taaatctgcc ttggtagcca 30540

ttaggaatca gcacgctcac tctcaagtga accaaaacca ccccatgcgg aggaatgtgg 30600

aaagattctg ggcaaaaaaa ggtatatcta ttgctagtcc cttcctggac gggagcaatc 30660

cctccagggc tatctatgaa agcatacaga gattcagcca tagctcagcc cgcttaccag 30720

tagacagaga gcacagcagt acaagcgcca acagcagcga ctgactaccc actgacccag 30780

ctccctattt aaaggcacct tacactgacg taatgaccaa aggtctaaaa accccgccaa 30840

aaaaacacac acgccctggg tgtttttcgc gaaaacactt ccgcgttctc acttcctcgt 30900

atcgatttcg tgactcaact tccgggttcc cacgttacgt cacttctgcc cttacatgta 30960

actcagccgt agggcgccat cttgcccacg tccaaaatgg cttccatgtc cggccacgcc 31020

tccgcggcga ccgttagccg tgcgtcgtga cgtcatttgc atcaccgttt ctcgtccaat 31080

cagcgttggc tccgccccaa aaccgttaaa attcaaaagc tcatttgcat attaactttt 31140

gtttactttg tggggtatat tattgatgat g 31171

<210> 16

<211> 7973

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pAdApt26.CMVTO2A1.prM-Env载体

<400> 16

catcatcaat aatatacccc acaaagtaaa caaaagttaa tatgcaaatg agcttttgaa 60

ttttaacggt tttggggcgg agccaacgct gattggacga gaaacggtga tgcaaatgac 120

gtcacgacgc acggctaacg gtcgccgcgg aggcgtggcc tagcccggaa gcaagtcgcg 180

gggctgatga cgtataaaaa agcggacttt agacccggaa acggccgatt ttcccgcggc 240

cacgcccgga tatgaggtaa ttctgggcgg atgcaagtga aattaggtca ttttggcgcg 300

aaaactgaat gaggaagtga aaagcgaaaa ataccggtcc ctcccagggc ggaatattta 360

ccgagggccg agagactttg accgattacg tgggggtttc gattgcggtg tttttttcgc 420

gaatttccgc gtccgtgtca aagtccggtg tttatgtcac agatcagctg acctaggtgg 480

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 540

ttggccattg catacgttgt atccatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 600

aacattaccg ccatgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 660

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 720

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 780

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 840

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 900

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 960

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat 1020

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 1080

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 1140

cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 1200

tcgtttagtt ccctatcagt gatagagaag acgccatcca cgctgttttg acctccatag 1260

aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa gcttggtacc 1320

gccaccatgg gcaaaagatc cgccggcagc atcatgtggc tggccagtct ggctgtcgtg 1380

atcgcctgtg ctggcgccgc tgtgacactg cctagccaca gcacccggaa gctgcagacc 1440

agaagccaga cctggctgga aagcagagag tacaccaagc acctgatccg ggtggaaaac 1500

tggatcttcc ggaaccccgg cttcgccctg gccgctgctg ctattgcttg gctgctgggc 1560

agcagcacca gccagaaagt gatctacctc gtgatgatcc tgctgatcgc ccctgcctac 1620

agcatccggt gtatcggcgt gtccaaccgg gacttcgtgg aaggcatgag cggcggcaca 1680

tgggtggacg tggtgctgga acatggcggc tgcgtgacag tgatggccca ggacaagccc 1740

accgtggaca tcgagctcgt gaccaccacc gtgtccaata tggccgaagt gcggagctac 1800

tgctacgagg ccagcatcag cgacatggcc agcgacagca gatgccctac acagggcgag 1860

gcctacctgg acaagcagtc cgacacccag tacgtgtgca agcggaccct ggtggataga 1920

ggctggggca atggctgcgg cctgtttggc aagggcagcc tcgtgacctg cgccaagttc 1980

gcctgcagca agaagatgac cggcaagagc atccagcccg agaacctgga ataccggatc 2040

atgctgagcg tgcacggcag ccagcactcc ggcatgatcg tgaacgacac cggccacgag 2100

acagacgaga accgggccaa ggtggaaatc acccccaaca gccctagagc cgaggccaca 2160

ctgggcggct ttggatctct gggcctggac tgcgagccta gaaccggcct ggatttcagc 2220

gacctgtact acctgaccat gaacaacaaa cactggctgg tgcacaaaga gtggttccac 2280

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gaggccctgg tggagttcaa ggacgcccac gccaagaggc agaccgtggt ggtgctggga 2400

tctcaggaag gcgccgtgca tacagctctg gctggcgccc tggaagccga aatggatggc 2460

gctaagggca gactgtccag cggccacctg aagtgccggc tgaagatgga caagctgcgg 2520

ctgaagggcg tgtcctacag cctgtgtacc gccgccttca ccttcaccaa gatccccgcc 2580

gagacactgc acggcaccgt gactgtggaa gtgcagtacg ccggcaccga cggcccttgt 2640

aaagtgcctg ctcagatggc cgtggatatg cagaccctga cccctgtggg caggctgatc 2700

accgccaacc ctgtgatcac cgagagcacc gagaacagca agatgatgct ggaactggac 2760

ccacccttcg gcgacagcta catcgtgatc ggcgtgggag agaagaagat cacccaccac 2820

tggcacagaa gcggcagcac catcggcaag gcctttgagg ctacagtgcg gggagccaag 2880

agaatggccg tgctgggaga taccgcctgg gactttggct ctgtgggcgg agccctgaac 2940

tctctgggca agggaatcca ccagatcttc ggcgctgcct tcaagagcct gttcggcggc 3000

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tagatccagg taggtttgag tagtgggcgt ggctaaggtg actataaagg cgggtgtctt 3360

acgagggtct ttttgctttt ctgcagacat catgaacggg actggcgggg ccttcgaagg 3420

ggggcttttt agcccttatt tgacaacccg cctgccggga tgggccggag ttcgtcagaa 3480

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gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 6120

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 6180

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 6240

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 6300

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 6360

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ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 7140

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 7200

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gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 7380

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gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 7620

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 7680

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 7740

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 7800

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat 7860

tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc ttcaagaatt 7920

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pMK.RQ.CMVTO2A1_GL_AO_RFL载体

<400> 18

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caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 6480

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<210> 19

<211> 35606

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pWe.Ad26.dE3.5orf6粘粒

<400> 19

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gtcctttaga caacagccgc aggccaacag actctcggcc attctggagg cggtggtccc 8220

ctctcggacc aaccccacgc acgagaaggt gctggcgatc gtgaacgcgc tggcggagaa 8280

caaggccatc cgtcccgacg aggccgggct ggtgtacaac gccctgctgg agcgcgtggg 8340

ccgctacaac agcacgaacg tgcagtccaa cctggatcgg ctggtgacgg acgtgcgcga 8400

ggccgtggcg cagcgcgagc ggttcaagaa cgagggcctg ggctcgctgg tggcgctgaa 8460

cgccttcctg gcgacgcagc cggcgaacgt gccgcgcggg caggacgatt acaccaactt 8520

tatcagcgcg ctgcggctga tggtgaccga ggtgccccag agcgaggtgt accagtctgg 8580

cccggactac tttttccaga cgagccggca gggcttgcag acggtgaacc tgagccaggc 8640

tttcaagaat ctgcgcgggc tgtggggcgt gcaggcgccc gtgggcgacc ggtcaacggt 8700

gagcagcttg ctgacgccca actcgcggct gctgctgctg ctgatcgcgc ccttcaccga 8760

cagcggcagc gtgaaccgca actcgtacct gggccatctg ctgacgctgt accgcgaggc 8820

cataggccag gcgcaggtgg acgagcagac cttccaggag atcactagcg tgagccgcgc 8880

gctggggcag aacgacaccg acagtctgag ggccaccctg aactttttgc tgaccaatag 8940

acagcagaag atcccggcgc agtacgcact gtcggccgag gaggaaagga ttctgagata 9000

tgtgcagcag agcgtagggc tgttcctgat gcaggagggt gccaccccca gcgccgcgct 9060

ggacatgacc gcgcgcaaca tggaacctag catgtacgcc gccaaccggc cgttcatcaa 9120

taagctgatg gactacttgc accgcgcggc ggccatgaac acggactact ttaccaacgc 9180

catcctgaac ccgcactggc tcccgccgcc ggggttctac acgggcgagt acgacatgcc 9240

cgaccccaac gacgggttcc tgtgggacga cgtggacagc gcggtgttct cgccgacctt 9300

tcaaaagcgc caggaggcgc cgccgagcga gggcgcggtg gggaggagcc cctttcctag 9360

cttagggagt ttgcatagct tgccgggctc ggtgaacagc ggcagggtga gccggccgcg 9420

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cgccatggcc aataacggga tagagagtct ggtggacaaa ctgaaccgct ggaagaccta 9540

cgctcaggac catagggacg cgcccgcgcc gcggcgacag cgccacgacc ggcagcgggg 9600

cctggtgtgg gacgacgagg actcggccga cgatagcagc gtgttggact tgggcgggag 9660

cggtggggtc aacccgttcg cgcatctgca gcccaaactg gggcgacgga tgttttgaat 9720

gaaataaaac tcaccaaggc catagcgtgc gttctcttcc ttgttagaga tgaggcgcgc 9780

ggtggtgtct tcctctcctc ctccctcgta cgagagcgtg atggcgcagg cgaccctgga 9840

ggttccgttt gtgcctccgc ggtatatggc tcctacggag ggcagaaaca gcattcgtta 9900

ctcggagctg gctccgcagt acgacaccac tcgcgtgtac ttggtggaca acaagtcggc 9960

ggacatcgct tccctgaact accaaaacga ccacagcaac ttcctgacca cggtggtgca 10020

gaacaacgat ttcacccccg ccgaggccag cacgcagacg ataaattttg acgagcggtc 10080

gcggtggggc ggtgatctga agaccattct gcacactaac atgcccaatg tgaacgagta 10140

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cgagggaaac ttttccgaga ccatgaccat agacctgatg aacaacgcca tcttggaaaa 10320

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cagcagaaat ttcaagctgg gctgggaccc ggtgaccaag ctggtgatgc caggggtcta 10440

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cagaatcatg tatgaggatc tagaaggtgg caacatcccc gccctccttg atgtgcccaa 10620

gtacttggaa agcaagaaga aagttgaaga cgaaactaaa aatgcagctg cggccacagc 10680

cgatacaacc actaggggtg atacatttgc aactccagcg caagagacag cagctgataa 10740

gaaggtagaa gtcttgccca ttgaaaagga tgagagtggt agaagttaca acctgatcca 10800

ggggacccac gacacgctgt accgcagttg gtacctgtcc tatacctacg gggaccccga 10860

gaagggggtg cagtcgtgga cgctgctcac caccccggac gttacctgcg gcgcggagca 10920

agtctactgg tcactgccgg acctcatgca agaccccgtc accttccgct ccacccagca 10980

agtcagcaac taccccgtgg tcggcgccga gctcatgccc ttccgcgcca agagctttta 11040

caacgacctc gccgtctact cccagctcat ccgcagctac acctccctca cccacgtctt 11100

caaccgcttc cccgacaacc agatcctctg ccgcccgccc gcgcccacca tcaccaccgt 11160

cagtgaaaac gtgcctgctc tcacagatca cgggacgcta ccgctgcgca gcagtatccg 11220

cggagtccag cgagtgaccg tcactgacgc ccgtcgccgc acctgtccct acgtctacaa 11280

ggccctgggc atagtcgcgc cgcgcgtgct ttccagtcgc accttctaaa aaaatgtcta 11340

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gaggagccaa gaagcgctcc cagcagcacc ccgtccgcgt ccgcggccac ttccgcgctc 11460

cctggggcgc atacaagcgc gggcggactt ccaccgccgc cgtgcgcacc accgtcgacg 11520

acgtcatcga ctcggtggtc gccgacgcgc gcaactatac ccccgccccc tccaccgtgg 11580

acgcggtcat cgacagcgtg gtggccgacg cgcgcgacta tgccagacgc aagagccggc 11640

ggcgacggat cgccaggcgc caccggagca cgcccgccat gcgcgccgcc cgggctctgc 11700

tgcgccgcgc cagacgcacg ggccgccggg ccatgatgcg agccgcgcgc cgcgctgcca 11760

ctgcacccac ccccgcaggc aggactcgca gacgagcggc cgccgccgcc gctgcggcca 11820

tctctagcat gaccagaccc aggcgcggaa acgtgtactg ggtgcgcgac tccgtcacgg 11880

gcgtgcgcgt gcccgtgcgc acccgtcctc ctcgtccctg atctaatgct tgtgtcctcc 11940

cccgcaagcg acgatgtcaa agcgcaaaat caaggaggag atgctccagg tcgtcgcccc 12000

ggagatttac ggaccacccc aggcggacca gaaaccccgc aaaatcaagc gggttaaaaa 12060

aaaggatgag gtggacgagg gggcagtaga gtttgtgcgc gagttcgctc cgcggcggcg 12120

cgtaaattgg aaggggcgca gggtgcagcg cgtgttgcgg cccggcacgg cggtggtgtt 12180

cacgcccggc gagcggtcct cggtcaggag caagcgtagc tatgacgagg tgtacggcga 12240

cgacgacatc ctggaccagg cggcggagcg ggcgggcgag ttcgcctacg ggaagcggtc 12300

gcgcgaagag gagctgatct cgctgccgct ggacgaaagc aaccccacgc cgagcctgaa 12360

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ggaggacgtg ctggacaccg tgaaaatgga tgtggagccc gaggtcaagg tgcgccccat 12540

caagcaggtg gcgccgggcc tgggcgtgca aaccgtggac attcagatcc ccaccgacat 12600

ggatgtcgac aaaaaaccct cgaccagcat cgaggtgcaa accgacccct ggctcccagc 12660

ctccaccgct accgtctcca cttctaccgc cgccacggct accgagcctc ccaggaggcg 12720

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ccgaattacc gaggaagatc ccgccgcagg agaggcatgg caggcagcgg cctgaaccgc 13080

cgccggcggc gggccatgcg caggcgcctg agtggcggct ttctgcccgc gctcatcccc 13140

ataatcgccg cggccattgg cacgatcccg ggcatagctt ccgttgcgct gcaggcgtcg 13200

cagcgccgtt gatgtgcgaa taaagcctct ttagactctg acacacctgg tcctgtatat 13260

ttttagaatg gaagacatca attttgcgtc cctggctccg cggcacggca cgcggccgtt 13320

catgggcacc tggaacgaga tcggcaccag ccagctgaac gggggcgcct tcaattggag 13380

cagtgtctgg agcgggctta aaaatttcgg ctcgacgctc cggacctatg ggaacaaggc 13440

ctggaatagt agcacggggc agttgttgag ggaaaagctc aaagaccaga acttccagca 13500

gaaggtggtg gacgggctgg cctcgggcat taacggggtg gtggacatcg cgaaccaggc 13560

cgtgcagcgc gagataaaca gccgcctgga cccgcgaccg cccacggtgg tggagatgga 13620

agatgcaact cttccgccgc ccaagggcga gaagcggccg cggcccgacg cggaggagac 13680

gatcctgcag gtggacgagc cgccctcgta cgaggaggcc gtcaaggccg gcatgcccac 13740

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gaccgccgtg cgccgcgtcc ccgcccgccg ccaggcccag aactggcaga gcacgctgca 13920

cagtatcgtg ggcctgggag tgaaaagtct gaagcgccgc cgatgctatt gagagagagg 13980

aaagaggaca ctaaagggag agcttaactt gtatgtgcct taccgccaga gaacgcgcga 14040

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cctcggagta cctgagcccg ggtctggtgc agtttgcccg cgccaccgac acgtacttca 14160

gcctgggcaa caagtttagg aaccccacgg tggccccgac ccacgatgtg accacggacc 14220

ggtcccagcg tctgacgctg cgcttcgtgc ccgtggatcg cgaggacacc acgtactcgt 14280

acaaggcgcg cttcactctg gccgtgggcg acaaccgggt gctagacatg gccagcactt 14340

actttgacat ccgcggcgtc ctggaccgcg gtcccagctt caaaccctac tcgggcacgg 14400

cctacaacag cctggctccc aagggtgccc ccaatcccag tcagtgggaa acaaaagaaa 14460

agcaaggaac tactggagga gtgcagcaag aaaaagatgt cacaaaaaca tttggtgtgg 14520

ctgccaccgg cggaattaat ataacaaacc agggtctgtt actaggaact gacgaaaccg 14580

ctgagaatgg caaaaaagac atttatgcag acaagacttt ccagccagaa cctcaagttg 14640

gagaagaaaa ctggcaggaa aatgaagcct tctatggagg aagggctctt aaaaaggaca 14700

ctaaaatgaa accatgctat ggatcttttg ctagacctac taatgagaaa ggaggtcagg 14760

caaagttcaa accagttaat gaaggagaac aacctaaaga tctggatata gattttgctt 14820

actttgacgt ccctggcgga agtcctccag caggtggtag tggggaagaa tacaaagcag 14880

atataatttt gtacactgaa aatgttaatc ttgaaacacc agacactcat gtggtttaca 14940

agccaggaac ttcagataac agttcagaaa tcaatctggt tcagcagtcc atgccaaaca 15000

gacccaacta cattggcttt agggacaact ttgtaggtct catgtattac aacagcaccg 15060

gaaatatggg tgtgctggct ggtcaggctt ctcagttgaa cgctgtggtc gacttgcaag 15120

acagaaacac cgagttatct taccagctat tgctagattc tctgggtgac agaaccagat 15180

actttagcat gtggaactct gcggtggaca gttacgatcc agatgtcagg atcattgaaa 15240

atcacggtgt ggaagatgaa cttccaaact attgcttccc attgaatggc actggaacca 15300

attccactta tcaaggtgta aagattacaa atggtaatga tggtgctgaa gaaagtgagt 15360

gggagaaaga cgatgcaatt tctagacaaa accaaatctg caagggcaat gtctacgcca 15420

tggagatcaa cctgcaggcc aacctgtgga agagttttct gtactcgaac gtggccctgt 15480

acctgcccga ctcctacaag tacacgccgg ccaacgtcaa gctgcccgcc aacaccaaca 15540

cctacgagta catgaacggc cgcgtggtag ccccctcgct ggtggacgcc tacatcaaca 15600

tcggcgcccg ctggtcgttg gaccccatgg acaacgtcaa ccccttcaac caccaccgca 15660

atgcgggcct gcgctaccgc tccatgctgc tgggcaacgg ccgctacgtg cccttccaca 15720

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cctacgagtg gaacttccgc aaggacgtca acatgatcct gcagagttcc ctcggcaacg 15840

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tccccatggc gcacaacacc gcttcaacct tggaagccat gctgcgcaac gacaccaacg 15960

accagtcctt caacgactac ctctcggccg ccaacatgct ctaccccatc ccggccaagg 16020

ccaccaacgt gcccatctcc atcccatcgc gcaactgggc cgccttccgc ggctggagtt 16080

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aggtctccat catgttcgac tcctcggtca gctggcccgg caacgaccgg ctgctcacgc 16260

cgaacgagtt cgagatcaag cgcagcgtcg acggggaggg ctacaacgtg gcccaatgca 16320

acatgaccaa ggactggttc ctcgtccaga tgctctccca ctacaacatc ggctaccagg 16380

gcttccacgt gcccgagggc tacaaggacc gcatgtactc cttcttccgc aacttccagc 16440

ccatgagcag gcaggtggtc gatgagatca actacaagga ctacaaggcc gtcaccctgc 16500

ccttccagca caataactcg ggcttcaccg gctacctcgc acccaccatg cgccaggggc 16560

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cttcgagtac gaggccatgc tgcgccgcag cgccctggcc tcctcgcccg accgctgtct 17220

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tgtatctcaa taaacagcac ttttatttta catgcactgg agtatatgca agttatttaa 17580

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gagatcttga aatcgcagtt ggggccggtg ctctgcgcgc gcgagttgcg gtacacgggg 17820

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tggatcatca tcgtcccgtg cagacacttg agctggcctt ccacctcggt gcagccgtga 18360

tcccacaggg cgcaaccggt gcactcccag ttcttgtgcg caatcccgct gtggctgaag 18420

atgtaacctt gcaacatgcg gcccatgatg gtgctaaatg ctttctgggt ggtgaaggtc 18480

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atcagcacgt tcatggtatc catgcccttc tcccaggacg agaccagagg cagactcaga 18660

gggttgcgta cgttcaggac accgggggtc gcgggctcga cgatgcgttt tccgtccttg 18720

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aagcaggagc aggaggagga cttaaccacc cacgagcaac ccaaaatcga gcaggacctg 19140

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gggcccggcg cgcgcatacc tgatatcgct tccctggaag aggtgcccaa gatcttcgaa 19620

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ggtcacacta gcgccctggt agagttggaa ggcgacaacg ccaggctggc cgtgctcaag 19740

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cgatgatctc acgggtcaac ggggtccgca gtcatcgaaa ccagatattg ttggagcagg 21960

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gttaaaattc aaaagctcat ttgcatatta acttttgttt actttgtggg gtatattatt 27480

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gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 29040

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agcgctgact tccgcgtttc cagactttac gaaacacgga aaccgaagac cattcatgtt 29580

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cggaatggac gatatcccgc aagaggcccg gcagtaccgg cataaccaag cctatgccta 35460

cagcatccag ggtgacggtg ccgaggatga cgatgagcgc attgttagat ttcatacacg 35520

gtgcctgact gcgttagcaa tttaactgtg ataaactacc gcattaaagc ttatcgatga 35580

taagcggtca aacatgagaa ttgcgg 35606

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TetO序列

<400> 20

tccctatcag tgatagaga 19