巨大戟二萜化合物及其提取方法与应用
阅读说明：本技术 巨大戟二萜化合物及其提取方法与应用 (Euphorbia joridoides diterpene compound and extraction method and application thereof ) 是由 占扎君 章璇 章乐 马列峰 单伟光 于 2020-12-11 设计创作，主要内容包括：如式1或式2所示的巨大戟二萜化合物,化合物1、2的安全性良好,其对不同细胞的细胞毒均较小(IC_(50)>20μM),具有良好的安全性；当给予不同剂量的化合物1、2时,能有效增强阿霉素对MCF-7/Adr的抑制,逆转倍数可达6.5至21.5不等。上述两种新型二萜能明显逆转耐药肿瘤细胞MCF-7/Adr的耐药性,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,在抗肿瘤多药耐药中具有较好的应用前景。(The ingenol compound shown in formula 1 or formula 2 has good safety of compound 1 and 2, and has small cytotoxicity (IC) to different cells 50 >20 mu M), has good safety; when different doses of the compounds 1 and 2 are administered, the effect can be effectively increasedThe inhibition of strong adriamycin on MCF-7/Adr has the reversal multiple of 6.5 to 21.5. The two novel diterpenoids can obviously reverse the drug resistance of drug-resistant tumor cells MCF-7/Adr, enhance the sensitivity of the tumor cells to chemotherapeutic drugs and have better application prospect in anti-tumor multi-drug resistance.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及两个新的巨大戟二萜化合物及其提取方 法和其作为活性成分在制备逆转肿瘤细胞多药耐药性的药物中的应用。
背景技术
癌症是影响人类健康的重大疾病之一，随着人口的老龄化趋势及人口快速增 长，全球的癌症发病数和死亡数也在快速增长。癌症正在成为人口死亡的重要原 因，并且将是人类提高预期寿命的重要障碍。现有的癌症治疗手段中，化学疗法 是重要手段之一。然而，在化疗药物使用过程中，一旦肿瘤细胞获得耐药性，则 肿瘤化疗的效果将显著降低。根据统计，在癌症化疗过程中，约有90％的患者由 于多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的产生而不能达到预期的治疗效 果。寻找低毒有效逆转肿瘤细胞耐药性，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，从 而达到更好治疗与预后效果的需求显得越来越突出。因此，探索肿瘤MDR抑制剂， 显得尤为重要。
在抗肿瘤多药耐药机制中，ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporterssuper family)介导的肿瘤多药耐药最普遍，其中P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)是产生多药耐药性的主要靶点，也是目前研究热点。 以P-gp为靶点的肿瘤多药耐药逆转剂，以发展顺序分为以下几类：以维拉帕米 (verapamil)为代表的第一代P-gp抑制剂，这类抑制剂特异性结合率低，对人 体毒副作用强；以VX-710等为代表的在一代抑制剂结构基础上改造而来的第二 代P-gp抑制剂，该类药物干扰体内正常代谢，限制了临床应用。第三代P-gp抑制剂的代表药物为tariguidar，对P-gp蛋白具有较高的亲和力，但此类药物 吸收不良，临床效果较差。因此，针对P-gp的抑制剂亟需一种新结构。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供两个新的巨大戟二萜化合物及其 提取方法和其以药学上可接受的盐或酯作为活性成分在制备逆转肿瘤细胞多药 耐药性的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
如式1或式2所示的巨大戟二萜化合物，
具体地说是具有逆转肿瘤细胞多药耐药作用的巨大戟二萜kansuininol A(1) 和kansuininol B(2)，其结构分别如式1和式2所示，其为侧链含有一个2,3- 二甲基丁酰基(其C-3或C-20位被2,3-二甲基丁酰基取代)的巨大戟烷型二萜。
本发明还提供一种式1或式2所示的巨大戟二萜化合物的提取方法，所述方 法采用乙醇浸提，提取液减压浓缩得到提取物；所得提取物依次进行萃取、硅胶 柱层析、MCI柱层析，分离得到式1或式2所示的巨大戟二萜化合物，具体包括 如下步骤：
(1)取甘遂块根粉碎，室温条件下，用体积分数为95％的乙醇水溶液浸 提，合并提取液，减压浓缩，得甘遂块根提取物；所述的甘遂2017年4月采购 自亳州，产地为山西侯马，经鉴定为Euphorbia kansui，样品标本有浙江工业 大学药学院天然药物研究所保藏，编号为No.20170422。
(2)将步骤(1)得到的甘遂块根提取物用水A溶解后，用石油醚A萃取两 次，合并有机相；所述水A的体积以甘遂块根提取物的质量计为1.95～2mL/g， 优选2mL/g；每次萃取所用石油醚A与水A的体积比为1:1；水A就是指水，此 处用水A表示只是为了方便描述，无特殊含义；石油醚A就是指石油醚，此处用 石油醚A表示只是为了方便描述，无特殊含义；
(3)取步骤(2)中所得有机相减压浓缩，硅胶柱层析，依次用体积比为 20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1的石油醚与乙酸乙酯的混合溶液进行 梯度洗脱，每个梯度分别洗脱2个柱体积；
(4)取步骤(3)中体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合液的洗脱部分， 减压浓缩蒸干，以MCI为填料，依次以体积分数分别为45％、55％、65％、75％、 85％、95％的甲醇水溶液以及甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，并分别收集洗脱部分；
(5)合并步骤(4)中体积分数为85％的甲醇水溶液的洗脱部分，减压浓缩、 干燥后，通过200-300目硅胶柱层析，依次用体积比为5:1、4:1、3:1、2:1与 1:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液进行第一次梯度洗脱，分别收集第一次梯度 洗脱液，以体积比为2:1的石油醚和丙酮的混合溶液为展开剂进行TLC检测所述 第一次梯度洗脱液，合并Rf值为0.3～0.4的第一次梯度洗脱液，减压蒸干得 Fr.A，Fr.A经500目硅胶柱，再用体积比为5:1的石油醚和丙酮混合溶液进行 第二次洗脱，收集第二次洗脱液，合并Rf值为0.3的第二次洗脱液，蒸干得到 化合物2；
合并Rf值为0.5的第一次梯度洗脱液，减压蒸干得Fr.B，Fr.B通过半制备 色谱，流动相为体积分数为85％的甲醇水溶液，色谱柱为C-18ODS(十八烷基 硅烷键合硅胶)，收集tR＝21min的峰，蒸干得到化合物1。
优选地,步骤(1)用体积分数为95％的乙醇水溶液浸提3次，每次7天。
进一步优选地,步骤(1)每次浸提的乙醇水溶液的体积以所述甘遂块根的质 量计为2L/kg
优选地，步骤(3)中所述硅胶柱为100-200目硅胶柱，8cm。
本发明还提供一种上述式1或式2所示的巨大戟二萜化合物在制备逆转肿瘤 多药耐药性的药物中的应用。
优选地，所述耐药性是肿瘤对阿霉素的耐药性。
优选地，所述肿瘤为MCF-7细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：化合物1、2的安全性良好， 其对不同细胞的细胞毒均较小(IC50>20μM)，具有良好的安全性；当给予不同 剂量的化合物1、2时，能有效增强阿霉素对MCF-7/Adr的抑制，逆转倍数可达 6.5至21.5不等。上述两种新型二萜能明显逆转耐药肿瘤细胞MCF-7/Adr的耐 药性，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，在抗肿瘤多药耐药中具有较好的应用 前景。
具体实施方式
：
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅 限于此。
实施例1
(1)室温条件下，将粉碎后的甘遂块状根(5kg)粉末用体积百分比95％ 乙醇10L浸泡提取3次，每次7天，合并提取液，浓缩后得到提取物491g。 所述的甘遂2017年4月采购自亳州，产地为山西侯马，经鉴定为Euphorbia kansui，样品标本有浙江工业大学药学院天然药物研究所保藏，编号为 No.20170422。
(2)将步骤(1)得到的甘遂块根提取物491g，加入1L水溶解，用石油 醚萃取两次，每次使用1L石油醚，减压浓缩有机相，得到有机相(108g)。
(3)取步骤(2)中有机相，采用100-200目硅胶的硅胶为柱层析填料柱层 析，柱体积为500mL，用石油醚/乙酸乙酯混合液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱 的步骤为：依次用石油醚/乙酸乙酯体积比为20:1；15:1；10:1；5:1；2:1；1:1； 0:1的混合液，每个梯度分别洗脱1000mL；
(4)取步骤(3)过程中石油醚/乙酸乙酯体积比为2:1洗脱部分，减压浓缩 蒸干，以250mL柱体积的MCI为柱层析填料，以体积百分比分别为45％；55％；65％； 75％；85％；95％；100％的甲醇水溶液为梯度洗脱条件，每个梯度洗脱两个柱体积， 收集、合并体积分数为85％的甲醇水溶液洗脱所得溶液。上述溶液减压浓缩干燥 后，通过200-300目硅胶柱层析，依次用体积比5:1；4:1；3:1；2:1；1:1的石 油醚/乙酸乙酯洗脱液洗脱，用石油醚/丙酮2:1的展开剂为条件进行TLC检测， 254nm紫外下检测斑点，并在TLC上喷洒10％硫酸乙醇，加热显色，将Rf值相 近、显色相似的流分合并，合并Rf值为0.3～0.4的部分，减压蒸干得到Fr.A， 合并Rf值为0.5部分，减压蒸干得Fr.B。
(5)取(4)步骤的Fr.A，利用200mL柱体积500目硅胶，以石油醚/丙酮 溶液5:1为洗脱条件洗脱，经石油醚/丙酮2:1的展开剂为条件进行TLC检测， 254nm紫外下检测斑点，并在TLC上喷洒10％硫酸乙醇，加热显色，将Rf为0.3 的流分合并蒸干得到化合物2(22.3mg)；Fr.B部分通过半制备色谱(流动相为 体积分数85％甲醇/水溶液)，色谱柱为C-18ODS(十八烷基硅烷键合硅胶)，收 集tR＝21min的峰，蒸干得到化合物1(4.9mg)；
化合物1和化合物2的理化性质及波普数据
化合物1：无色蜡状；HR-ESI-MS＝m/z 469.2539([M+Na]+，计算值为 469.2561)，确定其分子式为C26H38O6；旋光[α]20 D＝+14(c＝0.118,MeOH)；红 外(KBr)νmax 3411,2929,1710cm-1。氢谱及碳谱见表1。
化合物2：无色蜡状；HRESI-MS[M+Na]+＝469.2539(计算值为469.2561)， 确定其分子式为C26H38O6；旋光[α]20 D＝-46(c＝0.118,CHCl3)；红外(KBr)νmax 3435, 2960,1725cm-1。氢谱及碳谱见表1。
表1化合物1和2的核磁数据
1H-NMR:600MHz；13C-NMR:150MHz；溶剂：CDCl3
实施例2:化合物逆转P-gp介导的肿瘤细胞多药耐药作用
利用细胞培养液将实施例1中制备的化合物1和2分别配制成20μM高浓度 溶液，评价其对耐阿霉素的MCF-7/Adr细胞株的抑制作用，结果显示加入上述两 个化合物后，加药组(化合物1和2)细胞数量分别为空白对照的141％和153％， 证实两个化合物的对MCF-7/Adr细胞无明显毒活，与文献中链接短支链的此类二 萜化合物在高浓度下对细胞具有促增殖作用相吻合。
选择对数生长的MCF-7/Adr细胞，接种于96孔板，细胞密度约为7×103/孔， 实验组为化合物(1或5μM)与系列浓度梯度的阿霉素(0.25,0.5,1,2,4,8, 16,32μM)联合用药，阳性对照组为维拉帕米(5μM)与系列浓度阿霉素联合 用药，阴性对照组为阿霉素(4,8,16,32,64,128μM)，每组3个复孔，接 种于96孔板，在培养箱中孵育48h。测定阿霉素对MCF-7/Adr的IC50(Adr)、 加入待测物或逆转剂阳性对照药后阿霉素的IC50(P-gp抑制剂+ADR)。计算IC50 (ADR)与IC50(Pgp抑制剂+ADR)比值，即得逆转倍数(reversal fold)。实验 结果见表2。
实验结果显示，在此评估方法中，假白榄烷类二萜(化合物1、2)在低浓 度(1μM)和高浓度(5μM)下均具有显著的逆转肿瘤多药耐药性活性，其有 效浓度(1μM,5μM)远低于细胞毒性(在20μM浓度下，化合物1和2均未 能抑制细胞增殖)。
表2化合物1和2在MCF-7/ADR中的细胞毒和逆转能力
结果显示，本发明采用阿霉素耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7/Adr作为活性筛 选细胞株。初步研究发现化合物1、2在20μM浓度下对该细胞无抑制作用，证明 其固有毒性可忽略不计。以MTT法分别测定化合物1、2与阿霉素联合用药、阿霉 素单独给药、以及阳性对照维拉帕米与阿霉素联用时，阿霉素对该细胞的IC50值， 考查其分别对该细胞的逆转指数，探究这两个化合物对肿瘤多药耐药的逆转作用。 进一步研究逆转多药耐药实验表明，化合物1和2在低浓度(1μM)和高浓度(5μM) 下均能有效改善阿霉素对MCF-7/Adr细胞的抑制作用，逆转指数(reversal fold) 可达6.5至21.5不等。
上述研究结果表明，化合物1和2可逆转P-gp介导的肿瘤细胞多药耐，增强化 疗药物的疗效。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种蒽醌类化合物及其从刺果毛茛中的制备方法