阅读说明：本技术 用于制造3d细胞结构的生物打印机 (Bio-printer for manufacturing 3D cell structures ) 是由 艾丹·帕特里克·奥马霍尼 朱里奥·塞萨尔·卡德拉·里贝罗 塞缪尔·詹姆斯·迈尔斯 基兰·约瑟夫 于 2018-12-07 设计创作，主要内容包括：一种用于制造三维(3D)细胞结构的生物打印机,该生物打印机包括一个或多个用于容纳流体样品的储存容器；用于容纳样品容器并支撑将在其上打印3D细胞结构的基板的打印台；与一个或多个储存容器流体连通的样品加载系统,所述的样品加载系统配置成将样品从样品容器加载到一个或多个储存容器中；与样品加载系统流体连通的泵,所述的泵配置成将样品从样品容器中抽出并将样品泵入一个或多个储存容器中；以及与一个或多个储存容器流体连通的液滴分配系统,所述的液滴分配系统配置成将来自一个或多个储存容器的样品液滴打印到由打印台支撑的基板上。(A bioprinter for fabricating a three-dimensional (3D) cellular structure, the bioprinter comprising one or more storage containers for holding a fluid sample; a printing station for receiving the sample container and supporting a substrate on which the 3D cell structure is to be printed; a sample loading system in fluid communication with the one or more storage containers, the sample loading system configured to load a sample from the sample container into the one or more storage containers; a pump in fluid communication with the sample loading system, the pump configured to draw sample from the sample container and pump the sample into the one or more storage containers; and a droplet dispensing system in fluid communication with the one or more storage containers, the droplet dispensing system configured to print sample droplets from the one or more storage containers onto a substrate supported by the print station.)

具体实施方式

如图中所示，本发明公开了用于制造3D细胞结构的生物打印机10。生物打印机10包括样品加载系统20，用于将样品100从样品容器110加载到储存容器120中；以及与储存容器120流体连通的选择阀30，用于将样品100引导到储存容器120中；与储存容器120流体连通的液滴分配系统25，液滴分配系统25适于将样品液滴101从储存容器120打印到基板125上；控制系统40，以控制样品加载系统20，选择阀30和液滴分配系统40的操作；层状空气流系统50；壳体60，用以容纳样品加载系统20，选择阀30，液滴分配系统40和层状空气流系统50。

样品加载系统

参照图1至图4，样品加载系统20适于获取容纳在一个或多个样品容器110中的样品100，并且与一个或多个储存容器120流体连通。储存容器120被构造成存储来自样品容器110的样品100。样品容器110可以是标准色谱小瓶111，其具有盖112，该盖112包括在实验室中用于存储和运输样品的橡胶隔膜113。小瓶111通常是由玻璃，塑料或任何能够使小瓶111中保持无菌环境的合适材料制成。小瓶111可以制成多种尺寸以容纳各种样品100，通常较小的小瓶存储约5ml，而较大的小瓶存储约10ml。取决于将由生物打印机10打印的3D细胞构造，样品加载系统20可包括一个样品容器110或多个样品容器110。

每个储存容器120适于存储从一个样品容器110接收的样品100。每个储存容器120由包裹在储存容器的外壳121内部的细长管122制成。细长管122可被盘绕并封装在外壳121中。细长管122是挠性管122的线轴。在某些实施例中，挠性管122由聚四氟乙烯(PTFE)管或其他合适的材料制成，例如氟化乙烯丙烯(FEP)，乙基三氟乙烯(ETFE)，聚醚醚酮(PEEK)，硅树脂，热塑性弹性体(TPE)或不锈钢。在替代实施例中，每个储存容器120具有进口，出口和用于存储样品100的存储腔。生物印刷机10可以包括一个或多个储存容器120，其对应于一个或多个单独且不同的样品100。

每个样品容器110中的样品100可以是细胞悬浮液，水，乙醇，生物墨水，活化剂，清洁溶液，冲洗液，细胞培养基或分散在溶液中的药物，下面将对其进行详细描述。储存在样品容器110中的样品100可以是无菌的，也可以不是无菌的。

样品加载系统20包括至少一个针130，该针130可***每个样品瓶111中并且与一个或多个储存容器120流体连通。在附图所示的实施例中，有单个针130。针130为50毫米长，斜面尖端，规格16，由不锈钢制成。针130可以与样品加载系统20可操作地相关联，以从每个小瓶111中移除样品100。针130可沿z方向移动，以通过第一定位单元140将针130从上方***小瓶111中。第一定位单元140是微型电动线性致动器140a，其行程为60mm，由连接到步进电动机140c的丝杠140b驱动，如图3和图4所示。

生物打印机10包括流量选择阀30，该流量选择阀30将从样品容器110提取的样品100引导至储存容器120中。这样使得从每个小瓶111取出的每个样品100被保持在单独的储存容器120中以分离每个样品100以维持无菌条件。

生物打印机10的样品加载系统20和液滴分配系统25通过管道150连接。管道150基于其期望的位置和功能要求而从多种不同的材料，直径和长度中选择。将样品加载系统20连接到每个储存容器120的管道150是内径为2.16mm、外径为3.175mm的PTFE管。每个储存容器120中的细长管122是1/8”PTFE管。

为了用样品100灌注每个储存容器120，使用泵160将样品100从小瓶111移至选择阀30，并通过选择阀30。泵160可以是容积泵，例如蠕动泵，隔膜泵或注射泵。泵160连接到选择阀30，该选择阀30包括合适的通道31，用于将样品100引导到合适的(和隔离的)保存容器120中。阀30是由VICI Valeo Instruments Co Inc.制造的低压流通选择阀30。流量选择阀30包括多条通道31，例如4、6、8、10、12或16条通道。流量选择阀30具有连接到泵160和针130的公共入口。当选择通道31时，选定的通道31流体地连接到泵160和针130。当未选择通道31时，该通道31与来自压力调节器歧管170中的空气压力调节器171的压缩空气流体连接。每个储存容器120或通道31中的压力由调节器歧管170中的相应调节器171独立设置。调节器歧管170中的每个调节器171使用4mm尼龙管和1/8”PTFE管连接到选择阀30。调节器歧管170中的压力调节器171的数量等于储存容器120或通道31的数量。这允许为液滴分配系统25的每个阀252独立地设置压力，这意味着生物打印机10可以支持每个阀252中的各种不同的流体粘度。

样品加载系统20的调节器歧管170中的压力调节器171独立控制进料到选择阀30的每个通道31和储存容器120中的压力。压力调节器歧管170可操作地连接到压缩空气供应入口180和静态压力储存器(未示出)。生物打印机10在壳体60内包括空气过滤器190，用于过滤来自压缩空气供应入口180的空气。泵160可操作地连接至针130，以将样品容器110中的样品100转移至储存容器120。泵160可以是可逆操作的，以将样品100重新悬浮在样品容器110中。

密封件114由每个样品容器110的橡胶隔膜113形成，并且在第一定位单元140的操作时，使用由第一定位单元140驱动的针130刺穿。第一定位单元140由控制系统40和机器人线性致动器140a操作。控制系统40通过使线性致动器140a上的步进电动机140c移动期望的步数来定位第一定位单元140。第一定位单元140可操作地连接到针130，以将针130定位成刺穿样品容器110或者不刺穿样品容器110。在选择阀30上选择通道31，打开微型电磁阀252，并且打开泵160以通过针130，管道150，泵160，选择阀30，将样品100从样品瓶111中移至储存容器120中。然后关闭泵160，并关闭微电磁阀252。在流量选择阀30上取消选择通道31。然后通过调节器歧管170的相应调节器171设置压力，并重复触发微型电磁阀252，直到所有空气都从管路150中排出，并且将样品100从储存容器120中喷出。重复上述过程，以灌注将要使用的每个储存容器120。

样品加载系统20还包括第二定位单元141，该第二定位单元141可操作地连接至针130和液滴分配单元25的打印头250，第二定位单元141用于将针130和打印头250定位在样品容器110和基板125针上方的二维空间中。第二定位单元141被配置为使针130和打印头250沿着轨道142移动。第二定位单元141可以是三轴运动控制台单元。第二定位单元141是行程为300mm的皮带驱动线性致动器141a。皮带141b是齿形皮带，并且由步进马达141c驱动。

为了打印样品液滴101，按照如上所述准备(primed)一个或多个储存容器120和微型电磁阀252，并且从液滴分配系统25的打印头250的一个或多个喷嘴253喷射样品液滴101，以由计算机控制软件40控制的预定方式沉积在基板125上。该液滴分配系统25在下面更详细地描述。

为了清洁生物打印机10，利用如上所述使用样品加载系统20，样品容器111中的清洁剂可以使用针130移出，并通过管道150，选择阀30，储存容器120。清洁剂从液滴分配系统25的喷嘴253喷射到废液容器205中。对于其他清洁化学品(例如70％的乙醇和水)重复此过程。当所有水已通过管线冲洗并且仅空气从液滴分配系统25的喷嘴253喷出时，生物打印机10的清洁完成，这将在下面详细说明。

为了将样品重新悬浮在样品瓶111中，可以使用第一定位单元140和第二定位单元141将针130移向相应的样品瓶111，直到针130刺穿样品瓶的隔膜113并接触样品100。使用蠕动泵160将样品瓶111中的含细胞样品100从样品瓶111中移出，通过针130和管道150。反向使用蠕动泵160，将含有细胞的样品100沿相反的方向(即朝向样品瓶111)移动。根据需要，可以重复进行这种通过针130和导管将含细胞的样品从样品瓶111中移出和移向样品瓶111的过程。

样品盘

样品容器110可以容纳在可移动样品托盘200中，可移动样品托盘200可以是无菌的。设想可以在可移动样品托盘200中容纳多达14个小瓶111，但是可以在可移动样品托盘200中容纳任何合适数量的小瓶111。可移动样品托盘200具有一个或多个样品容器壳体201，其适于存储不同尺寸的样品容器110，例如小瓶111和废液容器205。如图5所示的可移动样品托盘200具有盖子202和托盘203。可移动样品托盘200可以由塑料或其他合适的材料制成。如图13和16所示，可移动样品托盘200可通过铰接门210装载到生物打印机10的打印台128的凹部129中。在替代实施例中，样品容器110可装载到可移动样品托盘200中。可移动样品托盘200提供无菌的用于存储小瓶111的环境以及每个小瓶111是无菌的。

还可以设想，代替可移动样品托盘200，样品容器壳体201可以与打印台128成为一体。在这种情况下，每个样品容器110将可通过生物打印机10的铰链门210装载到打印台128中。

容纳样品容器110的可移动样品托盘200可以进一步包括废液容器205，用于在冲洗样品加载系统20时接收废物。可移动托盘200还可包括清洁容器204，用于清洁样品加载系统20，选择阀30和液滴分配系统25。

液滴分配系统

参照图11至图15，液滴分配系统25包括打印头250，该打印头250可操作地连接至多个储存容器120，并适于将样品液滴101从每个储存容器120分配到基板125上。至少一个打印头250可以是阀251的阵列。阀251的阵列可包括多个微电磁阀252。微型电磁阀252可以是由The Lee Company制造的VHS系列电磁阀。每个微型电磁阀252包括喷嘴253，喷嘴的孔口直径为0.003”，0.005”或0.007”。通过在螺线管线圈上施加尖峰并保持电压来打开每个微型电磁阀252。尖峰电压为24V，保持电压为5V。尖峰电压的持续时间在0.2到0.5ms之间。当电压被切断时，微型电磁阀252返回到关闭位置。

每个喷嘴253可以是由微控制器即控制系统40控制的宝石孔口分配喷嘴253。样品100被存储在微电磁阀252和喷嘴253上游的储存容器120中。宝石孔口喷嘴253的内径可以在127至254μm之间，这取决于流体粘度和样品液滴101的期望液滴体积。

液滴分配系统25包括压缩空气供应入口180，该压缩空气供应入口180通过空气过滤器190可操作地连接至压力调节器歧管170。空气使样品100在样品加载系统20和液滴分配系统25中移动，以便通过打印头250的喷嘴253进行分配。还可以使用由调节器歧管170的压力调节器171设置的背压和各个阀252的打开时间来调节期望的样品液滴101的体积。通常，将背压设置为1到60psi之间的压力，阀251的打开时间为0.3ms或更大，液滴的体积为1到500nl。

液滴分配系统25可以进一步包括可操作地连接至打印台128的第三定位单元300，第三定位单元300用于将打印台128定位在二维空间中。第三定位单元300被配置为使打印台128沿着轨道301移动。轨道142垂直于轨道301延伸。参照图13，打印台128支撑基板125并具有凹部129，该凹部被配置为可移除地容纳样品托盘200。3轴运动控制平台能够在所有三个(X，Y和Z)维度上以10μm的分辨率精确定位液滴分配系统。

在无菌环境中，使用样品加载系统20将每种激活剂、生物墨水和含有细胞的生物墨水或含有细胞的细胞墨水(即样品100)缓慢地装入适当的储存容器120中，以避免产生少量气泡。

生物打印机配备有24V DC电源形式的电源(未显示)。

压缩空气供应入口180从空气压缩机(未示出)供应。空气压缩机可提供3至10bar的气压。压缩空气可以从研究实验室中常见的普通压缩空气管线中提供。

液滴分配系统25内的管道150是40mm 1/16”特氟龙(Teflon)管道。该管道150将储存容器120连接到打印头250的阀251的阵列。

样品加载系统20可以自动将样品100加载到储存容器120中以进行打印。该系统具有优于现有技术的生物打印系统的若干优点。首先，生物墨水可以存储在易于处理的样品容器110中，例如玻璃或塑料瓶111。这些样品容器110在填充生物墨水样品之前容易灭菌。最终用户，例如生物学家，使用移液器等常规方法将其细胞存放在适当的小瓶111内。可以在生物安全柜内进行在生物墨水瓶111内的细胞存放，以确保样品100不被污染。在存放细胞之后，可将小瓶111放置在生物打印机10内的适当位置。

样品加载系统20允许从用橡胶隔膜113密封的单个小瓶111装载生物墨水和包含细胞的生物墨水。这是通过使用z-轴线性致动器140定位的针130来实现的。针130流体连接至容积泵160。当针130的尖端刺穿隔膜113并位于小瓶111的内部时，泵160启动，并且流体样品100从小瓶111中抽出。

打印头250可包括多个电子压力调节器171，其可基于用户输入、样品结构和/或期望的细胞结构单独地调节以打印大范围的粘度，液滴尺寸等。电子压力调节器171可操作地连接到阀251的阵列。

压力调节器歧管170中容纳有压力调节器组171(设想生物打印机10可以包括10个，因为存在多达10个储存容器120)。歧管170的功能是将来自连接到供应入口180的外部空气压缩机的压缩空气分配到每个调节器171。在图11和图12中，仅示出了单个调节器171和歧管170的一侧。在图14和图15中，示出了一组十个调节器171。

生物打印机10的样品加载系统的示例性实施例包括如下步骤，用于将样品100加载到储存容器120中：

1.将选择阀30移动到选定的通道31；

2.打开微型电磁阀252；

3.使用x轴和y轴执行器将针130定位在样品瓶111上方；

4.使用Z轴执行器将针130向下***小瓶111并刺穿小瓶的隔膜113；

5.启动蠕动泵160；

6.将来自小瓶111的流体通过选择阀30泵入储存容器120；

7.当流体到达微型电磁阀252的喷嘴时，停止泵160；和

8.关闭微型电磁阀252。

生物打印机10的样品加载系统20的另一示例性实施例，特别是用于清洁和消毒的步骤包括以下步骤：

1.将微型电磁阀252放在废痰盂或瓶上；

2.将打印作业后剩余的所有液体倒入废液容器205；

3.将选择阀30移至选定通道进行清洁；

4.使用x-轴和y-轴驱动器将针130置于装有乙醇的样品瓶111上方；

5.使用z-轴执行器将针130向下***小瓶111并刺穿小瓶隔膜；

6.打开微型电磁阀252；

7.启用蠕动泵；

8.通过选择阀30从小瓶111中泵送乙醇，然后打开微型电磁阀252；

9.当足够的乙醇通过微电磁阀252时停止泵；

10.关闭电磁阀252；

11.用清洁剂重复该过程；和

12.用水重复该过程。

生物印刷机10适于印刷到多种基板125上，例如微孔板和培养皿。参考图20，可以使用温度控制单元280将基板125加热到37℃，以辅助细胞增殖。这俩温度控制单元280基于最佳生长条件所需的3D细胞构建条件来调节生物打印机10内部的温度。温度控制单元280可调节至36℃至38℃之间，以调节打印头250、设置在打印台128上的基板125和/或生物打印机10的内部的温度。

设置在打印台上并由打印台支撑的基板125可以是多孔板126。基板125可以是用于包封和培养打印的细胞结构的具有生物相容性耗材。这些基板可能包括：

·不同孔结构的微量滴定板(6、12、24、48、96和384孔)；

·微量滴定板，其盖玻片底部具有不同的孔结构(6、12、24、48、96和384孔)；

·盖玻片和显微镜载玻片；

·各种尺寸的fluorodish培养皿；和

·不同腔室结构的腔室培养玻片(Chamber slides)((1、2、4、8和16)。

为了清洁管道150、阀251的阵列和喷嘴253，如上所述，可以使用液滴分配系统25将清洁剂从样品瓶111移至并通过阀252和喷嘴253。清洁剂从喷嘴253喷入废液容器205。对于其他清洁化学品(例如70％的乙醇和水)重复此过程。当所有水都已通过管道150，阵列的阀251和喷嘴253冲洗后，仅从喷嘴253排出空气时，就完成了管道150和打印头250的清洁。

层流系统

参照图6至图10，生物打印机10还包括如图6至图10所示的层流系统50。无菌性和操作员安全性是3D生物打印应用程序中的主要问题。通常可以通过将生物打印机放置在生物安全柜或洁净室中来实现。通常，在组织培养实验室中，生物安全柜和无尘室被视为宝贵而昂贵的空间。因此，需要在3D生物打印应用中最小化生物安全柜和洁净室空间使用的解决方案。

集成到生物打印机10中的集成层流系统50为细胞和3D组织培养模型的生物打印提供了无菌环境，而无需生物安全柜或洁净室设施。此外，使用定向气流通过前部通道从外部环境吸入空气，从而为操作员提供了保护。

层状空气流系统50包括具有金属框架500(例如不锈钢)的腔室或壳体，并且在底部设有金属格栅，以允许被污染的气流被吸入电动鼓风机或离心风扇510中。使用风扇510将被污染的空气通过管道入口520泵入正压室535，该正压室535由两个高效微粒截留(HEPA)过滤器525和530组成。HEPA过滤器525和530可从被污染的空气流中去除至少99％的颗粒。一个HEPA过滤器525用作外部环境的排气，另一个HEPA过滤器530循环流向无菌室535的空气。设想每个过滤器将吸收大约50％的气流。图21示出了空气的流动，该空气通过导管入口520，通过鼓风机510，通过HEPA过滤器525和530进入生物打印机10，并且被排出或再循环。从再循环HEPA过滤器525到无菌室535的气流提供了单向向下的气流以0.45m/s的典型速度流向无菌室535。该气流在生物打印的样品液滴101上提供了均匀的清洁气流，从而大大降低了样品100中颗粒污染的风险。

在生物打印操作期间，必须关闭前部进入的铰链门210，以减少颗粒污染的风险。因此，可以通过减小鼓风机的转速来减小鼓风机510的流量。无菌室535中减少的气流减少了脱水对打印头250和样品100的影响。另外，它减小了在样品滴从打印头250飞向打印基板125的过程中气流干扰样品滴101的影响。

控制软件

生物打印机10通过开发用于打印生物测定的定制软件来控制。控制系统40包括控制软件，该控制软件包括具有用于操作生物打印机10的编程指令的非暂时性计算机可读介质。非暂时性计算机可读介质与生物打印机10分开放置，并且可操作地连接到生物打印机10。

该软件包括一个图形用户界面(GUI)，如图21和图22所示。最终用户可以通过GUI选择不同的测定打印程序，并更改测定参数，例如液滴间距和液滴体积。用户还可以手动控制液滴分配系统的空间位置，并创建液滴的自定义图案。该软件的其他功能包括用于液滴分配系统的清洁，灌注和清洗程序。

生物打印需要打印对象的3D模型。对于组织工程应用，通常是使用工程工具(例如CAD/CAM软件)创建的。这些工具昂贵且具有高度的复杂性，迫使科学家花费时间和资源来学习工程工具。对于3D组织培养应用，要打印的结构的复杂性较低。需要一种简单直观的方法来创建用于3D组织培养应用程序中生物打印的3D结构。

生物打印机10随附的软件提供了一种设计要打印的3D结构的每一层的方法。在一个实施例中，为用户提供网格从而为结构的每一层绘制图案。可以将要打印的材料定义为从打印头250中的不同喷嘴253分配的多种材料的混合物。例如，可以将水凝胶定义为与活化剂液滴混合的生物油墨液滴。

生物实验室中用于组织培养的典型底物是多孔板，例如6、12、24、48、96和384孔板。在一个实施例中，提供接口670以在多孔板上的每个孔内打印先前定义的3D结构。用户首先选择一个孔或多个孔的阵列，然后选择要在那些孔中打印的打印例程。

定制软件为用户提供用户界面，以供用户输入要在其上对3D单元构造的一层进行生物打印的位置。在打印之前，随软件一起提供了打印预览按钮671，以允许用户可视化打印单元的位置以及构造将是什么样。该软件的一个功能是它可以控制生物打印机液滴的大小，以改变细胞结构的打印方式。细胞结构分层背后的意图是模仿生物学家如何在显微镜中使用z堆栈分层。

通常，生物打印机10在构建3D单元结构时将打印20-25层，但是层的数量是使用控制系统和相关的控制软件来控制的。

由计算机控制软件控制的连接到打印头250的定位单元141在每次喷射生物墨水、活化剂、细胞、细胞墨水或它们的组合的液滴101时，将阀251和喷嘴253空间定位。电磁阀和喷嘴的计算机控制的空间定位以及阀251和喷嘴253的计算机控制的液滴喷射有助于3D组织结构的生成。

为了生成3D组织结构的阵列，在基板125上的多个位置重复生成3D组织结构的过程。

控制系统通过用户输入或自动记录来记录样品容器110中每个样品100的标识。目的是知道哪个样品容器110容纳哪个样品100，从而在打印期间，当储存容器120存储它们各自的样品时，将必需的样品打印到期望的位置。

生物打印机壳体

生物打印机10包括一个壳体60，该壳体内包括样品加载系统20，液滴分配系统25和层状空气流系统50。壳体60由许多由钢，铝和不锈钢制成的面板组装而成，并使用螺丝紧固件600组装。壳体60还包括在前面的铰链门210，以允许使用者进入生物打印机10的无菌室535。可移动样品托盘200可通过门210装载到生物打印机10中。前面板和铰链门210可以由玻璃或透明塑料制成。图16和图17示出了生物打印机组件10。

方法

在操作中，生物打印机10具有以下步骤，用于将样品从样品容器转移到储存容器中，准备由打印头用于生物打印3D细胞构造。为了向打印机的储存容器120和电磁阀充注流体，使用样品加载系统将流体从样品容器移动到并通过电磁阀。在流量选择阀上选择合适的通道。使用针130刺穿样品瓶的密封，打开电磁阀。打开蠕动泵，将所需量的流体从样品容器中移出，通过针，管道，泵，管道，流量选择阀，进入储存容器。蠕动泵关闭，电磁阀关闭。在流量选择阀上取消选择合适的通道。压力由调节器171设置，电磁阀252反复点火，直到所有空气都排出管路为止，然后从喷嘴253喷射生物墨水液滴，活化剂液滴，细胞液滴，细胞墨水液滴或其组合。对于使用的每个打印机流体容器和电磁阀，重复上述过程。

将生物墨水加载到储存容器中的步骤：

1.将选择阀移动到选定通道；

2.打开电磁阀；

3.使用x轴和y轴执行器将针定位在样品瓶上方；

4.使用Z轴执行器将针降低到小瓶中，刺穿小瓶隔膜；

5.启用蠕动泵；

6.将液体从小瓶中通过选择阀泵入储存容器中；

7.当流体到达电磁阀喷嘴时停止泵；和

8.关闭电磁阀。

为了从电磁阀打印生物墨水，活化剂，细胞，细胞墨水或它们的组合，采用如上所述的步骤对打印机的储存容器和电磁阀进行灌注，生物墨水，活化剂，细胞，细胞墨水或其组合的液滴由计算机控制的软件控制、以预定方式从喷嘴喷出，并沉积在基板上。

定位单元连接到打印头250，由计算机控制软件控制，在每次喷射生物墨水，活化剂，细胞，细胞墨水或其组合的液滴时，对电磁阀和喷嘴进行空间定位。计算机控制电磁阀和喷嘴的空间定位，以及计算机控制电磁阀和喷嘴的液滴的喷射，有助于3D组织结构的生成。

为了产生3D组织结构的阵列，在基板上的多个位置重复生成3D组织结构的过程。

生物墨水

在本说明书中，生物墨水被定义为一种或多种类型的大分子的水溶液，其中可以悬浮或容纳细胞。在活化或交联后，生物墨水产生具有其物理和化学特性的水凝胶结构，该物理和化学特性由生物墨水的化学和物理组成所限定。大分子被定义为合成和天然聚合物，蛋白质和肽的阵列。大分子可以处于其天然状态，或者用胺或硫醇反应官能团化学修饰。

合成大分子可以包括：

·多糖，例如含有果糖、蔗糖或葡萄糖官能团的聚合物

·非离子聚合物，例如聚乙二醇(PEG)，聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)，聚ε-己内酯(PCL)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚(NIPAAM)和聚富马酸丙二醇酯(PPF)及其衍生物；

·聚电解质-携带有正电荷或负电荷的聚合物，两性以及两性离子聚合物；

·多肽-多个氨基酸(至少2个氨基酸)通过酰胺键结合在一起组成的单线性链；和

·含核碱基的合成聚合物-具有核碱基(腺嘌呤，胸腺嘧啶，鸟嘌呤或胞嘧啶)重复单元的聚合物。

天然大分子可以包括：

·多糖，例如藻酸盐，壳聚糖，结冷胶，透明质酸，琼脂糖和糖胺聚糖；

·蛋白质，例如明胶，纤维蛋白和胶原蛋白；

·DNA和寡核苷酸，例如单链DNA(ssDNA)，双链DNA(dsDNA)DNA酶和核酸适配体；·基底膜提取物。

胺反应性官能团可包括：醛，环氧基，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和2-乙烯基-4,4-二甲基吖内酯(VDM)。

硫醇反应性官能团可包括：烯烃，炔烃，叠氮化物，卤素和氰酸酯。

使用并发现合适的生物墨水为：将藻酸盐(浓度为2w/v％)溶解在无钙DMEM中，还添加有10v/v％FCS，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠。

具有分散的SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞的生物墨水被称为含有细胞的生物墨水。

活化剂

活化剂是包含小分子或大分子的水溶液，活化剂与生物墨水相互作用形成水凝胶结构。可以改变活化剂的组成以控制所得水凝胶的物理性质。所用活化剂的类型很大程度上取决于所用的大分子以及预期的交联过程。

活化剂可以选自：

·无机盐，例如碳酸钙，氯化钙，氯化钠，硫酸镁，氢氧化钠和氯化钡；

·光引发剂，例如2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)和Irgacure；

·聚电解质-聚合物，与生物墨水中的大分子带有相反电荷。它可以是阳离子，阴离子，两性氧化物和两性离子；

·多肽-由许多氨基酸(至少2个氨基酸)通过酰胺键结合在一起组成的单线性链；

·DNA接头-带有核苷酸或DNA序列的大分子，与生物墨水的大分子上存在的核苷酸或DNA序列互补；

·带有胺基或巯基的天然或合成大分子，可以是天然的或通过化学修饰的。

用于藻酸盐生物墨水的活化剂是：溶解在MilliQ水中的4w/v％的氯化钙。

交联或胶凝

该过程是单个大分子链通过活化剂连接在一起形成水凝胶的过程。交联过程可以分类为化学或物理交联。物理交联或非共价交联可包括：

·离子交联-通过大分子和活化剂中相反电荷的相互作用进行交联。活化剂可包括带电荷的低聚物，离子盐和离子分子；

·氢键-通过极性分子的静电吸引作用进行交联。在这种情况下，大分子和活化剂带有极性官能团。

·温度交联-通过大分子链的重排交联，该重排是大分子链对温度变化(加热或冷却)的响应；和

·疏水相互作用或范德华力。

化学或共价交联涉及大分子和活化剂之间的化学反应。反应类型可以包括：

·光交联，通过紫外线或光照射促进交联反应；·水性介质中，硫醇与带有乙烯基的大分子之间的迈克尔型(Michael)加成反应；

氨基和醛基之间的席夫碱反应；

·狄尔斯-阿尔德反应；

·点击化学；

·对活性酯基的氨解反应；和

·酶交联。

下表列出了其他生物墨水和活化剂组合的示例：

细胞墨水

细胞墨水是一种或多种分子或大分子的水溶液，在整个3D生物打印过程中，细胞将被均匀地悬浮在其中。细胞墨水的浓度被优化以防止细胞沉降，但仍保持高细胞活力。

细胞墨水可以从以下选项中选择：

·小分子，如甘油；和

·大分子，例如Ficoll^TM，葡萄糖，藻酸盐，结冷胶，甲基纤维素和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。

Ficoll^TM是一种中性、高度分支、高质量的亲水性多糖，易溶于水溶液中。Ficoll^TM半径范围为2-7nm，并且通过多糖与环氧氯丙烷反应来制备。Ficoll^TM是GE Healthcare公司拥有的注册商标。

所使用的细胞墨水是溶解在PBS中的Ficoll^TM400，其浓度为10w/v％。

具有分散的SK-N-BE(2)神经母细胞瘤细胞的细胞墨水称为包含细胞的细胞墨水。

结冷胶是由细菌鞘氨醇单胞菌Sphingomonas elodea(原名称为Pseudomonaselodea)产生的水溶性阴离子多糖。

细胞培养液

细胞培养液是与培养细胞接触的液体，适用于各种与细胞有关的工作。制备过程包括盐的精准分析和pH的平衡，仅加入生物相容性分子并进行灭菌。

一些细胞培养液包括：

·细胞培养基，例如DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)，最低必需培养基(Minimum Essential Media，MEM)，IMDM培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium)，199培养基(Media 199)，Ham’s F10，Ham’s F12，McCoy's 5A培养基和RPMI培养基(Roswell Park Memorial Institute)；

·生长补充剂，例如胎牛血清(FCS)，表皮生长因子(EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFBF)，成纤维细胞生长因子(FBF)，内皮细胞生长因子(ECGF)，***1(IGF-1)和血小板源生生长因子(PDGF)；

·生物缓冲液，例如PBS，HEPES和CHES；

·螯合和稳定溶液；和

·灭菌的MilliQ水。

细胞培养条件

可以采用标准细胞培养技术对细胞和3D组织培养模型进行孵育、培养和保持。3D组织培养模型包括囊封在水凝胶模具中的细胞，该3D组织培养模型可以在允许或保持细胞生长或球体形成的条件下孵育。对于大多数动物和人细胞系，通常在约37℃，5％的CO₂水平下孵育至少24小时。应当理解，孵育可以在任何合适的条件、温度和持续时间下进行，该条件允许水凝胶模具中的一种或多种细胞生长、维持或球状形成。

效用溶液

效用溶液被定义为不与细胞接触但用于清洁和消毒暴露于细胞的所有打印机表面的溶液。这些溶液可以包括：

·恰当浓度的乙醇；

·无菌MilliQ水；

·细胞培养基；

·清洁剂；和

·过氧化氢溶液(最大浓度2w/v％)。

生物墨水的制备

最初，通过在适当的细胞培养液中混合正确类型和数量的大分子来制备生物墨水。在达到均匀性之后，将空白生物墨水通过紫外线照射和过滤(0.22μm过滤器)进行灭菌。然后将生物墨水保持在4℃直至进一步使用。

细胞制备

通过用PBS洗涤收获细胞。吸出PBS。加入胰蛋白酶并在37℃孵育，使细胞从烧瓶表面分离。添加组织培养基以将分离的细胞收集到管中。离心细胞，吸出上清液并将沉淀重悬在新鲜培养基中。通过混合等体积的细胞悬液和台盼蓝染色剂进行细胞计数。计算以确定细胞浓度。然后可以将所需数量的细胞添加到生物墨水、细胞墨水或添加到细胞培养液中。

活化剂的制备

将正确类型和数量的分子溶解在适当的细胞培养液中。使用前，将所得溶液通过UV辐射和过滤灭菌。

细胞墨水的制备

将正确类型和数量的分子溶解在适当的细胞培养液中。在达到均匀性之后，在使用前通过UV辐射和过滤对所得溶液进行灭菌。然后将细胞墨水保持在室温下直至进一步使用。

细胞收集

通过遵循已经建立的方案，收获一定融合度的感兴趣的培养细胞。为了配制包含细胞的生物墨水或细胞墨水，将收获的细胞以正确的细胞浓度重悬，以在200μl的生物墨水或细胞墨水中产生2.5亿个细胞/毫升的浓度。然后将所得的细胞沉淀物重新分散在正确体积的生物墨水或细胞墨水中。然后可以将包含细胞的生物墨水或细胞墨水用于3D生物打印机。

打印水凝胶模具

可以使用滴落式滴印工艺来打印水凝胶模具，在此过程中，将生物墨水液滴和活化剂液滴沉积在彼此的顶部，以产生水凝胶。可以重复此过程，并通过建立水凝胶层将其用于形成3D水凝胶结构。

细胞类型

3D组织培养模型(例如球体)可以由任何合适的细胞类型制备，所述细胞类型包括贴壁细胞，例如哺乳动物肝细胞，胃肠道细胞，胰腺细胞，肾细胞，肺细胞，气管细胞，血管细胞，骨骼肌细胞，心脏细胞，皮肤细胞，平滑肌细胞，***细胞，角膜细胞，泌尿生殖细胞，乳腺细胞，生殖细胞，内皮细胞，上皮细胞，成纤维细胞，神经细胞，许旺氏细胞，脂肪细胞，骨细胞，骨髓细胞，软骨细胞，周皮细胞，间皮细胞，源自内分泌组织的细胞，基质细胞，干细胞，祖细胞，淋巴细胞，血细胞，内胚层来源的细胞，外胚层来源的细胞，中胚层来源的细胞或其组合。

其他细胞类型可以包括其他真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢)，细菌(例如幽门螺杆菌)，真菌(例如，产黄青霉(Penicilliumchrysogenum))和酵母菌(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。

细胞系SK-N-BE(2)(神经母细胞瘤细胞)已成功用于在各种条件下的3D组织培养模型的过程中。应该理解的是，预期其他细胞系也可以根据需要按照所开发的工艺制备3D组织模型。所使用的其他细胞系包括DAOY(人类髓母细胞瘤癌细胞)，H460(人类非小细胞肺癌)和p53R127H(人类胰腺癌细胞)。088和089列出了其他可能合适的细胞系。

3D生物打印技术的开发是通过按需滴注技术生产封装在水凝胶模具中的高密度3D组织培养模型。具体而言，使用3D打印技术来打印生物相容性水凝胶模具，该模具使用生物墨水和活化剂，它们以逐层方式构造以制造各种3D结构。在水凝胶模具的制造过程中，高细胞密度的液滴可以包含在水凝胶模具中。

本领域技术人员将理解的是，在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方式中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例在所有方面都应被认为是说明性的而非限制性的。

参考文献

Murphy,S.and Atala,A.(2014).3D bioprinting of tissues andorgans.Nature Biotechnol,32(8),pp 773-785.

Horn,T.and Harrysson,O.(2012).Overview of current additivemanufacturing technologies and selected applications.Sci.Prog,95,pp 255–282.