阅读说明：本技术 用于操纵显微镜中的光路的方法和装置、用于摄取显微镜中的图像堆栈的方法 (Method and device for manipulating a beam path in a microscope, method for capturing a stack of images in a microscope ) 是由 弗罗里安·法尔巴赫 于 2019-03-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于操纵在显微镜(1)中特别是在光片显微镜(5)中的至少一个光路(8)的方法、一种用于在显微镜(1)中特别是在光片显微镜(5)中对图像堆栈(224)摄像的方法、一种用于操纵在显微镜(1)中特别是在光片显微镜(5)中的至少一个光路(8)的装置和一种非易失性的计算机可读的存储介质(163)。现有技术的方案具有如下缺点：不能利用任何浸渍介质(23)观察样本(21),并且该方法附加地受限于数值孔径(NA)较小的光学设备(9)。根据本发明的方法通过如下方法步骤改善了现有技术的方案：-求取布置在样本空间(17)中的样本(21)的和/或布置在样本空间(17)中的光学介质(35)的折射系数(n)；和-根据所求得的折射系数(n)来调节至少一个显微镜参数(2),用于操纵所述光路(8)。(The invention relates to a method for actuating at least one beam path (8) in a microscope (1), in particular in a light sheet microscope (5), to a method for imaging an image stack (224) in a microscope (1), in particular in a light sheet microscope (5), to a device for actuating at least one beam path (8) in a microscope (1), in particular in a light sheet microscope (5), and to a non-volatile computer-readable storage medium (163). The prior art solutions have the following drawbacks: the specimen (21) cannot be observed with any immersion medium (23), and the method is additionally limited to optical devices (9) with a small Numerical Aperture (NA). The method according to the invention improves the prior art solutions by the following method steps: -determining a refractive index (n) of a sample (21) arranged in the sample space (17) and/or of an optical medium (35) arranged in the sample space (17); and-adjusting at least one microscope parameter (2) for manipulating the beam path (8) as a function of the determined refractive index (n).)

用于操纵显微镜中的光路的方法和装置、用于摄取显微镜中 的图像堆栈的方法

技术领域

本发明涉及一种用于操纵在显微镜中特别是在光片显微镜中的至少一个光路的方法、一种用于摄取在显微镜中特别是在光片显微镜中的图像堆栈的方法、一种用于根据折射率来操纵在显微镜中特别是在光片显微镜中的至少一个光路的装置和一种非易失性的计算机可读的存储介质。

背景技术

在现有技术中目前已知所谓的净化方法，其允许把样本容纳在浸渍介质中，其中，浸渍介质可以在其折射系数方面适配于待检查的样本，或者可以使得样本的折射系数均匀化。后一个方法并非导致样本的折射系数也适配于介质的折射系数。已知有多种(20种以上)这种浸渍介质，其可以基于乙醇或糖。采用该方法无法检查活体样本，因为这些样本已例如通过去除脂肪而发生了很大的化学变化。

另一方面，还努力将活体细胞和组织植入到介质中，该介质的折射系数等于待检查的物体。在各种浸渍介质中，除了它们的不同的折射系数外，还以不同的混合比例采用相应的溶剂。由此造成刚刚采用的浸渍介质的折射系数出现大的变化，特别是出现不确定性。

但浸渍介质的折射系数主要负责出现像差，特别是失焦和球面像差。这些与折射系数相关的效应会恶化显微摄像。

如果为了检查浸渍介质中的样本而使用所谓的光片显微镜，则未被考虑的折射系数会导致探测光学件的焦点平面因浸渍介质的和/或样本的折射率致使折射不同而移动一段距离，造成该焦点平面无法再与通过照明物镜产生的光片(即一种两维的照明平面)重叠。也就是说，光片显微镜中的失焦会引起所摄取的图像的严重的质量损失。

出于这个原因，在现有技术中已知有迭代的和基于图像的算法或者基于这些算法的方法，其基于图像质量对至少一个显微镜参数进行修改，因而可以按近似方法补偿可能出现的像差。

在现有技术的净化方法中，预防性地优选使用数值孔径(NA)较小的物镜，因为对于这些小NA的物镜，上述像差可忽略不计。在共焦的显微方法中，所述像差也可以忽略不计，这些显微方法例如使用唯一的物镜，从而无论照明光路还是探测光路都在同一“方向”上即以相同的符号受到像差。然而希望的是，也能使用具有大NA的物镜，以便利用这些物镜来实现较高的分辨率，并且更有效地探测来自样本的光。

发明内容

本发明的目的因而是，能够观察在任何浸渍介质中的样本并且在观察时使用具有大NA的物镜。

上述目的通过根据本发明的用于操纵至少一个光路的方法以如下方法步骤得以实现：

-求取布置在样本空间中的样本的和/或布置在样本空间中的光学介质的折射系数；和

-根据所求得的折射系数来调节至少一个显微镜参数，用于操纵光路。

开篇提到的用于在显微镜中对图像堆栈摄像的方法实现上述目的方式为，该方法包括如下方法步骤：求取布置在样本空间中的样本的和/或布置在样本空间中的光学介质的折射系数；-检测相对于光学设备的样本位置的变化，和/或在调节至少一个显微镜参数之前检测激发波长的变化；和-根据所求得的折射系数来调节至少一个显微镜参数，用于操纵光路。

开篇提到的根据本发明的装置实现上述目的方式为，该装置包括：折射系数求取模块，用于求取样本的折射系数和/或求取布置在样本空间中的光学介质的折射系数；和至少一个光路操纵器，用来基于所求得的折射系数调节至少一个显微镜参数，以便操纵至少一个光路。

开篇提到的非易失性的计算机可读的存储介质包括用于实施根据本发明的方法的程序，进而实现了上述目的。

根据本发明的方法、根据本发明的装置和根据本发明的用于实施所述方法的非易失性的计算机可读的存储介质因而具有如下优点：它们能实现基于样本的和/或浸渍介质的折射系数，快速地、保护样本地、决定性地且非迭代地操纵显微镜的至少一个光路。

根据本发明的方法、根据本发明的装置和根据本发明的非易失性的计算机可读的存储介质可以分别通过特殊的设计予以进一步改善。本发明的设计的各个技术特征在此可以任意地相互组合和/或省去，只要不依赖于利用省去的技术特征实现的技术效果。

根据本发明的方法可以用于近乎任意地操纵至少一个光路，但尤其也可以用于补偿至少一个由样本和/或光学介质引入的成像误差。

相比于现有技术的方案，上面提到的根据本发明的方法、根据本发明的装置和根据本发明的存储介质具有如下优点：可以自动地测量样本的和/或样本周围的浸渍介质的折射系数，并且基于测得的折射系数，即决定性地、不基于迭代方法地，特别是无需图像的照片，定量地得到该折射系数。对此无需把样本布置在样本空间中，从而根据本发明的方法或根据本发明的装置可保护样本。此外，根据本发明的方法是无接触的。

浸渍介质是指可以位于样本空间中、特别是在该样本空间中包围样本的介质。浸渍介质同样可以位于样本与相应物镜的前透镜之间的区域内。

特别是光片显微镜的待操纵的光路例如可以是照明光路和/或探测光路。优选操纵用于照明和探测的两个光路，特别是可以针对相应的光路补偿出现的像差。

光学介质是指如下材料：其对在显微镜中采用的一个波长或多个波长来说是透明的，并且具有特定于该波长的光学特性比如折射系数和色散性。光学介质可以特别地且不受限制地包括上面提到的基于乙醇或糖的浸渍介质，但也可以包括水、甘油和空气。因此，根据本发明的方法或根据本发明的装置也可以在没有浸渍介质的情况下(物镜位于空气中)使用。

求取布置在样本空间中的样本的和/或布置在样本空间中的光学介质的折射系数，包括由使用者输入相应的值的方法步骤，由此可以实现根据本发明的方法的一种简单的设计。在这种设计中，使用者例如可以由规定的浸渍介质的选择列表中选出折射系数，但也可以输入由使用者规定的折射系数。因而在利用事先已经使用过的、因而已知的浸渍介质重复地测量时，可以加速与恰恰这种浸渍介质的匹配。

在另一设计中，用于对图像堆栈摄像的方法可以包括如下步骤：(8a)使得第一光学设备的焦点平面移动预先设定的扫描距离；(8b)根据本发明的用于操纵显微镜中的光路的方法的一种设计，操纵第一光学设备的至少一个光路，用来矫正第一光学设备的成像误差；和(8c)使得第二光学设备的焦点平面移动或者跟随一段与在方法步骤(8b)中求得的折射系数相关的跟随路程。

在该方法的一种有利的设计中，该方法可以包括摄取和/或存储图像，用于产生图像堆栈。特别是可以摄取和/或存储n个图像，这些图像形成图像堆栈。优选地，在成像误差被矫正的情况下，即在操纵相应的光路之后，对图像堆栈的全部图像都进行摄像。

在另一设计中，根据本发明的用于操纵显微镜中的光路的方法的一种设计，在方法步骤(8c)中，附加地执行操纵第二光学设备的至少一个光路的步骤，用于矫正第二光学设备的成像误差，由此可以改进前面提到的用于对图像堆栈摄像的方法。因而可以在显微镜中既使得照明光路又使得探测光路适配于未知的介质，特别是该介质的折射率。

在根据本发明的用于对图像堆栈摄像的方法的另一可能的设计中，可以按变化的形式重复方法步骤(8a)、(8b)和(8c)。因而可行的是，在操纵第一光学设备的至少一个光路的方法步骤(8b)中，在方法步骤(8a)-(8c)的第二次执行中，并不重新求取折射系数。因此，改变的方法步骤(8b)'可以仅仅具有根据所求得的折射系数调节至少一个显微镜参数的方法步骤，用来操纵光路。在这种情况下，折射系数在方法步骤(8b)中在第一次执行时求取。这具有如下优点：在对图像堆栈摄像时，仅仅为了摄取第一图像进行折射系数求取，而摄取图像堆栈的其它图像无需再求取折射系数(其已经求取过了)。这可以加速对图像堆栈的摄像。

根据方法步骤(8c)，优选进行n次图像摄取，其中，n表示图像堆栈的图像总数量。

特别地，在执行方法步骤(8a)、(8b)和(8c)之后，根据图像堆栈的图像的所希望的数量，任意频次地(n次)重复方法步骤(8a)、(8b)'和(8c)。在此，并非必须在每次图像摄取之前重复求取折射系数。

然而，在用于对图像堆栈摄像的方法的另一设计中，可以根据待摄取的图像的事先确定好的数量，分别任意频次地执行方法步骤(8a)、(8b)和(8c)，其中，在方法步骤(8c)之后可以分别进行图像摄取。根据本发明的方法的这种设计可以优选地在具有大的(或可探测的)折射率梯度的样本中应用。因而可以针对每个被摄像的平面矫正可能的成像误差。

如果包含有图像堆栈的空间内折射率变化是可忽略不计的，则在方法步骤(8b)中一次性求取折射系数可以加速所述方法，因为不必针对每次后续的图像摄取都重复求取折射系数。

在根据本发明的用于对图像堆栈摄像的方法的另一设计中，在第一次检测图像之前，一旦使用者已经把样本装入到显微镜中，就可以检测折射系数。在此可考虑不同的触发器，例如由计算机启动的触发器，一旦由使用者创建新项目。同样可以手动地触发测量。这可以特别优选地在使用者观察预览图像之前进行，这些预览图像需要用来在样本中定向，并且基于预览图像进行测量(即对图像堆栈摄像)。也就是说，在定向阶段期间，即在实际测量(对图像堆栈摄像)之前已近进行了矫正。在所述定向阶段中求得的折射系数值可以被利用于用来对图像堆栈摄像的方法，从而在该方法设计中不再需要单独地求取折射系数。

该方法因而包括确定和存储折射系数的方法步骤，其中，可以针对不同的激发和/或激励波长来确定和/或存储折射系数。在测量时，这些存储的折射系数值，有利地与为光学设备存储的校准数据相结合地，具有如下优点：

-例如在成像的平面相对于样本的位置改变时，或者在激发波长改变时，照明光学件的焦点保持不变；

-如果在探测光路中折射系数存在突变，则在所摄取的各图像之间的空间距离得到矫正的情况下对图像堆栈摄像；

-在使用带有矫正环的光学设备时补偿残余误差；和

-矫正先前提到的成像误差。

用于对图像堆栈摄像的方法的这种设计因而可以包括如下方法步骤：

b1测量和/或存储折射系数；

b2检测相对于光学设备(例如照明和/或探测光学件)的样本位置变化，和/或检测激发波长的变化，读出在方法步骤(b1)中存储的测量值和/或事先存储的校准数据；和

b3根据所求得的折射系数来调节至少一个显微镜参数，用于操纵光路。

方法步骤(b2)优选可以与前述改变之一同时地执行，但也可以在进行改变之后才执行。

在根据本发明的方法的另一设计中，该方法可以根据所求取的折射系数，以至少一个如下方法步骤来调节焦点位置：-改变至少一个物镜的有效焦距；或者-使得至少一个物镜沿着其相应的光学轴线移动。

因而可行的是，借助根据本发明的方法使得样本移动，其中，在所述移动时，浸渍介质与位于照明光学件或照明物镜之前的介质例如空气之间的界面也移动，样本浸入在所述浸渍介质中。在第二步骤中，照明光路可以在其焦点位置方面予以操纵，并且矫正在有些情况下出现的成像偏差。在此，焦点的位置可以特别优选地在图像场内部保持在不变的位置。通过改变界面的位置，已经矫正的成像误差会发生变化，致使需要采用该方法重新矫正。

如果在探测光学件与样本之间也有具有不同折射系数的介质(例如，当样本布置在位于照明光学件与探测光学件之间的比色皿中时)，则可以使得该方法适配于该另一界面，其方式为，可以附加地对探测光路在其焦点方面予以操纵，其中，对探测光路的这种操纵也可以包括矫正探测光学件的成像误差。

该设计具有如下优点：对焦点位置的操纵可以用来使得显微镜与样本本身的折射系数适配和/或与样本周围的浸渍介质适配。特别是可以补偿由未知的折射系数引起的像差。如此调节在光片显微镜中的焦点位置是特别有利的，因为在该光片显微镜中有利的是，可以确保探测物镜的焦点平面和照明物镜的照明平面能够重叠，因而可以得到被光片照明的二维的区域的的清晰的成像。

至少一个物镜的有效焦距和焦点位置因而是可能的显微镜参数。这些参数中的至少一个可以在相应的装置中通过光路操纵器予以调节。

在根据本发明的方法的另一设计中，可以根据所求得的折射系数，通过对光路的操纵，通过根据相距光学轴线的距离改变光路的光程距离来矫正球面成像误差。

球面的成像偏差特别是对于光束的非近轴的光会出现，并且随着相距光学轴线的距离而增大。因此，采用这种设计可行的是，对于体积约为1cm³及以上的样本大小，几乎完全照明光学系统并使用其孔径。

在根据本发明的方法的另一设计中，这种球面成像偏差也可以仅仅部分地予以补偿，或者甚至可以过度补偿。

在前述根据本发明的方法的一种特殊的设计中，对光程距离的改变可以包括使得至少一个反射镜区段移动，和/或使得可变形的透射的介质的界面移动。

特别地，在另一特殊的设计中，可以根据函数关系r²和r⁴的叠加—r²和r⁴的权重分别是确定好的—来对光程距离进行改变，其中，r等于相距光学轴线的距离。

换句话说，在根据本发明的方法中，可以根据相距光学轴线的距离(即根据r)来增大或减小光程距离(也就是说，各个几何部分距离的总和分别与沿着相应的部分距离出现的折射系数相乘)。

光程距离的变化可以用Δx来表示，并且特别是通过数学表达式Δx＝A*r²+B*r⁴来描述。在这里，r是在所考察的光学系统的光瞳中相距光学轴线的距离，A或B是可自由选择的前因子，其允许对平方的或四次方的(双平方的)部分予以加权。通过该数学表达式描述的光程距离变化因而可以用来补偿在未知折射率的介质和/或样本中出现的球面像差。三阶的球面像差(在借助Zernicke-多项式来描述像差时)借助于平方的或四次方的部分予以描述。所述像差可以采用这种设计的根据本发明的方法或根据本发明的装置予以补偿。

在根据本发明的装置的相应的设计中，光路操纵器可以包括下组的至少一个部件：(a)具有可电调节的焦距的光学部件；(b)用于使得至少一个光学设备移动的促动器模块；(c)矫正环；(d)用于把矫正板引入光路中的矫正板模块；(e)配备有矫正环的物镜；(f)可变形的反射镜；和(g)充有透明液态介质的空心部件，其带有至少一个透明的入射面和/或出射面，其中，至少一个透明的入射面和/或出射面可变形。

部件(a)、(f)和部件(g)可以被设计用来改变至少一个物镜的有效焦距。部件(b)可以被设计用来使得至少一个物镜沿着其相应的光学轴线移动。

部件(e)、(d)和(e)可以被设计用来把球面像差施加到光路上，也就是说，特别是矫正已经具有球面像差的光路，该光路带有相反的球面像差。

部件(f)和(g)可以用来既根据相距光学轴线的距离对光程长度进行改变，又(附加地或替代地)改变相应物镜的有效焦距。

部件(a)的一种特殊设计可以是可电调的透镜(electrically tunable lens；ETL)，部件(d)尤其可以把用来矫正球面像差和/或失焦的矫正板引入到光路中。

部件(a)、(b)、(f)和(g)是可变地可调节的，因而允许根据本发明的装置的或根据本发明的方法的应用的灵活性。特别地，利用部件(g)可以使得入射面和/或出射面适当变形，从而它们的径向的厚度轮廓可以等于函数关系r²和r⁴的叠加，r²和r⁴的权重分别是确定好的。

由于上述的部件(a)-(g)无论在动态范围(即可以改变的光程长度的范围)上还是在其速度上都是不同的，所以可以把不同的光路操纵器有利地相互组合。因而在一种可行的设计中，可以借助矫正环(c)缓慢地矫正基本的成像误差。特别地，可以借助该矫正环矫正到一定的折射系数n，其中，这种缓慢的矫正以大的动态范围进行。缓慢的矫正例如可以与部件(g)组合，该部件虽然没有与矫正环相同的动态范围，但可以实现快很多地矫正残余误差。这例如当矫正环未考虑全部所用材料的色散，因而具有可以通过第二组件予以补偿的残余误差时可以是有利的。

在根据本发明的用于对图像堆栈摄像的方法的一种有利的设计中，上述各部件可以有利地应用于用来对图像堆栈摄像的方法的至少一个、优选全部的方法步骤。因而例如可以在方法步骤(8a)中借助可变形的反射镜使得探测光学件的焦点平面移动，并且同一个可变形的反射镜在方法步骤(8b)中同样用于操纵探测光学件的光路。因而可以矫正探测光学件的成像误差。对第二光学设备—在这种情况下为照明物镜—的焦点平面的跟随可以利用另一可变形的反射镜进行。替代地，可以代替另一可变形的反射镜而使用倾斜反射镜。

根据本发明的方法可以进一步予以改进，其方式为，根据波长通过如下方法步骤来操纵光路：(A)根据本发明的方法的一种前述设计，操纵第一波长的光的光路；和(B)根据本发明的方法的一种前述设计，调节至少一个其它的波长，并且相应地、顺序地操纵该其它的波长的光的光路。

在该方法的一种变型中，可以在方法步骤(B)中仅仅对至少一个其它的波长进行调节，从而对于该其它的波长，该其它的波长的光的光路也基于在方法步骤(A)中针对第一波长测得的折射系数进行。

同样可考虑的是，根据本发明的方法的另一设计包括如下方法步骤：(A')针对第一波长的光，求取布置在样本空间中的样本和/或布置在样本空间中的光学介质的折射系数；(B')调节至少一个其它的波长，并且针对该第二波长的光，相应地、顺序地求取布置在样本空间中的样本和/或布置在样本空间中的光学介质的折射系数；(C')根据本发明的方法的一种前述设计，操纵第一波长的和至少一个其它的波长的光的光路。

这种与波长相关的矫正可以利用通常的与波长无关的矫正部件比如可变形的反射镜或ETL来进行。如果使用这种矫正部件，则与使用矫正环相反，该矫正通常不能针对多个波长同时校准不同的颜色像差。在这种情况下，可以针对不同的波长，顺序地进行摄像，其中，明显更快的部件比如可变形的反射镜或ETL，在此由于其例如明显少于10ms的切换时间，可以减小顺序摄像的可能的时间损失。

在此需要提及，例如允许与具有不同折射系数的介质适配的矫正环，也可以针对不同的折射系数，仅仅分别矫正一定的色散，即对于水且光波长约为500nm(绿色光)，其色散为n＝1.33，对于甘油，其色散为n＝1.42，但对于具有不同色散的物质的相应折射系数却不行。具有不同折射系数的物质—其色散对于相应的折射系数可以予以矫正—的数量也是有限的，例如对于n＝1.33、n＝1.37、n＝1.41、n＝1.45等，就无法分别矫正介质的不同色散。

在该方法中，特别是对于(由使用者)事先确定的波长，可以确定折射系数，并且在经过所述测量之后，在至少一个光路例如照明和探测光路中进行与波长相关的矫正或操纵。

根据本发明的方法可以进一步予以改进，其方式为，规定以设定好的时间间隔重复该方法。

这特别是对于如下样本和/或浸渍介质来说可以是有利的：其例如因蒸发而要考虑到折射系数随时间变化。采用该设计还可以在观察活体样本时检测样本的和/或样本周围的浸渍介质的变化，并且相应地予以矫正。

在相应的装置的一种设计中，可以设置计时器模块，其以设定好的时间间隔输出开始信号，用于开始测量和/或操纵至少一个光路。

在根据本发明的方法的另一设计中，求取样本的和/或布置在样本空间中的光学介质的折射系数包括如下方法步骤：

(i)借助光学设备把测量光聚焦到样本空间中，其中，测量光在光学设备的样本侧传输经过所述光学介质和另一光学介质；

(ii)利用探测设备来探测被反射部件反射的且传输经过另一光学设备或所述光学设备的测量光；

(iii)基于由探测器探测到的测量光来求取所述光学设备与反射部件之间的工作距离，其中，对于该工作距离，测量光的焦点位于反射器上；

(iv)改变至少一个如下参数：

·光学设备与样本介质之间的距离；

·反射器与另一光学介质之间的距离；

·测量光的发散度，其中，该改变导致测量光焦点位置的确定的距离变化；

(v)按照方法步骤(i)～(iii)求取另一工作距离；

(vi)求取工作距离与另一工作距离之间的工作距离变化；和

(vii)基于距离变化和工作距离变化来求取折射率。

这种设计特别是用于求取样本折射系数的方法步骤的设计是有利的，因为其允许能够在样本空间中没有样本或散射介质的情况下测量折射系数。

根据本发明的方法，为了求取样本的和/或布置在样本空间中的光学介质的折射系数，替代地或附加地还可以包括如下方法步骤：

Ⅰ.借助光学设备使得测量光相对于光学轴线倾斜地射入到样本空间中；

Ⅱ.使得入射的光在反射部件上反射，该反射部件在样本空间中在第一位置被提供；

Ⅲ.使得反射的光成像到位置分辨的探测器上；

Ⅳ.在位置分辨的探测器上针对反射光的大小和/或偏移来分析被探测器探测到的信号；

Ⅴ.使得反射部件沿着光学轴线移动至第二位置，并执行方法步骤(Ⅲ)和(Ⅳ)；和

Ⅵ.针对反射部件的第一和第二位置，基于反射光的大小和/或偏移来求取折射系数。

如果上述方法仅仅执行到方法步骤(d)，则位置分辨的探测器上的焦点大小就已经可以给出关于反射部件相距光学设备的有效焦平面的距离的说明。该距离与介质的和/或样本的折射系数有关，也与光在该介质和/或样本中历经的路程有关。

如果在光学设备与反射部件之间存在一种介质例如空气，物镜与该介质的折射系数相协调，那么，当反射部件位于焦点平面中时，焦点就位于光学轴线上。这种测量可以被考虑用来校准。根据反射部件的移动，焦点在位置分辨的探测器上横向移动，这允许求取折射系数。

根据本发明的方法的另一有利的设计还可以包括读出校准数据，其中，可以根据求得的折射系数和/或根据读出的校准数据对至少一个显微镜参数进行调节。

根据本发明的装置的一种相应的设计因而可以包括存储器模块，在该存储器模块中可以存储至少一个光学设备的校准数据，其中，这些校准数据可由控制单元调用。

如果在根据本发明的方法中或者在根据本发明的装置中存储了校准数据，则已知的是，光学设备具有与折射系数和波长相关的多大的球面误差(或失焦)。存储为矫正值的折射系数或球面像差也可以根据所用的矫正件例如矫正环的设定予以存储。因而可行的是，在补偿时考虑对这些部分的矫正。但除了可以借助根据本发明的方法来获得这些数据外，这些特定于部件的值也可以“在工厂方”随之提供，因为这些值涉及光学设备的保持相同的特性(撇开存储在校准数据中的与波长和/或折射率的相关性不看)。这些校准数据原则上可以被规定用于在光学系统即例如显微镜中采用的全部光学部件，也就是存储在存储单元中。

根据本发明的装置的控制单元还可以被设计用来自动地或手动地测量样本的和/或浸渍介质的折射系数，并根据求得的折射系数来操纵在显微镜中的至少一个光路，使得该光路与求得的折射系数适配。特别优选地，通过操纵光路来补偿出现的像差比如失焦或球面像差。控制单元因而可以被设计用来求取折射系数，以及用来控制至少一个光路操纵器。

同样可行的是，读入非易失性存储介质的个人计算机控制本发明方法的方法步骤，并且例如计算折射系数。由于现有技术的显微镜日益具有基于计算机的控制和/或分析部，所以根据本发明的非易失性的计算机可读的存储介质是特别有利的，因为其允许改进已有的显微镜。此外通常，现有技术的显微镜已经可以具有可能的光路操纵器比如促动器和矫正环的特殊设计，在实施根据本发明的方法时可以动用这些光路操纵器。

附图说明

本发明的主题还将借助示范性的附图予以详述。在这些附图中示出了本发明的有利设计的例子，其中，相应设计的技术特征可以任意地相互组合和/或省去，如果不依赖于利用相应的被省去的技术特征实现的技术效果。为明了起见，相同的技术特征和相同功能的技术特征标有相同的标号。

图1示出现有技术的光片显微镜；

图2示出根据本发明的装置；

图3和4示出根据本发明的装置，特别是用来确定折射率的第一测量方法；

图5示出根据第一测量方法的用于确定折射率的方法步骤；

图6示出根据第二测量方法的用于确定折射率的方法步骤；

图7和8示出在根据第二测量方法确定折射率时光路的可能设计；和

图9和10示出用于摄取图像堆栈的方法。

具体实施方式

图1示出一种显微镜1，其设计成共焦显微镜3或光片显微镜5。该显微镜1包括设计成照明物镜7的光学设备9，该光学设备把激发波长239的照明光11从照明物镜7的照明侧13沿着光路8传输至照明物镜7的样本侧15，并且使得照明光11在用虚线示出的样本空间17中聚焦。照明物镜的光路8是照明光路8a。

在样本21内部形成焦点19，其中，样本21位于充有浸渍液体23的样本器皿25中。焦点19规定了焦点平面，该焦点平面也用标号19标出。

浸渍液体23可以理解成具有折射率n的样本介质27。折射率n也可以同义地称为折射系数n。

光学系统29包括光学设备9、样本器皿25和其中所含有的样本介质27，通过样本介质27的折射率n来影响该光学系统，从而可以针对不同的折射率n来改变焦点19的空间位置31。

在光学设备9的样本侧15，照明光11传播经过用虚线示出的自由光空间33。

无论在自由光空间33中，还是在样本器皿25中，都有光学介质35，该光学介质在自由光空间33内在所示例子中是空气37，而在样本器皿25内是样本介质27。

自由光空间33中的空气37相当于具有折射率n₁的另一种光学介质39。样本介质27具有折射率n₂，样本21具有折射率n₃。所有的折射率n₁～n₃都可以彼此不同。

图1中所示的显微镜1还包括探测光学件41，其由现有技术已知，因而不予详述。

在调节好的状态43下，照明光11的焦点19沿着光学轴线53准确地位于探测光学件41的焦平面45中，并且沿着照明方向(平行于焦平面45)居中地位于图像场中。由于折射率n的变化，相对于调节好的状态43会出现偏差，致使利用显微镜1无法再实现清晰的成像(未示出)。

特别地，图1中所示的显微镜1既可用作共焦显微镜3，又可用作光片显微镜5。为了用作光片显微镜5(其在图1中示出)，显微镜1具有布置在样本空间17中的反射部件49的反射表面47，其中，该反射部件49布置并固定在探测光学件41的探测物镜51上。反射部件49因而形成一种反射器55。

在图1中，照明光11在倾斜的反射表面47上反射，除了该反射表面外，反射部件49还具有另一反射表面47，该另一反射表面基本上垂直于光学设备9的和探测物镜51的光学轴线53朝向。在显微镜1的图1所示的设计中，光学设备9的和探测物镜51的光学轴线53重叠，在其它设计中可以相互平行地布置(见图3或图4)。

在图2中示出了设计成显微镜1的用于操纵至少一个光路8的装置85的示意性的结构。

此外，图2示出了PC 162，其用于控制设计成显微镜1的根据本发明的装置85，并且从非易失性的计算机可读的存储介质163中读取并执行用来实施根据本发明的方法的程序。

代替PC 162，也可以使用微型计算机，例如Arduino。除了用于控制显微镜的PC外，例如还可以设置这种微型计算机(未示出)。在PC 162或微型计算机中可以设置存储器，该存储器具有光学设备的和/或所用的矫正元件的校准数据，并且提供给显微镜用来操纵光路。

除了图1中所示的结构外，显微镜还具有示意性地以矩形的形式示出的折射系数求取模块56。该折射系数求取模块56可以包括探测设备57，该探测设备又可以包括光圈59和探测器63，该光圈的形式例如为针孔61。

在折射系数求取模块56a的第二设计中(在图2中的左边示出)，代替探测设备57，可以使用位置分辨的探测器58。在两种情况下，沿着光路8反射回来的测量光65b通过透镜192聚焦在探测器63或位置分辨的探测器58上。

需要指出，在图3和4中示出了测量光65，该测量光称为入射的测量光65a，其在反射部件49上反射，并且作为所述的被反射的测量光65b到达折射系数求取模块56或56a。

图2的装置85还具有多个光路操纵器170。这些光路操纵器尤其是可变形的反射镜172，该反射镜具有(至少局部地)可变地可调节的弯曲部174，并且特别是对于探测光学件41的光路8可以实现，相比于在光路8的中央180处的光程长度176即中央的光程长度176b，减小或者增大在可变形的反射镜172的边缘区域178中的光程长度176即外部的光程长度176a。

图2的装置85还包括带有可电调节的焦距的光学部件182，简写为ETL。利用ETL182可行的是，改变探测光学件41的有效焦距(未示出)，进而补偿探测光学件41的焦点19的与浸渍液体23的折射系数n₂有关的偏移(未示出)。

利用光路操纵器170因而可以调节显微参数2，比如球面像差或有效焦距。

无论探测光学件41还是照明物镜7，都包括矫正环184，该矫正环在图2中仅示意性地被示为矩形。

在装置85的不同设计中，图2中所示的光路操纵器170可以采用不同的组合设置。也就是说，可变形的反射镜172、ETL 182和一个或多个矫正环184是任选的。

尽管ETL 182基本上可以矫正焦点19的偏移，但无论可变形的反射镜172还是矫正环184，都能够特别是根据相距光学轴线53的距离r改变光程长度176。

在图3和4中示意地示出根据本发明的装置85，特别是用来确定折射率n的第一测量方法。

该装置85包括：光学设备9，该光学设备可以借助促动器模块87进行平移89；反射部件49，当反射部件49相距光学设备9处于工作距离79时，该反射部件借助光学设备9把反射的测量光65b成像到探测设备57的测量面(未示出)上或者成像在位置分辨的探测器58(见图2)上。在该设计中，光学设备9与另一光学设备9a是一致的。

所示的探测光学件41具有图像场237，该图像场即使在操纵光路时也优选基本上得以保持，即不变化。

借助至少一个促动器模块87，可以改变反射器55与测量光65的焦点19之间的距离93。

图3中的示意图示出了如下情况：测量光65的焦点19与反射部件49间隔开，并且可以测量反射部件49与测量光65的焦点19之间的距离93。

装置85还包括分析单元95，该分析单元仅针对图4的装置85详细示出。分析单元95以传输数据的方式，即通过数据线路97，与探测设备57或位置分辨的探测器58(其仅示意性地用矩形示出)连接，工作距离求取模块99和用于确定折射率n的折射率模块101，其中，折射率模块101以传输数据的方式与一个促动器模块87或多个促动器模块87和工作距离求取模块99连接，其中，该连接在中央通过控制器103即控制单元来进行。在其它设计中，折射率模块101直接与促动器模块87连接。

控制器103可以接收触发信号241，该触发信号可以在把样本装入到显微镜中情况下，在创建新项目时由计算机产生，或者由使用者手动地产生。编码地示出的触发信号241可以引起根据本发明的方法的开始。

分析单元95可以是折射系数求取模块56的一部分。

此外，工作距离求取模块99也通过控制器103与促动器模块87连接。控制器103还可以通过至少一个其它的操纵输出端186与至少一个光路操纵器170(见图2)以传输数据的方式连接。在所示的设计中，控制器与被设计成促动器模块87的光路操纵器170连接。

无论工作距离求取模块99还是折射率模块101，都具有数据输出端105。

分析单元95还可以包括存储器单元107，在该存储器单元中例如存储了或者可以存储事先规定的函数109或测量值111。此外，可以在存储器单元107中存储校准数据188，这些校准数据例如检测所用的光学件比如照明物镜7和/或探测光学件41的可能的成像误差，从而可以按照根据本发明的方法或者根据本发明的装置在操纵光路8时考虑这些成像误差。特别是对于具有矫正部件的物镜，例如可以把针对折射系数n的不同设定而存在的颜色相关性存储起来。对于可调的透镜，例如可以与设定的焦距相关地存储与理想透镜的偏差。

图3和4的反射部件49相距在光学介质35与另一光学介质39(在这种情况下为空气37)之间的界面235处于距离113处。为简明起见，把样本器皿25的壁115视为无限薄，而不予考虑。

光学设备9相距样本介质27处于距离117处，这里也不考虑壁115。

图4的状态基本上可以由图3的状态得到，其方式为，增大光学设备9与样本介质27之间的距离117，随后促动器模块87跟随光学设备9的探测光学件41随动；或者，减小反射器55与另一光学介质39之间的距离113，随后通过促动器模块87使得光学设备9移动离开反射器55。

图3中借助局部119示出了情况a)。在该局部中可看到，对光学设备9与样本介质27之间的距离117的改变导致测量光65的焦点位置123的确定的即可测量的距离变化121。

在图3中，反射部件49位于光学设备9的工作距离79处，而在图4中已改变了至少一个参数125，包括距离113和距离117在内，以便调节另一工作距离127。

图3的工作距离79和图4的另一工作距离127以工作距离值131的形式(示意性地用电信号表示)从工作距离求取模块99传送到控制器103，其中，该控制器通过计算模块(未示出)由工作距离79的工作距离值131和另一工作距离127的工作距离值131计算出工作距离变化129，该工作距离变化以工作距离变化值133的形式传送到折射率模块101。此外，控制器103基于与促动器模块87的传输数据的连接而求取出距离变化121，并且将该距离变化以距离变化值135的形式传输至折射率模块101。距离变化值135在图4中示意性地纯示范性地以三角脉冲的形式示出，以便区分。

基于工作距离变化值133和距离变化值135，折射率模块101计算出折射率n，或者计算出与折射率n成比例的测量值，并且将其在数据输出端105以折射率值137的形式予以提供。折射率值137示意性地用正弦波表示，以便区分。

将借助图5来介绍求取工作距离79的可行方案。示出了被探测设备57探测到的参数145(比如电压或电流)，该参数根据距离变化121既针对工作距离79示出，又针对另一工作距离127示出。确切地说，图5分别示出了与测量值111匹配的事先确定的函数109，其中，该事先确定的函数109用高斯函数147来表示。

高斯函数147只有两个参数125，即半值宽度149和中心151，其中，中心位于高斯函数147的极值153处。对于高斯函数147，参数125的数量N为二。如果使用其它事先确定的函数109，所需测量值111的数量就等于所用函数109的参数125的数量N。

不同地绘制的高斯函数147允许计算工作距离79以及另一工作距离127和由此得到的工作距离变化129。由工作距离变化129和距离变化121，折射率模块101(见图4)可以计算出折射系数或折射率n。

在图6中示出根据本发明的装置85的局部，特别是示出用于确定折射率n的第二测量方法。

示出了反射部件49，该反射部件如右边所示可以直接位于探测光学件41上，其中，反射部件49位于浸渍液体23即光学介质35中。

沿着探测光路190，测量光65经由透镜192引入到样本器皿25中，光学介质35位于该样本器皿中。

如果位于透镜192与样本器皿25之间的另一光学介质39具有与光学介质35相同的折射率n₁(即n₁＝n₂)，则会得到用短虚线示出的第一浸渍光路194。

如果另一光学介质39的光学密度大于光学介质35(即n₁>n₂)，则探测光路190中断，并且会得到用实线示出的第二浸渍光路196。

在两种情况下，相关的浸渍光路194、196射到反射部件49上，并且被其反射，从而反射的测量光65b沿着相应的测量光路198被引导至位置分辨的探测器58。这同样可以通过透镜192发生，该透镜使得反射的测量光65b聚焦。

如果观察由第一浸渍光路194得到的第一测量光路200，并将其与由第二浸渍光路196得到的第二测量光路202比较，则显然的是，第二测量光路202的第二入射点206在位置分辨的探测器58上相对于第一测量光路200的第一入射点204侧向错开地射出。

此外，如果反射部件49移动至虚线所示的第二位置208，则产生第三测量光路210，其在第三入射点212射在位置分辨的探测器58上。对入射点204、206、212的分析和特别是它们之间的变化，与反射部件49的距离变化121相关地提供光学介质35的折射系数n₂。

此外，采用图6中示意性地示出的方法也可以实现调节自动焦点。这由现有技术已知，在此不再赘述。

在图7和8中示出在根据图6的第二测量方法确定折射率时简化地示出的光路8的可能的设计。为简明起见，未示出样本器皿，并且探测光路190的反射在反射部件49的位置进行。

除了图6中所示的结构外，这些附图还示出偏转镜214，其使得测量光65朝向反射部件49偏转。

这些探测光路190的区别在于，其在图7中聚焦在偏转镜214上。这导致，由于两个透镜192，反射的测量光65b准直地射到位置分辨的探测器58上。

在该配置中，折射系数n的变化导致，宽的光斑216在其整体上改变其在位置分辨的探测器58上的位置。此外，如果反射部件49沿着光学轴线53移动，则这导致宽的光斑216减小或增大。

而在图8的探测光路190的配置中，其准直地射在偏转镜214上。通过两个透镜192的成像，一方面在反射部件49上形成中间焦点217，另一方面在位置分辨的探测器58上形成焦点19或聚焦的光斑218。

除了不同的必需的分析算法外，这两种配置还允许既改变样本空间中的光强220，又改变探测器上的光强222。因而在样本空间内例如在测量光65的强度很小的情况下或者在其弱化严重的情况下，图8的配置是优选的。

如果测量光65的强度处在位置分辨的探测器58的动态范围的边界区内，则相比于图8的相关性，图7的相关性是有利的。

借助图9和图10将简短地介绍用于摄取图像堆栈的方法。

示出了装置85，利用该装置要由位于样本空间17中的样本21产生三维的照片。这通过对图像堆栈224的摄像来进行，该图像堆栈示意性地在样本器皿25旁边示出。图像堆栈224包括多个独立图像225。

为了对这种图像堆栈224摄像，例如可以使得探测光学件41在移动方向226上移动。在图9中，探测光学件41的焦点19已经位于样本21之外，也就是说，该样本已从第一位置207(用虚线示出)移动至第二位置208。

在图10中示出探测光学件41的随着时间t的移动路程x，其中，由扫描距离229和时间t得到第一斜率228，在根本上说，该第一斜率表示探测光学件41在移动方向226上移动的速度。

由于在照明物镜7固定不动时照明光11的焦点19会具有侧向偏移230，所以照明物镜7也必须沿移动方向226移动。对于两种运动，例如可以分别采用促动器模块87。

但由于在探测光学件41移动时在光学介质中的路程部分165和在另一光学介质中的路程部分167彼此相对改变，所以照明物镜7必须以小于第一斜率228的第二斜率232沿移动方向226移动。在同一时间t，照明物镜7必须移动一段跟随路程233。如果光学介质35和另一光学介质39具有相同的折射系数n₂或n₁，第一斜率228就等于第二斜率232。然而一旦光学介质35的折射系数n₂不同于另一光学介质39的折射系数n₁，斜率228、232就会不同。

关于借助图9和10所述的用于对图像堆栈摄像的方法，可将探测光学件41视为第一光学设备9b，并将照明物镜7视为第二光学设备9c。

如果在所述方法的另一设计中照明物镜7首先移动(其中，在这种情况下，照明物镜7可以称为第一光学设备9b)，则在下一个方法步骤中跟随探测光学件41。在这种情况下，探测光学件41相应于第二光学设备9c。

因而在根据本发明的方法的一种设计中，可以在对图像堆栈224摄像期间在每个中间位置，即针对图像堆栈224的每个图像，都测量样本21的和/或浸渍介质23的折射系数，而在根据本发明的方法的另一种设计中，一次性地测量样本21的和/或浸渍介质23的折射系数，并由该折射系数计算出斜率228和232的差。特别是在前述的净化方法中—在所述方法中浸渍介质23的折射系数n与样本21的折射系数相匹配，根据本发明的方法的后提及的设计是有利的。

附图标记清单

1 显微镜

2 显微镜参数

3 共焦显微镜

5 光片显微镜

7 照明物镜

8 光路

8a 照明光路

9 光学设备

9a 另一光学设备

9b 第一光学设备

9c 第二光学设备

11 照明光

13 照明侧

15 样本侧

17 样本空间

19 焦点/焦点平面

21 样本

23 浸渍液体

25 样本器皿

27 样本介质

29 光学系统

31 空间位置

33 自由光空间

35 光学介质

37 空气

39 另一光学介质

41 探测光学件

43 调节好的状态

45 焦平面

47 反射表面

49 反射部件

51 探测物镜

53 光学轴线

55 反射器

56 折射系数求取模块

56a 折射系数求取模块的第二种设计

57 探测设备

58 位置分辨的探测器

59 光圈

61 针孔

63 探测器

65 测量光

65a 入射的测量光

65b 反射的测量光

79 工作距离

85 装置

87 促动器模块

89 平移

93 反射器与测量光焦点之间的距离

95 分析单元

97 数据线路

99 工作距离求取模块

101 折射率模块

103 控制器

105 数据输出端

107 存储器单元

109 事先规定的函数

111 测量值

113 反射器与另一光学介质之间的距离

115 壁

117 光学设备与样本介质之间的距离

119 局部

121 距离变化

123 焦点位置

125 参数

127 另一工作距离

129 工作距离变化

131 工作距离值

133 工作距离改变值

135 距离改变值

137 折射率值

147 高斯函数

149 半值宽度

151 中心

153 极值

162 PC

163 非易失性的计算机可读的存储介质

165 在光学介质中的路程部分

167 在另一光学介质中的路程部分

170 光路操纵器

172 可变形的反射镜

174 弯曲部

176 光程长度

176a 外部的光程长度

176b 中央的光程长度

178 边缘区域

180 中心

182 带有可电调节的焦距的光学部件

184 矫正环

186 操纵输出端

188 校准数据

190 探测光路

192 透镜

194 第一浸渍光路

196 第二浸渍光路

198 测量光路

200 第一测量光路

202 第二测量光路

204 第一入射点

206 第二入射点

207 第一位置

208 第二位置

210 第三测量光路

212 第三入射点

214 偏转镜

216 宽的光斑

217 中间焦点

218 聚焦的光斑

220 样本空间中的光强

222 探测器上的光强

224 图像堆栈

225 图像

226 移动方向

228 第一斜率

229 扫描距离

230 侧向偏移

232 第二斜率

233 跟随路程

235 界面

237 图像场

239 激发波长

241 触发信号

n 折射率

n₁ 另一光学介质的折射率

n₂ 样本介质的折射率

n₃ 样本的折射率

r 距离

t 时间

x 移动路程