阅读说明：本技术 一种球毛壳菌在防治小麦全蚀病中的应用 (Application of chaetomium globosum in preventing and treating wheat take-all ) 是由 徐飞 宋玉立 王俊美 张姣姣 韩自行 李亚红 李丽娟 刘露露 于 2020-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种球毛壳菌在防治小麦全蚀病中的应用,所述球毛壳菌的保藏名称为12XP1-2-3,保藏编号为CGMCC No.17183,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2019年1月23日。该球毛壳菌12XP1-2-3在平板上对小麦全蚀病菌GaNS90的抑制率为45.4％,田间试验结果表明,用球毛壳菌12XP1-2-3进行小麦种子包衣处理,可明显降低小麦白穗率和病情指数。(The invention provides an application of chaetomium globosum in preventing and treating wheat take-all, wherein the preservation name of the chaetomium globosum is 12XP1-2-3, the preservation number is CGMCC No.17183, the preservation unit is China general microbiological culture Collection center, and the preservation date is 2019, 1 month and 23 days. The inhibition rate of the Chaetomium globosum 12XP1-2-3 on a flat plate to wheat take-all pathogen GaNS90 is 45.4%, and field test results show that the Chaetomium globosum 12XP1-2-3 is used for coating wheat seeds, so that the wheat white spike rate and the disease index can be obviously reduced.)

一种球毛壳菌在防治小麦全蚀病中的应用

技术领域

本发明涉及一种球毛壳菌在防治小麦全蚀病中的应用。

背景技术

全蚀病是小麦的重要根部病害，能够引起小麦植株成簇或大片枯死，降低有效穗数、穗粒数及千粒重。小麦苗期和成株期都可以侵染。典型症状为小麦根部和茎基部为黑化，也称”黑脚病“，灌浆期田间出现成片状白穗。

长期以来通过使用化学药剂拌种等防治措施来进行防治，但是化学药剂的长期和过量使用不仅会破坏土壤微生态环境，加重环境污染，也易使小麦出苗期延迟、出苗率减少。因此，病害防治重点逐步转向生物防治和农业防治措施上。在农作物植物保护领域，利用作物的健株根际土壤筛选对病原菌具有显著生防效果的土壤微生物，并制成微生物菌剂是生物防控研究的重要手段之一，也是有益微生物资源开发利用的重要途径。毛壳菌属(Chaetomium sp.)真菌广泛分布于土壤及植物体内。该类微生物能产生毛壳素、球毛壳素等多种抗生素，作为植物病原菌的生物防治菌被广泛研究。目前利用分离到的球毛壳菌在防治小麦全蚀病未见报道。

发明内容

本发明提供一种球毛壳菌在防治小麦全蚀病中的应用，该球毛壳菌12XP1-2-3在平板上对小麦全蚀病菌GaNS90的抑制率为45.4％，田间药效试验结果表明使用球毛壳菌12XP1-2-3对小麦种子包衣处理后，既可以减少小麦白穗率，也能降低病级和病情指数。

本发明提供一种球毛壳菌在防治小麦全蚀病中的应用；

其中，所述球毛壳菌的保藏名称为12XP1-2-3，保藏编号为CGMCC No. 17183，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年1月23日。

本发明还提供一种含有上述球毛壳菌的生防菌剂在防治小麦全蚀病中的应用。

上述生防菌剂是按照以下方法制备得到的：对所述球毛壳菌菌株进行扩繁培养，得到孢子悬浮液，再将所述孢子悬浮液分散至羧甲基纤维素钠溶液中，即得所述生防菌剂。

优选地，所述羧甲基纤维素钠溶液的质量分数为4％，所述孢子悬浮液与所述羧甲基纤维素钠溶液的体积比为3:1。

上述所述生防菌剂在具体应用时，是以包衣浓度为5.0-5.3×10⁴个子囊孢子/ 每颗种子对小麦种子进行包衣处理。

生物保藏说明

生物材料：球毛壳菌12XP1-2-3；分类命名：球毛壳菌(拉丁文名称： Chaetomiumglobosum)，于2019年01月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号为CGMCC No.17183。

对比现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供的球毛壳菌12XP1-2-3，在平板上对小麦全蚀病菌GaNS90的抑制率为45.4％，室内盆栽试验结果表明该球毛壳菌12XP1-2-3可以显著降低小麦的病情指数，并增加小麦植株的株高；田间药效试验结果表明使用球毛壳菌 12XP1-2-3对小麦种子包衣处理后，小麦全蚀病引起的白穗率减少32.9％，也能降低病级和病情指数。

附图说明

图1是球毛壳菌12XP1-2-3对小麦全蚀病菌GaNS90的平板拮抗效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。

实施例1

球毛壳菌株12XP1-2-3的分离

于小麦灌浆期，在河南省西平县采集小麦全蚀病田中未发病的植株装纸袋中。样品置于4℃的冰箱保存。将样品根部冲洗干净，然后取小麦根部组织2-3cm，用质量分数75％无水乙醇表面消毒10-30s，质量分数1％NaCIO消毒1.5min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后，剪成0.5cm左右的小段，用无菌的镊子放置在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，原料组成为：去皮马铃薯300g、葡萄糖20g、琼脂20g及蒸馏水1000ml)平板上，在20℃下培养5-7天后，挑去边缘菌丝于新的PDA平板上生长，同样条件下5-7天后，挑去菌落均匀的菌丝块置于PDA斜面上培养，置于4℃保存。

实施例2

球毛壳菌株12XP1-2-3的DNA提取

将球毛壳菌株12XP1-2-3挑取至PDA培养基上，20℃培养5-7天后，挑取5 块边缘菌丝块均匀地放置到铺有灭菌玻璃纸的PDA平板上。3-5天后用灭菌的小铁铲刮取菌丝，并用液氮速冻，存放在-20℃的冰箱里。提取DNA时，取出20-25 mg菌丝入预冷的1.5ml的EP管中；加入少许液氮用预冷的铁钉在EP管中将菌丝研磨至粉末；加入500μl Extraction Buffer(50mM Tris-Cl(pH 8.0)，150mM NaCl，100mM EDTA(8.0))，在漩涡振荡器上振荡悬浮沉淀并混匀；然后加入预热的25μl(质量分数为20％)的十二烷基磺酸钠，颠倒混匀，在37℃水浴锅中放置1-3小时；然后加入75μl的5M NaCl，颠倒混匀；加入65μl的CTAB/ NaCl(10％CTAB，0.7M NaCl)溶液，65℃水浴30分钟；加入等体积的(700 μl)Tris-酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)的混合液，混匀，10000rpm，4℃离心10 分钟，将上清(550μl)转移至另一个EP管中；然后加入0.6倍体积的预冷的异丙醇(330μl)，-20℃沉淀10分钟，10000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；沉淀用质量分数70％的乙醇洗涤两次，放入工作台风干5-10分钟；干燥后的沉淀溶于适量的无菌ddH₂O中，-20℃保存。

实施例3

球毛壳菌株12XP1-2-3的分子鉴定

本试验采用引物ITS1(5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)和ITS4 (5’-TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3’)扩增待测菌株的包含ITS1、5.8S rDNA 和ITS2的DNA片段。体系参考Daval et al.(2010)。扩增反应条件：PCR反应程序为：95℃3min；95℃45s，50℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。 PCR产物测序后，在NCBI中进行BLAST序列比对分析。序列比对结果为生防菌12XP1-2-3为球毛壳。

表1.PCR反应体系

成分	浓度	用量(μl)
			10×PCR缓冲液	10mM	5.0
dNTP混合物	10mM	1.0
			TaqDNA酶	5u	0.5
引物1	20μM	1.0
			引物2	20μM	1.0
DNA模板	10-50ng/μl	1.0
			双蒸馏水	纯水	40.5
总体积(μl)		50.0

实施例4

球毛壳菌12XP1-2-3对小麦全蚀病菌的平板拮抗效果

将球毛壳菌12XP1-2-3用无菌牙签挑取在PDA上活化，培养条件为25℃， 12h光照12h黑暗；将小麦全蚀病菌GaNS90在1/5PDA上活化；培养条件为25℃，无光照；待菌落接近培养皿边缘时(7天后)用内径0.5cm打孔器分别把球毛壳菌、全蚀病菌菌落边缘打成若干菌饼。在1/5PDA培养皿距离圆心2.5cm处两段做标记；分别在所做标记处放入球毛壳菌和小麦全蚀病菌菌饼，两者中心相距 5cm；空白对照只放置小麦全蚀病菌菌饼，培养条件为25℃，无光照。10天后划线测定小麦全蚀病菌的生长情况，结果如图1所示。结果表明，球毛壳菌12XP1-2-3在平板上对小麦全蚀病菌GaNS90的抑制率为45.4％。

实施例5

球毛壳菌12XP1-2-3对室内盆栽的防治效果

取“周麦18”小麦种子足量，洗净，用质量分数3％次氯酸钠灭菌1-3min、清水浸泡24h备用。将小麦全蚀病菌菌株在PDA上活化，然后挑取边缘菌丝块在1/5PDA平板(20ml)上培养7天，接种备用。将球毛壳菌12XP1-2-3活化在 PDA培养基上生长10天备用。用内径9mm打孔器分别把培养好的球毛壳菌和全蚀病菌打成菌饼若干。采用玻璃管(长18cm，直径2.5cm)法测定球毛壳菌 12XP1-2-3对全蚀病的抗性。每支试管底部有孔便于浇水。每支试管从下往上依次加入棉球、6cm深的灭菌蛭石、2块9mm的全蚀菌菌丝块、1cm深的蛭石、 2块9mm的球毛壳菌丝块、1cm深的蛭石、3粒小麦种子、1cm的蛭石。每块9mm的菌丝块用挑针平均分为4小块。种好后，每管浇入10ml的蒸馏水，玻璃管口用保鲜膜密封，移入25℃培养箱发芽。两天后转入16℃，12h光照，湿度90％的培养箱中。每管每个星期浇入10ml(1/3v/v)的霍格兰氏大量元素溶液。病害调查按照下述分级标准进行。以根皮层或中柱变褐或变黑为病根。接种四个星期后将麦苗拔出，冲洗掉蛭石，记录病害等级并测量株高、根干重、茎叶干重。

分级标准为：

0＝健康；1＝黑根面积占总根面积<10％；2＝黑根面积占总根面积10-25％；3 ＝黑根面积占总根面积25-50％；4＝黑根面积占总根面积50-100％；5＝所有麦苗的根部变黑并且扩展到茎基部；6＝病斑扩展到茎部；7＝植物褪绿并停止生长； 8＝植株死亡。

结果如表2所示。

表2 球毛壳菌12XP1-2-3在周麦18上的室内盆栽防治效果

处理	病情指数	株高(cm)	单株干重
				12XP1-2-3种子包衣	0.46b	24.8a	0.085a
种子不包衣	0.76a	19.3b	0.071a
				LSD(p<0.05)	0.217	3.77	0.026

注：相同字母表示在0.05水平上没有显著性差异，不同字母表示在0.05水平上有显著性差异。

由表2可知，球毛壳菌12XP1-2-3对小麦种子包衣处理可以显著降低小麦的病情指数，增加株高。

实施例6

球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣防治小麦全蚀病田间效果

1、球毛壳菌对小麦全蚀病的田间防治效果

1.1、小麦全蚀病接种物的培养

小麦粒浸泡12h，然后灭菌60min，放置2天后，再灭菌30-60分钟，冷却后使用。选取小麦全蚀病菌强致病力菌株KX-7和中等致病力菌株GaNS-90在含抗生素的PDA平板上，生长7天后，挑取边缘菌丝在新鲜的PDA平板上生长， 7天后将菌丝块接入装好灭好菌的麦粒聚乙烯袋中，室温生长3个星期直至变黑，将强致病力菌株KX-7和中等致病力菌株GaNS-90培养的小麦粒等量混合，风干后存放于4℃冰箱。

1.2、建造田间病圃

按照种子量和接种物质量比为3:1的比例来建造病圃。接种位于种子下面5 cm，先使用播种机将小麦全蚀病菌麦粒培养物播入土中10cm左右，然后使用播种机将球毛壳菌包衣和全蚀净包衣的种子播入土中5cm。

1.3、球毛壳菌种子包衣制作

将挑选的球毛壳菌菌株在新鲜的PDA上活化，然后分别挑取菌丝块到100 个9cm的PDA培养皿，15天后加入无菌水用涂布棒将子囊壳研磨，将子囊孢子悬浮液控制在100mL左右，浓度在1.0-2.0×10⁷个/mL；如果浓度太低，用3000 rpm 5min离心，然后去水重新悬浮。75mL的菌液(1.3×10⁷个/mL)加入25mL 的质量分数4％羧甲基纤维素盐的溶液，混合成100mL1％的羧甲基纤维素盐的菌液(1.0×10⁷个/mL)。100mL1×10⁷个/mL 1％的羧甲基纤维素盐的菌液加入5kg 小麦种子混合均匀。球毛壳菌12XP1-2-3包衣种子冲洗后涂平板测定种子表面的孢子数量，为5.0-5.3×10⁴个子囊孢子/每颗种子。2016-2017年小麦品种为“郑麦101”，2017-2018年小麦品种为“百农207”，对照组药剂为125g/L全蚀净 10mL/5kg包衣种子。

1.4、数据调查和记录

田间样品取样方法：苗期调查出苗率，并测定株高、主根长、鲜重、干重、球毛壳菌定殖能力；分蘖期调查发病率，并测定株高、主根长、鲜重、干重、分蘖数，球毛壳菌定殖能力；拔节期调查发病率；灌浆期调查白穗率，调查方式为每个小区调查9m双行白穗数和总穗数，计算得到小区白穗率，并在每个小区中五点取样选取30个茎，每个处理共270个茎带回实验室，在水龙头下冲洗干净后测定病级，成株期分级标准为：

0＝无病根；1＝根系发病面积占<10％；2＝根系发病面积占11-25％；3＝根系发病面积占26-50％；4＝根系发病面积占51-75％；5＝根系发病面积占76-100％或者茎基部黑化。结果见表3。

表3 2016-2017年度和2017-2018年度小麦灌浆期球毛壳菌种子包衣防治小麦全蚀病的效果

注：相同字母表示在0.05水平上没有显著性差异，不同字母表示在0.05水平上有显著性差异。

由表2可知，苗期和分蘖期调查，小麦全蚀病菌侵染的很少，灌浆期调查， 2016-2017年度小麦品种为“郑麦101”，空白对照组的白穗率为7.3％，球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理白穗率为4.9％。2017-2018年度小麦品种为“百农 207”，空白对照组的白穗率为9.9％，球毛壳菌12XP1-2-3种子包衣处理白穗率为3.9％。提示本发明提供的球毛壳菌12XP1-2-3将种子包衣处理后，既可以减少白穗率，也能降低病级和病情指数。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。