阅读说明：本技术 一种白藜芦醇a环n(ch3)2基衍生物及其制备方法和应用 (Resveratrol A ring N (CH)3)2Base derivatives, preparation method and application thereof ) 是由 刘展 刘索思 张渝 揭敏 吴维智 王向阳 蔡华 于 2020-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种白藜芦醇A环N(CH<Sub>3</Sub>)<Sub>2</Sub>基衍生物及其制备方法和应用,属于医药技术领域。本发明提供了一种具有式I所示的结构白藜芦醇A环N(CH<Sub>3</Sub>)<Sub>2</Sub>基衍生物,作为钠氢交换蛋白-1(NHE1)受体拮抗剂靶向性作用于NHE1受体,并且同时抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/AKT)信号通路和Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)这2条信号传导通路,起到治疗酒精性脂肪肝的作用。<Image he="292" wi="700" file="DDA0002641580810000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention provides resveratrol A-ring N (CH) 3 ) 2 A derivative, a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of medicine. The invention provides resveratrol A ring N (CH) with a structure shown in a formula I 3 ) 2 The derivative, as a sodium hydrogen exchanger-1 (NHE1) receptor antagonist, acts on an NHE1 receptor in a targeting way, and simultaneously inhibits 2 signal conduction paths of a phosphatidylinositol 3-kinase/protein serine threonine kinase (PI3K/AKT) signal path and a Janus kinase/signal transduction and transcription activator (JAK/STAT), thereby playing a role in treating alcoholic fatty liver.)

一种白藜芦醇A环N(CH3)2基衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

酒精性脂肪肝是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，是酒精性肝病中的一个分型。酒精性脂肪肝是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。当肝脏细胞受损时，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)溢出导致血清ALT和AST含量升高，所以通过测量血清ALT和AST活性可反映酒精性脂肪肝患者肝细胞损害的程度及肝细胞的修复情况。

目前，临床上没有治疗酒精性脂肪肝的统一标准，常用的辅助性干预手段包括胰岛素增敏剂、调脂药以及抗氧化剂等。治疗酒精性脂肪肝的常用药物包括：①西药类如蛋氨酸胆碱、卵磷脂、水飞蓟素、肌苷、辅酶A、肉毒碱乳清酸盐等，主要作用为保护肝细胞、增加脂肪转运功能；②抗氧化剂如白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、牛磺酸、维生素E，主要作用是抑制胆固醇、甘油三酯氧化及脂质堆积；③中药类如姜黄、制何首乌、山楂等，主要作用为降血脂，防止胆固醇在肝内沉积。

现有技术中，白藜芦醇具有较好的抗氧化作用。但是，白藜芦醇的治疗酒精性脂肪肝的作用并不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物对酒精性脂肪肝有治疗作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物，具有式I所示的结构：

本发明还提供了上述技术方案所述的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将亚磷酸二乙酯、有机溶剂、NaH和4-甲氧基苄溴混合进行去溴反应，得到具有式1所示结构的化合物；

将4-二甲氨基水杨醛、有机溶剂、氯甲基甲醚和二异丙基乙胺混合进行取代反应，得到具有式2所示结构的化合物；

将具有式1所示结构的化合物、具有式2所示结构的化合物、有机溶剂和NaH混合进行缩合反应，得到具有式3所示结构的化合物；

将具有式3所示结构的化合物、叔丁醇和对甲苯磺酸吡啶盐混合进行回流，得到具有式I所示结构的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物；

优选地，所述去溴反应的时间为1～3h。

优选地，所述取代反应的时间为10～30min。

优选地，所述缩合反应的温度为0～100℃，时间为1～3h。

优选地，所述回流的温度为90～100℃，时间为1～3h。

优选地，所述具有式3所示结构的化合物与对甲苯磺酸吡啶盐的摩尔比为1:2～2.1。

本发明还提供了上述技术方案所述的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物或上述技术方案所述制备方法制得的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物在制备治疗酒精性脂肪肝药物中的应用。

优选地，所述治疗酒精性脂肪肝药物包含有效剂量的具有式I所示结构的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物、其衍生物、其立体异构体、可药用盐和药学上可接受的载体、辅料、赋形剂和稀释剂。

优选地，所述治疗酒精性脂肪肝药物的剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂药学上可接受的剂型。

本发明提供了一种具有式I所示的结构白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物，作为钠氢交换蛋白-1(NHE1)受体拮抗剂靶向性作用于NHE1受体，并且同时抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/AKT)信号通路和 Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)这2条信号传导通路，起到治疗酒精性脂肪肝的作用。

本发明还提供了上述技术方案所述的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物的制备方法，本发明提供的制备方法条件温和，原料成本低，操作容易，收率高。

附图说明

图1为本发明制备的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物治疗酒精性脂肪肝机制信号通路图；

图2为本发明制备白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物的反应原理图；

图3为不同实验分组对初体质量的影响；

图4为不同实验分组对末体质量的影响；

图5为不同实验分组对对肝指数的影响；

图6为不同实验分组对血清TG含量的影响；

图7为不同实验分组对血清TC含量的影响；

图8为不同实验分组对血清HDL-C含量的影响；

图9为不同实验分组对血清ALT含量的影响；

图10为不同实验分组对血清AST含量的影响；

图11为不同实验分组对血清SOD含量的影响；

图12为不同实验分组对血清MDA含量的影响；

图13为不同实验分组对肝脏镜下结构影响(400×)；

图14为不同实验分组对肝脏NHE-1表达免疫组化的影响(400×)；

图15为不同实验分组对肝脏NHE-1表达WesternBlot的影响(400×)；

图16为不同实验分组对肝脏NHE-1表达WesternBlot的影响统计图；

图17为不同实验分组对肝脏PI3K和STAT免疫荧光的影响(400×)。

具体实施方式

本发明提供了一种白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物，具有式I所示的结构：

在本发明中，所述具有式I所示的结构的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物的化学命名为2-二羟基-4'-甲氧基-4-二甲氨基-1,2-二苯基乙烯((E)-5-(dimethylamino)-2-(4-methoxystyryl)phenol)，分子式为C₁₇H₁₉NO₂，分子量为269。

图1为白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物治疗脂肪肝机制信号通路图，白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物，作为钠氢交换蛋白-1(NHE1)受体拮抗剂靶向性作用于NHE1受体，并且同时抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/AKT)信号通路和Janus激酶/信号转导与转录激活子 (JAK/STAT)这2条信号传导通路，起到治疗酒精性脂肪肝的作用。

本发明还提供了上述技术方案所述的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物的制备方法，包括以下步骤：

将亚磷酸二乙酯、有机溶剂、NaH和4-甲氧基苄溴混合进行去溴反应，得到具有式1所示结构的化合物；

将4-二甲氨基水杨醛、有机溶剂、氯甲基甲醚和二异丙基乙胺混合进行取代反应，得到具有式2所示结构的化合物；

将具有式1所示结构的化合物、具有式2所示结构的化合物、有机溶剂和NaH混合进行缩合反应，得到具有式3所示结构的化合物；

将具有式3所示结构的化合物、叔丁醇、对甲苯磺酸吡啶盐混合进行回流，得到具有式I所示结构的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物；

在本发明中，若无特殊说明，本发明所用的原料均为市售商品。

在本发明中，所述制备方法的反应原理如图2所示。

本发明将亚磷酸二乙酯、有机溶剂、NaH和4-甲氧基苄溴混合进行去溴反应，得到具有式1所示结构的化合物。在本发明中，所述有机溶剂优选为 DMF。

在本发明中，所述亚磷酸二乙酯、有机溶剂、NaH和4-甲氧基苄溴的用量比优选为10mmol：8mL：15mmol：15mmol。

在本发明中，所述去溴反应的时间优选为1～3h，所述去溴反应的温度优选为室温，不需要额外的加热或降温。

本发明优选将亚磷酸二乙酯溶于的DMF中后，在冰水浴条件下加入 NaH，半小时后再加入4-甲氧基苄溴。

所述去溴反应完成后，本发明优选加入饱和氯化铵溶液猝灭反应，然后用二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化，得到具有式1所示结构的化合物。本发明对所述二氯甲烷萃取和减压蒸馏的具体操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。在本发明中，所述柱层析纯化使用的洗脱剂优选为石油醚-乙酸乙酯混合液，所述混合液中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为1:1。

本发明将4-二甲氨基水杨醛、有机溶剂、氯甲基甲醚和二异丙基乙胺混合进行取代反应，得到具有式2所示结构的化合物。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯甲烷。

在本发明中，所述4-二甲氨基水杨醛、有机溶剂、氯甲基甲醚和二异丙基乙胺的用量比优选为10mmol：40mL：15mmol：15mmol。

在本发明中，所述取代反应的时间优选为10～30min。

本发明优选将4-二甲氨基水杨醛溶于二氯甲烷，在冰水浴条件下加入氯甲基甲醚和二异丙基乙胺。

所述取代反应完成后，本发明优选加入饱和氯化铵溶液猝灭反应，然后用二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化，得到具有式2所示结构的化合物。本发明对所述二氯甲烷萃取和减压蒸馏的具体操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。在本发明中，所述柱层析纯化使用的洗脱剂优选为石油醚-乙酸乙酯混合液，所述混合液中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为5:1。

得到具有式1和式2所示结构的化合物后，本发明将具有式1所示结构的化合物、具有式2所示结构的化合物、有机溶剂和NaH混合进行缩合反应，得到具有式3所示结构的化合物。在本发明中，所述有机溶剂优选为DMF。

在本发明中，所述具有式1所示结构的化合物、具有式2所示结构的化合物、有机溶剂和NaH的用量比优选为3mmol：4.5mmol：4mL：4.5mmol。

在本发明中，所述缩合反应的温度优选为0～100℃，时间优选为1～3h。在本发明中，所述缩合反应优选在油浴锅中进行。

本发明优选将具有式1所示结构的化合物溶于DMF中，在冰水浴条件下加入NaH，然后再加入具有式2所示结构的化合物。

所述缩合反应完成后，本发明优选将所得缩合产物自然冷却至室温后，加入饱和氯化铵溶液猝灭反应，然后用二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化，得到具有式3所示结构的化合物。本发明对所述二氯甲烷萃取和减压蒸馏的具体操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。在本发明中，所述柱层析纯化使用的洗脱剂优选为石油醚-乙酸乙酯混合液，所述混合液中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为10:1。

得到具有式3所示结构的化合物后，本发明将具有式3所示结构的化合物、叔丁醇和对甲苯磺酸吡啶盐混合进行回流，得到具有式I所示结构的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物。

在本发明中，所述回流的温度优选为90～100℃，更优选为95℃，时间优选为1～3h。在本发明中，所述回流优选在油浴锅中进行。

在本发明中，所述具有式3所示结构的化合物与对甲苯磺酸吡啶盐的摩尔比优选为1:2～2.1。

在本发明中，所述具有式3所示结构的化合物与叔丁醇的用量比优选为1 mmol：4mL。

本发明优选将所述具有式3所示结构的化合物溶于叔丁醇中，再加入对甲苯磺酸吡啶盐。

所述回流完成后，本发明优选将所得回流产物自然冷却至室温后，加入水猝灭反应，然后用二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化，得到具有式3 所示结构的化合物。本发明对所述二氯甲烷萃取和减压蒸馏的具体操作没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可。在本发明中，所述柱层析纯化使用的洗脱剂优选为石油醚-乙酸乙酯混合液，所述混合液中石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为3:1。

本发明还提供了上述技术方案所述的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物或上述技术方案所述制备方法制得的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物在制备治疗酒精性脂肪肝药物中的应用。

在本发明中，所述治疗酒精性脂肪肝药物优选包含有效剂量≥10mg/kg 的具有式I所示结构的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物、其衍生物、其立体异构体、可药用盐和药学上可接受的载体、辅料、赋形剂和稀释剂。在本发明中，所述有效剂量优选为≥10mg/kg。

在本发明中，所述治疗酒精性脂肪肝药物的剂型优选包括片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或纳米制剂药学上可接受的剂型。

为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的白藜芦醇A环 N(CH₃)₂基衍生物及其制备方法和应用、海底微生物燃料电池进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、药物：白藜芦醇(南京春秋生物工程有限公司)；对甲氧基苄溴、2- 羟基-5-二甲氨基苯甲醛、氯甲基甲醚、四氢呋喃、氢化钠、二氯甲烷、亚磷酸二乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、对甲苯磺酸吡啶盐、(安耐吉化学有限公司)；复方蛋氨酸胆碱片(中国通化东宝药业股份有限公司)；NHE1一抗(BM5689)、 PI3K一抗(BM4344)、STAT一抗(M00337)(武汉博士德生物工程有限公司)。

白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物合成方法：

(1)亚磷酸二乙酯(10mmol，1.38g)溶于的DMF(8mL)中，在冰水浴条件下加入NaH(15mmol，0.36g)，半小时后加入4-甲氧基苄溴(15 mmol，3.02g)，反应1小时。待反应完全后，加饱和氯化铵溶液猝灭反应，用二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得具有式1所示结构的化合物，收率90％；

(2)4-二甲氨基水杨醛(10mmol，1.65g)溶于二氯甲烷(40mL)中，在冰水浴条件下加入氯甲基甲醚(15mmol，1.21g)和二异丙基乙胺(15mmol， 1.94g)，反应2小时。加饱和氯化铵溶液猝灭反应，二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得具有式2所示结构的化合物，转化率98％；

(3)具有式1所示结构的化合物(3mmol，0.774g)溶于DMF(4mL) 中，在冰水浴条件下加入NaH(4.5mmol，0.11g)，反应半小时后加入具有式2所示结构的化合物(4.5mmol，0.94g)，置于100℃油浴中反应1小时。待反应完全后，冷却至室温，加饱和氯化铵溶液猝灭反应，用二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)，得具有式3所示结构的化合物，收率95％；

(4)具有式3所示结构的化合物(1mmol，0.313g)溶于叔丁醇(4mL) 中，加入对甲苯磺酸吡啶盐(2mmol，0.502g)，置于95℃油浴中加热回流 1小时。待反应完全后，冷却至室温，加水猝灭反应，用二氯甲烷萃取，减压蒸馏后柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，得具有式I所示结构的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物，收率84％；

对制得的白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物进行结构表征，white solid；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.88(s,6H),3.75(s,3H),6.23-6.28(m,2H), 6.88-6.92(m,3H),7.15(d,J＝16.4Hz,1H),7.36(d,J＝8.4Hz,1H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),9.41(brs,1H).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ:40.6,55.5,105.2, 114.6,122.3,123.4,127.2,127.4,127.9,130.6,131.7,151.0,156.1,158.5.

2、动物：Sprague-Dawley(SD)大鼠，6周龄、雄性、180～220g、清洁级由湖南师范大学提供。

3、实验分组：大鼠在实验室适应饲养1周，在活动、进食、粪便均无异常，56只大鼠按随机数字表随机分为6组：(1)正常对照组：常规饮食12 周；(2)酒精性脂肪肝疾病模型组：50％酒精灌胃，10ml/kg/d，8周；(3) 复方蛋氨酸胆碱治疗组(10mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加复方蛋氨酸胆碱(10mg/kg)；(4)白藜芦醇治疗组(10mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加白藜芦醇(10mg/kg)； (5)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物低剂量治疗组(2mg/kg)：高脂饮食8 周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物 (2mg/kg)；(6)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组(10mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物(10mg/kg)；(7)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组 (50mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物(50mg/kg)。第12周末将大鼠用2％戊巴比妥钠 (45mg/kg)腹腔注射，麻醉后下腔静脉取血，将血标本离心后用于血清学指标检测；取肝左叶，用10％中性***溶液固定，石蜡包埋切片，作肝组织病理学观察；取肝右叶，提取蛋白进行WesternBlot检测；取肝右叶，冰冻处理，进行免疫荧光检测。

4、实验内容：

4.1大鼠一般情况：观察大鼠活动度、饮食情况、皮毛光泽、睡眠状况。

4.2体重、肝指数：天平称量体重，麻醉处死后，取肝脏称重；肝指数 (％)＝肝脏重量(g)/体重(g)×100％。

4.3血清TG、TC、HDL-C含量：大鼠股动脉取血，肝素抗凝管收集血样，30分钟内于4℃温度下1500r/分钟离心8分钟，离心后取上层血清于-80℃冷冻保存。预留组织按照1:9质量比加入生理盐水，电子匀浆器匀浆10分钟， 4℃温度下1500r/分钟，离心8分钟，离心后取上清液-80℃冷冻保存。将4℃保存的Elisa试剂盒在室温下平衡30分钟，从铝箔袋中取出所需Elisa反应板，剩余反应板用自封袋密封后4℃保存。用标记笔设置空白孔、标准品孔、样本孔，其中空白孔空置，样本孔和标准品孔各加入不同待测样本和不同浓度的标准品50μL。样本孔和标准品孔中分别加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体 100μL，用封板膜密封Elisa反应板上的各个反应孔后放入37℃水浴锅中孵育 60分钟。弃去反应孔中液体，在吸水纸上拍干反应孔中残留水份。各反应孔中加入蒸馏水与洗涤缓冲液按照1:20体积比配制的洗涤液350μL，室温下静置1分钟，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干反应孔中残留水份，重复5次。取底物A、B各50μL分别加入各反应孔中，37℃温箱中避光孵育15分钟。取终止液50μL分别加入各反应孔中，15分钟内在酶标仪设定450nm波长处测定各孔OD值。以所测标准品浓度值为纵坐标、OD值为横坐标，软件绘制标准曲线并得到直线回归方程。将检测样本的OD值代入上述直线回归方程中即可计算出检测样本的浓度。

4.4血清ALT、AST含量：方法同4.3。

4.5血清SOD、MDA含量：方法同4.3。

4.6HE染色：将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1～2小时；石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水；苏木素染10分钟；流水冲洗，去余色；0.7％盐酸乙醇分化数秒钟；流水冲洗，切片变蓝约15分钟；7.95％乙醇30秒钟；酒精性伊红染30秒；I95％乙醇30秒钟；II95％乙醇30秒钟；I100％乙醇30秒钟； II100％乙醇30秒钟；石碳酸二甲苯30秒钟；I二甲苯30秒钟；II二甲苯30 秒钟；中性树胶封片。

4.7免疫组化：石蜡切片脱蜡至水；3％H₂O₂室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡2次，每次5分钟；5～10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1小时或4℃过夜；PBS冲洗，3次，每次5分钟；滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10分钟；PBS冲洗，3次，每次5 分钟；滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育 10分钟；PBS冲洗，3次，每次5分钟；显色剂显色3分钟(DAB或NBT/BCIP) 自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

4.8 WesternBlot：在组织匀浆液中加入PMSF(1:100)和Cocktail (1:1000)，组织匀浆液按照15μL/mg比例加入混合后的组织匀浆液，电动匀浆器调整为30次/mim，然后顺时针匀浆50次，逆时针匀浆50次。将组织悬液吸取到5mL离心管内并加入1/3体积的Buffer缓冲液，震荡混合均匀。然后放置于试管架上并进行水浴煮沸10分钟，然后用20k赫兹超声震荡20 次后离心，4℃/12000g/5分钟后取上清液于离心管后-80℃保存。BSA梯度溶液配制，首先配置10μg/μL的BSA缓冲溶液，依次用双蒸水进行梯度稀释为标准蛋白，稀释浓度依次为0μg/μL、0.2μg/μL、0.4μg/μL、0.6μg/μL、0.8μg/μL、 1.0μg/μL。将蛋白上清离心管从-80℃冰箱中取出置于冰上，缓慢溶解后吸取 2μL蛋白样品并加入18μL双蒸水，并且混合震荡混匀。首先96孔板上设置3 个平行孔，然后以5μL/孔的容量加入上述混合震荡混匀蛋白样品和BSA梯度缓冲溶液。取试剂盒中A液50份，B液1份，混合均匀后配制成工作液并迅速在96孔板各孔中加入95μL，96孔板置于培养箱中，37℃温度下孵育30分钟。分光光度计设定在562nm光波波段波，测定吸光度值并绘制标准蛋白曲线，计算得出样品蛋白浓度值。取1份溴酚蓝和3份β-巯基乙醇，并且混合震荡混匀。混合液用双蒸水稀释10倍，在水浴锅中煮沸10分钟，振荡混匀。胶板加入10％分离胶室温静置，待胶凝固后倾去水层，用滤纸吸干。之后加入5％浓缩胶室温静置，凝固后待用。将胶板置于电泳槽中固定，沿着电泳槽缓慢加入电泳液，然后将样本充分混匀，用微量加样器在电泳槽泳道中加入蛋白样品，用80V恒定电压电泳30分钟直至样本跑至分离胶后，用120V恒定电压电泳分离，电泳时间的制定根据目的蛋白的分子量确定。记号笔标记硝酸纤维素膜后浸于预先处理好的转膜工作液中，剥下分离胶并根据目的蛋白的分子量范围横向切胶，从负极到正极方向依次放置纤维海绵垫→3层滤纸→胶板→硝酸纤维素膜→3层滤纸→纤维海绵垫。上述材料堆积呈梯形后放入预先置于0℃孵育的转膜槽中，在252mA恒定电流转膜，转膜时间根据目的蛋白的分子量确定，一般控制在1h。转膜结束后将硝酸纤维素膜从转膜槽中取出，用PBS冲洗2次，每次冲洗5分钟。然后用10％羊血清或2％牛血清白蛋白100μL，室温下浸泡10分钟，用PBS冲洗3次，每次冲洗5分钟。选用适当比例稀释浓缩液后1cm²滴加40μL一抗。37℃孵育1～2h或4℃过夜，洗涤缓冲液清洗3次，每次清洗10分钟→次日取出硝酸纤维素膜并回收一抗， TBS缓冲液加入0.02％吐温20，漂洗3次，每次5分钟，保鲜袋封闭处理，选用适当比例稀释浓缩液后1cm²滴加40μL生物素化二抗，37℃孵育1h或4℃过夜后PBS冲洗5分钟并重复3次。取出硝酸纤维素膜并回收二抗，TBS缓冲液加入0.02％吐温20，漂洗3次，每次5分钟。漂洗完毕后，用TBS缓冲液漂洗3次，每次5分钟。分别在700nm光波波段处对硝酸纤维素膜扫描。

4.9免疫荧光：冰冻切片抗体孵育，PBS清洗3次，每次5分钟；按相应比例稀释一抗，每孔滴加一抗50μL，4℃孵育过夜，回收一抗，PBS清洗， 5分钟×3次；滴加相应种属的荧光二抗，室温避光孵育1小时，去除二抗， PBS清洗3次，每次5分钟；滴加稀释的第二种一抗，50μL/孔，4℃孵育过夜；回收一抗，PBS清洗3次，每次5分钟；滴加相应种属的荧光二抗，室温避光孵育1小时，去除二抗，PBS清洗3次，每次5分钟，滴加少量PBS，覆盖细胞即可。PBS缓冲液加入0.1％的TritonX-100，96孔培养板清洗3次，每次5分钟，加入含1:500倍Hoechst稀释的PBS避光静置10分钟。PBS缓冲液加入0.1％的TritonX-100，96孔培养板清洗3次，每次清洗3分钟，在载玻片上滴加100μL抗荧光淬灭封片液并用盖玻片封片，室温静置1分钟后保持水平位置放置于4℃冰箱并注意避光保存。24小时后可在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察细胞形态及染色情况。

5、统计学方法：所有数据以均数±标准差(±s)表示。组间差异比较用 ANOVA及Newman-Student多重比较；t检验分析，由SPSS 13.0统计软件完成，双侧P＜0.05认为差异有显著性。

6、结果

6.1一般情况：(1)正常对照组大鼠精力充沛，灵活好动，饮食正常，皮毛整洁，体重缓慢增加；(2)酒精性脂肪肝疾病模型组饮食量大，嗜睡，毛色偏黄，个体较大，体重增长较正常组较快，有不同程度的精神萎靡，活动减少，皮毛凌乱；(3)复方蛋氨酸胆碱治疗组、白藜芦醇治疗组上述症状轻微改善或者改善不明显；(4)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物低剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组上述症状改善明显，且随着剂量的增加，改善程度逐渐增强。

6.2体重、肝指数：结果见表1以及图3～5，图3为不同实验分组对初体质量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。图4为不同实验分组对末体质量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。图5为不同实验分组对肝指数的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，dP<0.01。由表1以及图3～5可知，(1)与正常对照组相比，其余各组大鼠初体质量无明显差异(P＞0.01)；(2)与酒精性脂肪肝疾病模型组相比，白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠末体质量、肝指数均明显下降 (P<0.01)；(3)与白藜芦醇治疗组相比，白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠末体质量、肝指数均明显下降(P<0.01)。

表1大鼠体重、肝指数(n＝8，)

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，bP<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，cP<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，dP<0.01。

6.3血清TG、TC、HDL-C含量：结果见表2、图6～8，图6为不同实验分组对血清TG含量的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。图7为不同实验分组对血清TC含量的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。图8为不同实验分组对血清HDL-C含量的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较， c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。由表2、图6～8可知，(1)与酒精性脂肪肝疾病模型组相比，白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠TG、TC均明显下降， HDL-C明显升高(P<0.01)；(2)与白藜芦醇治疗组相比，白藜芦醇A环 N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠TG、TC均明显下降，HDL-C明显升高(P<0.01)。

表2血清TG、TC、HDL-C含量(n＝8，)

注：与正常对照组比较，aP<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，bP<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，cP<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，dP<0.01。

6.4血清ALT、AST含量：结果见表3、图9～10，图9为不同实验分组对血清ALT含量的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。图10为不同实验分组对血清AST含量的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，bP<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。由表3、图9～10可知：(1)与酒精性脂肪肝疾病模型组相比，白藜芦醇A 环N(CH₃)₂基衍生物低剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠ALT、AST均明显下降(P<0.01)；(2)与白藜芦醇治疗组相比，白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠ALT、 AST均明显下降(P<0.01)。

表3血清ALT、AST含量(n＝8，

)

注：与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。

6.5血清SOD、MDA含量：结果见表4、图11～12，图11为不同实验分组对血清SOD含量的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。图12为不同实验分组对血清MDA含量的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较， d P<0.01。由表4、图11～12可知：(1)与酒精性脂肪肝疾病模型组相比，白藜芦醇治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物低剂量治疗组、白藜芦醇A 环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠SOD明显升高、MDA明显降低(P<0.01)；(2)与白藜芦醇治疗组相比，SOD、MDA在白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物各剂量组之间没有差异(P＞0.01)。重点说明：白藜芦醇虽然具有较好的抗氧化作用，但是对酒精性脂肪肝却没有较好的干预作用；白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物具有较好的抗氧化作用，但是对酒精性脂肪肝却有较好的干预作用。说明，白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物对酒精性脂肪肝的干预作用不是通过抗氧化作用完成的。

表4血清SOD、MDA含量(n＝8，)

注：与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。

6.6HE染色：结果见图13，图13为不同实验分组对肝脏镜下结构影响 (400×)，可知，(1)酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞出现较为明显的气球样变，脂肪变性面积明显高于正常对照组；(2)白藜芦醇治疗组对肝细胞的气球样变并没有明显的抑制作用，脂肪变面积并没有明显缩小；(3)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组大鼠肝细胞出现较为明显的气球样变，脂肪变性面积明显高于酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠。

6.7免疫组化：结果见图14，图14为不同实验分组对肝脏NHE-1表达免疫组化的影响(400×)，可知，(1)酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞黄棕色染色颗粒明显增多，NHE1表达明显高于正常对照组；(2)白藜芦醇治疗组没有抑制肝细胞黄棕色染色颗粒增多，NHE1表达与酒精性脂肪肝疾病模型组没有明显差异；(3)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组明显抑制肝细胞黄棕色染色颗粒增多，NHE1表达与酒精性脂肪肝疾病模型组有明显差异。

6.8 WesternBlot：结果见图15～16，图15为不同实验分组对肝脏NHE-1 表达WesternBlot的影响(400×)，其中(1)正常对照组；(2)酒精性脂肪肝疾病模型组；(3)复方蛋氨酸胆碱治疗组；(4)白藜芦醇治疗组；(5) 白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物低剂量治疗组；(6)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组；(7)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组。图16为不同实验分组对肝脏NHE-1表达WesternBlot的影响统计图，与正常对照组比较，a P<0.01；与酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与白藜芦醇治疗组比较，d P<0.01。由图 15～16可知：(1)酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞灰度明显增多，NHE1 表达明显高于正常对照组；(2)白藜芦醇治疗组没有抑制肝细胞灰度增多， NHE1表达与酒精性脂肪肝疾病模型组没有明显差异；(3)白藜芦醇A环 N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组明显抑制肝细胞灰度增多，NHE1表达与酒精性脂肪肝疾病模型组有明显差异。

6.9免疫荧光：结果见图17，图17为不同实验分组对肝脏PI3K和STAT 免疫荧光的影响(400×)，其中(1)正常对照组；(2)酒精性脂肪肝疾病模型组；(3)复方蛋氨酸胆碱治疗组；(4)白藜芦醇治疗组；(5)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物低剂量治疗组；(6)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组；(7)白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组。由图 17可知：(1)酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞PI3K和STAT荧光明显增强，表达明显高于正常对照组；(2)白藜芦醇治疗组没有抑制PI3K和STAT 荧光增强，表达与酒精性脂肪肝疾病模型组没有明显差异；(3)白藜芦醇A 环N(CH₃)₂基衍生物中剂量治疗组、白藜芦醇A环N(CH₃)₂基衍生物高剂量治疗组明显抑制肝细胞PI3K和STAT荧光增强，表达与酒精性脂肪肝疾病模型组有明显差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。