阅读说明：本技术 一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法 (Method for purifying pea albumin PA1a by using negatively charged polysaccharide ) 是由 李兴飞 华欲飞 杨淑暖 陈业明 孔祥珍 张彩猛 于 2020-08-04 设计创作，主要内容包括：一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法,属于蛋白质提取技术领域。本发明使用了天然可食性的负电荷多糖作为回收材料,利用负电荷多糖可以优先结合非目标蛋白沉淀,并与目标蛋白发生相分离的技术原理,实现豌豆清蛋白PA1a的分离纯化,制备单一的PA1a。从资源回收利用的角度来看,本发明可以实现高附加值利用豌豆分离蛋白副产物,并从中制备高纯度的高含硫活性蛋白组分,为后续的研究提供技术支持。本发明可以提高豌豆乳清的综合利用,PA1a蛋白回收率高,纯度高,且本发明对设备要求低,操作简单快速,无环境污染问题。(A method for purifying pea albumin PA1a by using negatively charged polysaccharide belongs to the technical field of protein extraction. The invention uses natural edible negative-charge polysaccharide as a recovery material, and utilizes the technical principle that the negative-charge polysaccharide can be preferentially combined with non-target protein precipitation and is separated from target protein, so as to realize the separation and purification of pea albumin PA1a and prepare single PA1 a. From the perspective of resource recycling, the method can realize the utilization of the pea protein isolate byproduct with high added value, and prepare high-purity high-sulfur active protein components from the pea protein isolate byproduct, thereby providing technical support for subsequent research. The invention can improve the comprehensive utilization of pea whey, has high PA1a protein recovery rate and high purity, and has low requirement on equipment, simple and quick operation and no environmental pollution.)

一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法

技术领域

本发明涉及一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，属于蛋白质提取技术领域。

背景技术

近年来，植物蛋白引起越来越多人的兴趣，人们的饮食结构也逐渐向可持续的植物成分转变。其中，豌豆作为可持续作物，不仅是淀粉产品的良好来源，更是蛋白产品的良好来源。豌豆蛋白作为低致敏性蛋白，没有转基因风险且具有较高的营养价值。在欧美国家，豌豆蛋白乳饮料和发酵乳等备受关注，越来越成为牛乳蛋白饮品的重要替代品。在我国，豌豆蛋白不仅利用率低，且对豌豆蛋白的利用多集中在豌豆分离蛋白，造成占豌豆蛋白含量20%-30%的豌豆乳清蛋白浪费。 豌豆乳清蛋白中硫含量高，硫含量可占总豌豆含硫蛋白的三分之二以上，豌豆乳清蛋白的浪费不仅使得含硫蛋白的大量损失，且大量排放也致使环境问题。

豌豆乳清中富含多种2S和7S乳清蛋白组分，主要包括PA2，PA1和植物凝集素，均具有不同的生理活性。PA1是主要的豌豆2S乳清蛋白之一，其含硫氨基酸约占种子中总含硫量的50%，是由PA1a和PA1b组成，其中 PA1a分子量约6 kDa。PA1已经被证实是对多种昆虫具有毒害作用的昆虫毒素生物活性肽。目前对PA1a的纯化是以John. A. GATEHOUSE提供的方式为主，采用Sephadex G-75和DEAE-纤维素色谱柱洗脱得到。传统的色谱柱分离虽具有较高的选择性，但其昂贵的价格和低的分离速度使得PA1a的分离纯化具有较高的成本。而多糖/蛋白静电作用驱动的复凝聚法制备不仅能快速、高效，而且能以低成本大量得到纯化的PA1a。

发明内容

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，该方法快速高效，成本低廉。

本发明的技术方案，本发明提供的一种利用负电荷多糖纯化豌豆清蛋白PA1a的方法，以豌豆蛋白及粉丝废水加工副产物豌豆乳清为原料，选取一定浓度的不同类型的负电荷多糖溶液作为回收材料，按照一定的物质量比例加入到豌豆乳清中进行选择性复凝聚；利用负电荷多糖优先结合非目标蛋白沉淀，并与目标蛋白发生相分离的原理，通过控制多糖用量和溶液pH，沉淀去除豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素，获得含有PA1a的上清液；通过调节pH，超滤离心除残留多糖及除小分子物质，制备得到单一的PA1a蛋白组分，再经冷冻干燥得到纯度较高的单一豌豆清蛋白PA1a产品。

本发明流程图如图1所示，具体步骤如下：

（1）豌豆乳清液的预处理：用盐酸将豌豆乳清液调节pH至4.0-5.0，在4-10℃下静置24-48h，离心除沉淀，加入碱液调节上清液pH至7.0-8.0，得到预处理的豌豆乳清液，测定蛋白质含量。

（2）负电荷多糖复凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：取固体多糖样品粉末，配制质量浓度为0.1%-0.6%的多糖溶液；按照蛋白质:多糖质量比10-5:1向步骤（1）制备的豌豆乳清液中添加相应体积的多糖溶液，并用盐酸调节pH至3.5-4.6，室温搅拌15-30min，4000-6000 rpm离心10-20 min，去除沉淀，沉淀即为多糖-PA2/植物凝集素的复凝聚沉淀物。收集剩余上清液，即得富集PA1a的粗提纯蛋白液。

（3）纯化PA1a豌豆清蛋白：将步骤（2）得到的富集PA1a的粗提纯蛋白液，调节pH至7.0-8.0，用截留分子量为10-100 kDa的超滤设备进行超滤除去多糖，3500-5000 rpm离心15-30 min，重复超滤1-2次，收集透过液，再用截留分子量为1000-3500 Da的超滤设备进行超滤浓缩，除去小分子物质，收集截留液，即得纯化的PA1a蛋白液。

（4）PA1a蛋白冷冻干燥：将步骤（3）所得PA1a蛋白液，于-30℃冷冻24-48 h，冷冻样品置于-40~-60℃、5~10 Pa下进行真空冷冻干燥48-72 h，即制备得到PA1a豌豆清蛋白。

进一步地，步骤（1）中所述的豌豆乳清液来源于豌豆分离蛋白加工的副产物及豌豆粉丝废水经沉淀豌豆分离蛋白后的上清液，其蛋白质含量为0.1%- 0.6%。

进一步地，步骤（1）中的离心条件为：4000-8000 rpm，15-30min。

进一步地，步骤（2）所述的负电荷多糖为硫酸基团多糖和羧基多糖：硫酸基团多糖：包括但不限于硫酸葡聚糖，卡拉胶（κ-，ι-，λ），硫酸软骨素，岩藻多糖；羧基多糖：包括但不限于羧甲基纤维素，海藻酸钠，黄原胶，果胶；其相对分子量范围大于100 kDa。

进一步地，步骤（2）所述的负电荷多糖的质量浓度与所使用的豌豆乳清液中蛋白质量浓度保持一致；如果多糖质量浓度发生变化，需调整多糖溶液体积，保证最终混合溶液中蛋白质多糖质量比保持不变。

进一步地，步骤（3）所述的用截留分子量为10-100 kDa的超滤设备进行超滤除去多糖，优先选择截留分子量高的超滤膜；用截留分子量为1000-3500 Da的超滤设备进行超滤浓缩，除去小分子物质，优先选择截留分子量低的超滤膜。

进一步地，步骤（4）所述的制备得到的PA1a豌豆清蛋白经过聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE及凝胶过滤-高效液相色谱SEC-HPLC检测样品纯度，经BCA法测定蛋白含量，经过苯酚硫酸法GB/T 15672-2009测定总糖含量，经过干燥法GB/T 5497-1985测定水分，经过灼烧重量法测定灰分。

本发明中，由于豌豆乳清蛋白的等电点集中于pH 4.5-4.8左右，当调节豌豆乳清蛋白与多糖的混合溶液的pH至蛋白质等电点以下后，带负电荷的多糖会与带正电荷的豌豆乳清蛋白通过静电吸引发生相互作用，形成不溶性的复凝聚物，并可以通过离心进行分离。因此，本发明通过控制豌豆乳清蛋白与负电荷多糖的复凝聚条件，将全部的豌豆乳清蛋白PA2和植物凝集素与负电荷多糖形成不溶性复凝聚物，并通过离心沉淀下来，促使上清中仅剩余目标豌豆清蛋白PA1a。

本发明使用了天然可食性的负电荷多糖作为回收纯化蛋白的原料，利用非目标蛋白质（PA2和植物凝集素）与多糖在携带相反电荷条件下产生复凝聚沉淀，目标蛋白PA1a不参与形成复凝聚物的原理，得到单一的纯化的PA1a蛋白，此外，制备的复凝聚物可以作为食品材料直接利用。从资源回收利用的角度来看，本发明不仅可以低损耗、高选择性地制备高纯度豌豆清蛋白组分—PA1a，还可以回收豌豆乳清中其它蛋白组分，为后续的开发研究提供技术支持。

本发明的有益效果：本发明操作流程简单，设备要求低，易于规模化；多糖用量少，且可通过膜分离回收利用；纯化回收的PA1a蛋白纯度超过90%，回收率超过80%，仍然保留其天然活性。

附图说明

图1. PA1a的分离纯化工艺流程图。

图2. PA1a蛋白纯度的SEC-HPLC检测图谱。

图3. PA1a蛋白纯度的SDS-PAGE检测图谱。

附图标记说明：泳道1代表marker；泳道2代表纯化的PA1a；泳道3代表豌豆乳清蛋白组分。

具体实施方式

实施例1

（1）豌豆乳清液的预处理：将用2 mol/L盐酸豌豆乳清液调节pH至4.5，在4℃下静置48h，8000rpm离心20min，除沉淀，加入1 mol/L NaOH溶液调节上清液pH至7.0，得到预处理的豌豆乳清液。

（2）负电荷多糖复凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：称取400 mg的羧甲基纤维素粉末（分子量250 kDa），溶解于100 mL去离子水中，磁力搅拌2 h使其完全溶解。向豌豆乳清液中加入20%（v/v）的羧甲基纤维素溶液，混合均匀，将pH调至4.12，磁力搅拌15min，离心（4000 rpm，20 min），除去复凝聚物沉淀物，收集上清，即得PA1a与羧甲基纤维素的粗蛋白提取液。

（3）纯化PA1a豌豆清蛋白：调节上述溶液pH至7.0，超滤（100 kDa）离心30 min除去多糖，重复超滤1次，合并透过液，用截留分子量为3500 Da的超滤离心30 min除去小分子物质，收集截留液，即得纯化的PA1a蛋白液。

（4）PA1a蛋白冷冻干燥：将以上蛋白纯化液于-30℃冷冻48 h，置于-60℃、5 Pa条件下冷冻干燥48h，即制备得到PA1a豌豆清蛋白。

对制备的PA1a测定蛋白含量，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。

PA1a蛋白纯度的SEC-HPLC检测图谱具体如图2所示，由图可知，PA1a的蛋白纯度为93.82%。

PA1a蛋白纯度的SDS-PAGE检测图谱如图3所示，由图可知，PA1a的蛋白纯度约为97.25%.

经测定，以上实例所得PA1a，蛋白含量约占干基的92.68%，总糖2.3%，灰分4.85%。

实施例2

（1）豌豆乳清液的预处理：将豌豆乳清液调节pH至4.6，在4℃下静置24 h，4000rpm离心30min，除沉淀，加入1 mol/L NaOH溶液调节上清液pH至7.5，得到预处理的豌豆乳清液。

（2）负电荷多糖复凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：称取450 mg的硫酸葡聚糖粉末（分子量500 kDa），溶解于100 mL去离子水中，磁力搅拌1 h使其完全溶解。向豌豆乳清液中加入10%（v/v）的硫酸葡聚糖溶液，混合均匀，将pH调至4.60，磁力搅拌25 min，离心（6000 rpm，15min），除去复凝聚物沉淀物，收集上清，即得PA1a与硫酸葡聚糖的粗蛋白提取液。

（3）纯化PA1a豌豆清蛋白：调节上述溶液pH至7.5，超滤（50 kDa）离心20 min除去多糖，重复超滤2次，合并透过液，用截留分子量为1000 Da的超滤离心25 min除去小分子物质，收集截留液，即得纯化的PA1a蛋白液。

（4）PA1a蛋白冷冻干燥：将以上蛋白纯化液于-30℃冷冻24 h，置于-50℃、10 Pa条件下冷冻干燥48h，即制备得到PA1a豌豆清蛋白。

对制备的PA1a测定蛋白含量，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。

经测定，以上实例所得PA1a，蛋白含量约占干基的90.81%，总糖4.22%，灰分4.57%。

实施例3

（1）豌豆乳清液的预处理：将豌豆乳清液调节pH至4.8，在4℃下静置48 h，6000rpm离心15min，除沉淀，加入1 mol/L NaOH溶液调节上清液pH至7.0，得到预处理的豌豆乳清液。

（2）负电荷多糖复凝聚沉淀豌豆乳清蛋白中PA2和植物凝集素：称取500 mg的海藻酸钠粉末（分子量390 kDa），溶解于100 mL去离子水中，磁力搅拌2 h使其完全溶解。向豌豆乳清液中加入20%（v/v）的海藻酸钠溶液，混合均匀，将pH调至3.9，磁力搅拌30 min，离心（4000 rpm，20min），除去复凝聚物沉淀物，收集上清，即得PA1a与海藻酸钠的粗蛋白提取液。

（3）纯化PA1a豌豆清蛋白：调节上述溶液pH至8.0，超滤（100 kDa）离心25 min除去多糖，重复超滤1次，合并透过液，用截留分子量为3500 Da的超滤离心20 min除去小分子物质，收集截留液，即得纯化的PA1a蛋白液。

（4）PA1a蛋白冷冻干燥：将以上蛋白纯化液于-30℃冷冻36h，置于-60℃、10 Pa条件下冷冻干燥60h，即制备得到PA1a豌豆清蛋白。

对制备的PA1a测定蛋白含量，SEC-HPLC检测蛋白纯度，并做SDS-PAGE电泳分析。

经测定，以上实例所得PA1a，蛋白含量约占干基的91.75%，总糖3.65%，灰分4.32%。

由于实例中所使用的三种负电荷多糖的分子量大小以及均一性都不同，因此造成所得的PA1a中残留的总糖和蛋白质含量存在一定的差异性。