一种利用番茄绿茎紧密连锁标记创制雄性不育系的方法
阅读说明：本技术 一种利用番茄绿茎紧密连锁标记创制雄性不育系的方法 (Method for creating male sterile line by using tomato green stem close linkage marker ) 是由 张从省 王喜萍 公小君 张婷 于 2020-08-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用番茄绿茎紧密连锁标记创制雄性不育系的方法。本发明利用育性基因MS15和绿茎基因F3H这对全新的组合开发了一种番茄雄性不育连锁标记,可用于不育系保持扩繁过程中不育系和保持系的筛选。本发明所使用的育性基因MS15和绿茎基因F3H的遗传距离只有1.35cM,理论上会产生更低的遗传及表型分离率,将大大降低现有番茄可见连锁标记不育系筛选出错率。(The invention discloses a method for creating a male sterile line by utilizing a tomato green stem close linkage marker. The invention develops a tomato male sterility linkage marker by using a brand new combination of a fertility gene MS15 and a green stem gene F3H, and can be used for screening a sterile line and a maintainer line in the sterile line maintaining and expanding propagation process. The genetic distance between the fertility gene MS15 and the green stem gene F3H used in the invention is only 1.35cM, which theoretically can generate lower genetic and phenotypic separation rate, and can greatly reduce the error rate of screening the existing tomato visible linkage marker sterile line.)
技术领域
本发明涉及植物育种领域，具体涉及一种利用番茄绿茎紧密连锁标记创制雄性不育系的方法。
背景技术
番茄是全球消费最多的蔬菜之一，2017年产量1.82亿吨，价值超600亿美元。中国是世界上番茄栽培面积最大、生产总量最多的国家，年产量5000万吨以上。番茄是严格的闭花授粉作物，杂种优势明显，杂种优势是指在植物中两个遗传基础不同的品种间或相近物种间进行杂交，其杂交一代在生长势、生活力、适应性和产量等性状上优于其双亲的现象。杂种优势利用的关键在于发展和利用可以控制的授粉系统，以防止自花授粉导致的自交衰退。为了保证杂交种的纯度，必须使母本丧失雄性功能。目前主要采取的方法有人工或机械去雄、化学杀雄和采用雄性不育系做母本。人工去雄是指在授粉期前人为的去除母本的雄花，需耗费大量人力物力，对于番茄等严格自花授粉的作物，则更加困难。机械去雄和化学去雄对植物的正常生长影响较大。因此创制雄性不育系可以降低成本、提高杂交种纯度，对杂交育种有着重要的意义。
雄性不育包括细胞质不育和核不育，细胞质不育不稳定易受环境影响，因此创制稳定的核不育系是雄性不育系的发展方向。随着分子生物学的发展，越来越多的核育性基因被克隆出来，包括Lat52(Twell et al.,1989)、Ps-2(Gorguet et al.,2009)、Style 2.1(Chen et al.,2007)、Ms10-35(Jeong et al.,2014)、MPK20(Chen et al.,2018)、Ms15(Cao et al.,2019)、PIF3(CN 109456979A)、LAP3(CN 109207505 A)等，这些基因大多数没有被应用的原因包括：1)败育性不彻底，会导致杂交种不纯；2)没有有效的保持系或可区分不育系和保持系的简易方法。
可见标记是指通过肉眼或者简单的处理可以有效的和对照株系进行区分的表型，包括叶片形状、叶片颜色、茎秆颜色、表皮绒毛、种子大小、种子绒毛等性状。连锁可见标记是指该标记与目标基因紧密连锁，后代可以通过可见标记间接的判断目标基因的基因型。
第三代基因编辑(CRISPR/Cas9)是一项旨在对基因组进行定点修饰的新技术，通过人工构建的工程化核酸酶，对基因组目标区间序列特异性的识别与切割，产生双链断裂，并通过细胞内源的同源重组或非同源末端连接DNA损伤修复机制，可以在细胞活体基因组DNA序列中产生碱基缺失、***、替换等修饰的技术(Hsuet et al.,2014)。基因编辑技术理论上可对任意品种的任意基因进行操作，实现对核心亲本目标性状的快速、精准改良而不存在传统回交育种常见的连锁累赘等问题，基因编辑技术还可以实现多基因同时突变，从而大大提高了多性状聚合的效率。
目前已有的番茄可见连锁标记不育系是利用育性基因MS10和绿茎基因F3H/GST(Zhang et al.,2016；CN 105525016 A)，MS10基因和F3H/GST基因遗传距离分别是5.8cM和2.2cM，遗传距离和重组交换值成正相关，MS10基因和F3H/GST基因在减数***期间会发生分离，会造成表型不连锁，绿茎中会有约1％-6％的可育株，这样会给杂交种生产带来操作和纯度的影响。
发明内容
本发明的第一个目的是提供MS15蛋白质和F3H蛋白质的新用途。
本发明提供了MS15蛋白质和F3H蛋白质在如下(1)-(5)中任一种中的应用：
(1)培育番茄雄性不育系；
(2)培育番茄保持系；
(3)扩繁番茄雄性不育系；
(4)区分扩繁番茄雄性不育系过程中的不育系与保持系；
(5)番茄育种；
所述MS15蛋白质是如下A1)或A2)或A3)：
A1)由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2)来源于番茄且与A1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)将SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述F3H蛋白质是如下B1)或B2)或B3)：
B1)由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
B2)来源于番茄且与B1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
B3)将SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
本发明的第二个目的是提供与MS15蛋白质相关的生物材料和与F3H蛋白质相关的生物材料的新用途。
本发明提供了与MS15蛋白质相关的生物材料和与F3H蛋白质相关的生物材料在如下(1)-(5)中任一种中的应用：
(1)培育番茄雄性不育系；
(2)培育番茄保持系；
(3)扩繁番茄雄性不育系；
(4)区分扩繁番茄雄性不育系过程中的不育系与保持系；
(5)番茄育种；
所述与MS15蛋白质相关的生物材料为下述C1)至C8)中的任一种：
C1)编码上述MS15蛋白质的核酸分子；
C2)含有C1)所述核酸分子的表达盒；
C3)含有C1)所述核酸分子的重组载体；
C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；
C5)含有C1)所述核酸分子的重组微生物；
C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；
C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；
C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物。
所述与F3H蛋白质相关的生物材料为下述D1)至D8)中的任一种：
D1)编码上述F3H蛋白质的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体；
D4)含有D2)所述表达盒的重组载体；
D5)含有D1)所述核酸分子的重组微生物；
D6)含有D2)所述表达盒的重组微生物；
D7)含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D8)含有D4)所述重组载体的重组微生物。
所述编码上述MS15蛋白质的核酸分子是如下c1)-c3)任一所述的DNA分子：
c1)SEQ ID No.1所示的DNA分子；
c2)在严格条件下与c1)限定的DNA分子杂交且编码植物育性相关蛋白质的DNA分子；
c3)与c1)或c2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码植物育性相关蛋白质的DNA分子。
所述编码上述F3H蛋白质的核酸分子是如下d1)-d3)任一所述的DNA分子：
d1)SEQ ID No.2所示的DNA分子；
d2)在严格条件下与d1)限定的DNA分子杂交且编码植物花青素合成相关蛋白质的DNA分子；
d3)与d1)或d2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码植物花青素合成相关蛋白质的DNA分子。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
本发明的第三个目的是提供一种培育番茄雄性不育系的方法。
本发明提供的培育番茄雄性不育系的方法为如下X1)或X2)；
X1)使番茄中MS15蛋白质和F3H蛋白质的功能丧失或抑制番茄中MS15蛋白质和F3H蛋白质的活性，得到番茄雄性不育系；
X2)敲除或沉默番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因或抑制番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因的表达，得到番茄雄性不育系。
上述培育番茄雄性不育系的方法中，所述X2)中，所述敲除番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因为使番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因发生突变；所述突变为纯合突变(两条染色体发生的突变一致)。
本发明的第四个目的是提供一种培育番茄保持系的方法。
本发明提供的培育番茄保持系的方法为如下Y1)或Y2)；
Y1)使番茄中MS15蛋白质和F3H蛋白质的功能丧失或抑制番茄中MS15蛋白质和F3H蛋白质的活性，得到番茄保持系；
Y2)敲除或沉默番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因或抑制番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因的表达，得到番茄保持系。
上述培育番茄保持系的方法中，所述Y2)中，所述敲除番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因为使番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因发生突变；所述突变为杂合突变(两条染色体中仅一条染色体发生突变，另一条染色体未发生突变)。
进一步的，所述使番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因发生突变的物质为CRISPR/Cas9系统；所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9核酸酶和sgRNA；所述sgRNA包括靶向编码MS15蛋白质的基因的sgRNA和靶向编码F3H蛋白质的基因的sgRNA。
更进一步的，所述靶向编码MS15蛋白质的基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第432-454位；所述靶向编码F3H蛋白质的基因的sgRNA的靶序列为SEQ ID NO.2自5’端第331-353位。
在本发明的具体实施例中，所述CRISPR/Cas9系统具体为双基因敲除载体YBK-MS15-F3H-Target。所述双基因敲除载体YBK-MS15-F3H-Target包括AtU6启动子驱动的靶向编码MS15蛋白质的基因的sgRNA(靶序列为SEQ ID NO.1自5’端第432-454位)、AtU6启动子驱动的靶向编码F3H蛋白质的基因的sgRNA(靶序列为SEQ ID NO.2自5’端第331-353位)、pYao启动子驱动的Cas9核酸酶编码基因、35S启动子驱动的卡那霉素筛选基因。
上述培育番茄雄性不育系或培育番茄保持系的方法还包括筛选MS15基因和F3H基因发生突变的番茄突变体的步骤。
所述MS15基因和F3H基因均发生纯合突变的番茄突变体植株为番茄雄性不育系；
所述MS15基因和F3H基因均发生杂合突变的番茄突变体植株为番茄保持系(番茄恢复系)。
在本发明的具体实施例中，所述番茄雄性不育系为突变体T1-5。与野生型番茄Ailsa Craig的基因组DNA相比，所述突变体T1-5的差异仅在于在编码MS15蛋白质的基因中，两条染色体均发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.1第444-448位，且在编码F3H蛋白质的基因中，两条染色体均发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.2第341-347位。
所述番茄保持系为突变体T1-1。与野生型番茄Ailsa Craig的基因组DNA相比，所述突变体T1-1的差异仅在于在编码MS15蛋白质的基因中，一条染色体发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.1第444-448位，另一条染色体未发生突变，且在编码F3H蛋白质的基因中，一条染色体发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.2第341-347位，另一条染色体未发生突变。
本发明的第五个目的是提供扩繁番茄雄性不育系的方法。
本发明提供的扩繁番茄雄性不育系的方法包括如下步骤：将按照上述培育番茄雄性不育系的方法培育得到的番茄雄性不育系作为母本，将按照上述培育番茄保持系的方法培育得到的番茄保持系作为父本进行杂交，实现番茄雄性不育系的扩繁。
进一步的，所述扩繁番茄雄性不育系的方法还包括在杂交后代中通过肉眼观察茎秆颜色区分番茄雄性不育系和番茄保持系的步骤。茎秆颜色呈绿色的杂交后代为番茄雄性不育系；茎秆颜色呈紫色的杂交后代为番茄保持系。
本发明的第六个目的是提供如下M1)-M4)中任一种产品：
M1)使番茄中MS15蛋白质和F3H蛋白质的功能丧失或抑制番茄中MS15蛋白质和F3H蛋白质的活性的物质；
M2)敲除或沉默番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因或抑制番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因的表达的物质；
M3)上述CRISPR/Cas9系统；
M4)上述sgRNA。
上述产品中，所述敲除番茄中编码MS15蛋白质的基因和编码F3H蛋白质的基因的物质具体为上述CRISPR/Cas9系统。
上述产品在如下(1)-(5)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)培育番茄雄性不育系；
(2)培育番茄保持系；
(3)扩繁番茄雄性不育系；
(4)区分扩繁番茄雄性不育系过程中的不育系与保持系；
(5)番茄育种。
以上任一所述番茄保持系也可作为番茄恢复系。
以上任一所述番茄具体可为番茄材料Ailsa Craig。
本发明利用育性基因MS15和绿茎基因F3H这对全新的组合开发了一种番茄雄性不育连锁标记，可用于不育系保持扩繁过程中不育系和保持系的筛选。本发明所使用的育性基因MS15和绿茎基因F3H的遗传距离只有1.35cM(如图1所示)，理论上会产生更低的遗传及表型分离率，将大大降低现有番茄可见连锁标记不育系筛选出错率。
附图说明
图1为育性基因与绿茎可见连锁标记基因的遗传距离示意图。
图2为双基因敲除载体示意图。
图3为ms15ms15/f3hf3h突变体基因型鉴定。
图4为ms15ms15/f3hf3h突变体育性表型。
图5为ms15ms15/f3hf3h突变体与MS15ms15/F3Hf3h突变体杂交后代可见表型。
图6为绿茎可见连锁标记不育系扩繁策略。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的CPB载体记载于文献：Zhao et al.(2016).An alternativestrategy for targeted gene replacement in plants using a dual-sgRNA/Cas9design.Scientific reports,6,23890.；公众可以从潍坊兴旺生物种业有限公司获得。
下述实施例中的番茄品种Ailsa Craig购买自中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
实施例1、番茄绿茎可见连锁标记不育系的创制
一、双基因敲除载体的构建
1、靶点序列的选取
番茄MS15基因(Solyc02g084630)是育性基因，其突变体可产生完全败育且柱头外露的表型，可作为不育系用于生产中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；番茄F3H基因(Solyc02g083860)是花青素合成途径重要基因，其突变体可造成幼苗茎秆呈绿色，可作为可见标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据靶位点综合效率及脱靶情况分析，选取SEQ ID NO.1自5’端第432-454位为MS15靶位点(MS15-Target)，选取SEQ ID NO.2自5’端第331-353位为F3H靶位点(F3H-Target)。
2、YBK载体的构建
以CPB载体为基础载体，参照文献“Yan et al.,2015.High-efficiency genomeediting in Arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.Molecularplant,8(12),1820-1823”中的方法将Cas9的启动子pUBI更换成pYao启动子(pYao启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，改造后的载体命名为YBK载体。
3、MS15-Target-U6-sgRNA与F3H-Target-U6-sgRNA的构建
基于YBK载体设计引物如下：
MS15-U6-F：5’-CCTGTCAAACACTGATAGTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCTTG-3’；
MS15-U6-R：5’-AGTGCACTCTGATACTGATCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3’；
MS15-sgRNA-F：5’-ATCAGTATCAGAGTGCACTGTTTCAGAGCTATGCTGGAAA-3’；
MS15-sgRNA-R：5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACAAAAAAGCACCGACTCGGT-3’；
F3H-U6-F：5’-CACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTCATTCGGAGTTTTTGTATCT-3’；
F3H-U6-R：5’-AAGCTTTTCCTCAGGAGGCCAATCACTACTTCGACTCTAGCTG-3’；
F3H-sgRNA-F：5’-GCCTCCTGAGGAAAAGCTTGTTTCAGAGCTATGCTGGAAAC-3’；
F3H-sgRNA-R：5’-TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACAAAAAAGCACCGACTCGGT-3’；
以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为模板，采用MS15-U6-F、MS15-U6-R引物进行PCR扩增，得到片段(命名为：MS15-Target-U6)。以SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为模板，采用F3H-U6-F、F3H-U6-R引物进行PCR扩增，得到片段(命名为：F3H-Target-U6)。
以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为模板，采用MS15-sgRNA-F、MS15-sgRNA-R引物进行PCR扩增，得到片段(命名为：MS15-sgRNA-U6)。以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为模板，采用F3H-sgRNA-F、F3H-sgRNA-R引物进行PCR扩增，得到片段(命名为：F3H-sgRNA-U6)。
以MS15-Target-U6和MS15-Target-sgRNA为模板进行重叠PCR，得到产物(命名为：MS15-Target-U6-sgRNA)。
以F3H-Target-U6和F3H-Target-sgRNA为模板进行重叠PCR，得到产物(命名为：F3H-Target-U6-sgRNA)。
上述重叠PCR扩增的反应体系如表1所示，PCR扩增程序如下：94℃2min；94℃15s，55℃30s，68℃30s，35个循环；68℃10min。
表1中试剂来自KOD Plus，购自东洋纺(上海)生物科技有限公司，货号：KOD-201。
表1
组分
体积(μl)
模板1
5
模板2
5
MgSO<sub>4</sub>
2
10×KOD Plus buffer
5
dNTPs
5
KOD Plus
1
上游引物U6-F
1.5
下游引物sgRNA-R
1.5
H<sub>2</sub>O
24
总计
50
注：上游引物U6-F为MS15-U6-F或F3H-U6-F；下游引物sgRNA-R为MS15-sgRNA-R或F3H-sgRNA-R。
4、双基因敲除载体YBK-MS15-F3H-Target的构建
将YBK载体用限制性内切酶PmeⅠ酶切得到大片段YBK-PmeⅠ(约16876bp)，将重叠PCR产物MS15-Target-U6-sgRNA和酶切大片段YBK-PmeⅠ用重组酶试剂盒(pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit，全式金)进行重组，50℃重组15min，然后转化测序得到敲除载体YBK-MS15-Target。将YBK-MS15-Target载体用限制性内切酶PmeⅠ酶切得到大片段YBK-MS15-Target-PmeⅠ，用上述同样的方法连入F3H-Target-U6-sgRNA，得到双基因敲除载体YBK-MS15-F3H-Target(载体重要元件结构示意图如图2所示)。上述敲除载体包括RNA聚合酶Ⅲ识别的AtU6启动子驱动的靶向编码MS15蛋白质的基因的sgRNA(靶序列为SEQID NO.1自5’端第432-454位)、RNA聚合酶Ⅲ识别的AtU6启动子驱动的靶向编码F3H蛋白质的基因的sgRNA(靶序列为SEQ ID NO.2自5’端第331-353位)、pYao启动子驱动的Cas9核酸酶编码基因、35S启动子驱动的卡那霉素筛选基因。
二、番茄遗传转化
1、无菌外植体获得
番茄受体种子(Ailsa Craig，本发明同样适用于其他材料)于无菌水42℃浸泡2h，75％酒精消毒1min，10％次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗4-5次，接种于MS培养基中，25℃暗培养直至发芽，移至光照下培养1周。用刀切掉子叶远轴端及下胚轴，留下近轴端为外植体。
2、农杆菌侵染
将上述步骤一中构建的YBK-MS15-F3H-Target转化GV3101农杆菌感受态，挑取阳性菌落培养至对数中期，离心，用MS培养基悬浮至0D600nm值为0.2，将外植体浸泡悬浮液5min，25℃暗处理共培养(MS培养基：4.3g/L，蔗糖30g/L，玉米素1mg/L，1x尼许维生素，0.8％琼脂)2天。
3、再生及筛选
将共培养后的外植体移至含15mg/L Hyg的再生培养基(MS培养基4.3g/L，蔗糖30g/L，玉米素2mg/L，100mg/L肌醇，1x尼许维生素，0.8％琼脂)中，每两周继代一次直至长出抗性芽。
4、生根
将抗性芽移至生根培养基(MS培养基4.3g/L，蔗糖30g/L，1x尼许维生素，0.8％琼脂)中，约20天左右，将生根苗移至育苗钵中。
三、突变体分子鉴定
1、番茄阳性株的获得
以上述番茄抗性芽发育成的抗性株的基因组DNA为模板，利用阳性鉴定引物Cas9-F：5’-TTCCAGAATGTCCTCGTTT-3’和Cas9-R：5’-CGGCACAGCATCAAGAA-3’进行PCR鉴定，将有1734bp条带的PCR阳性苗用Bar试纸条进行复筛，获得番茄阳性株。
2、纯合突变体的获得
1)MS15位点的酶切鉴定
以上述番茄阳性株的基因组DNA为模板，利用扩增引物MS15-F：5’-TCCCGATATAGTTTCTCTACTAACCCA-3’、MS15-R：5’-TTAGCCCTACCTCATAAGCATAAAGCA-3’进行PCR扩增，将PCR产物用限制性内切酶ApaLⅠ进行酶切，电泳检测酶切产物。如果是MS15位点未发生编辑的扩增片段被酶切后会被完全切开，得到302bp和407bp的两条带；如果是MS15位点发生纯合突变的扩增片段被酶切后会无法切开，得到709bp的一条带；如果是MS15位点发生杂合突变的扩增片段被酶切后会同时出现野生型和纯合突变体的条带，得到302bp、407bp和709bp的三条带。酶切产物的检测结果如图3A所示。
2)F3H位点的酶切鉴定
以上述番茄阳性株的基因组DNA为模板，分别利用扩增引物F3H-F：5’-GCTTGTGAAGATTGGGGTGTTT-3’、F3H-R：5’-CTCTAGCTCGAATGGGGTATGA-3’进行PCR扩增，将PCR产物用限制性内切酶HindⅢ进行酶切，电泳检测酶切产物。如果是F3H位点未发生编辑的扩增片段被酶切后会被完全切开，得到116bp和740bp的两条带；如果是F3H位点发生纯合突变的扩增片段被酶切后会无法切开，得到856bp的一条带；如果是F3H位点发生杂合突变的扩增片段被酶切后会同时出现野生型和纯合突变体的条带，得到116bp、740bp和856bp的三条带。酶切产物的检测结果如图3A所示。
经过鉴定，最终获得MS15位点和F3H位点均发生纯合突变(两条染色体发生的突变一致)的突变体T1-5株系(基因型为ms15ms15/f3hf3h)及MS15位点和F3H位点均发生杂合突变(两条染色体中仅一条染色体发生突变，另一条染色体未发生突变)的突变体T1-1株系(基因型为MS15ms15/F3Hf3h)。
突变体T1-5株系即为番茄雄性不育系；突变体T1-1株系即为番茄保持系(也可作为番茄恢复系)。
3、突变体的测序
选取突变体T1-5进行测序。测序结果表明：与野生型番茄Ailsa Craig的基因组DNA相比，突变体T1-5的差异仅在于在编码MS15蛋白质的基因中，两条染色体均发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.1第444-448位，且在编码F3H蛋白质的基因中，两条染色体均发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.2第341-347位。具体缺失碱基如图3B所示。
选取突变体T1-1进行测序。测序结果表明：与野生型番茄Ailsa Craig的基因组DNA相比，突变体T1-1的差异仅在于在编码MS15蛋白质的基因中，一条染色体发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.1第444-448位，另一条染色体未发生突变，且在编码F3H蛋白质的基因中，一条染色体发生了片段缺失，该缺失片段位于SEQ ID NO.2第341-347位，另一条染色体未发生突变。
四、育性表型鉴定
对突变体T1-5株系进行育性表型鉴定。同时以野生型番茄Ailsa Craig作为对照。
结果如图4所示，图4A和图4C为野生型番茄Ailsa Craig的花、花粉活性，图4B和图4D为突变体T1-5株系的花、花粉活性。与野生型番茄Ailsa Craig相比，突变体T1-5株系表现为柱头外露且花粉完全无活性。
五、绿茎可见标记表型鉴定
将突变体T1-5株系(基因型为ms15ms15/f3hf3h)和突变体T1-1株系(基因型为MS15ms15/F3Hf3h)进行杂交，所得到的种子在28℃温箱(黑暗条件)进行催芽，2天后移至光照培养室，2天后进行观察。
结果显示：杂交后代出现绿茎番茄(ms15ms15/f3hf3h)和紫茎番茄(MS15ms15/F3Hf3h)，颜色差异明显(如图5所示)。
实施例2、番茄绿茎可见连锁标记不育系扩繁
本发明创制的可见标记不育系解决了实际生产不育系扩繁过程中保持系与不育系的筛选难题。本发明创制的不育系可通过肉眼观察茎秆颜色进行筛选，该方法便捷、准确，无需成本。具体扩繁方法如下：
以番茄雄性不育系作为母本，番茄保持系作为父本进行杂交。其中，番茄雄性不育系为MS15位点和F3H位点均发生纯合突变的基因型为ms15ms15/f3hf3h的番茄突变体(实施例1中获得的突变体T1-5株系)，番茄保持系为MS15位点和F3H位点均发生杂合突变的基因型为MS15ms15/F3Hf3h的番茄突变体(实施例1中获得的突变体T1-1株系)。杂交后代中，50％为番茄雄性不育系(绿茎)，50％为番茄保持系(紫茎)，通过肉眼观察茎秆颜色即可区分不育系与保持系(图6)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>潍坊兴旺生物种业有限公司
<120>一种利用番茄绿茎紧密连锁标记创制雄性不育系的方法
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>3771
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
cttatagtag tgcagttgct acccttcaat ctttcttttc ccgatatagt ttctctacta 60
acccacccca tatctcttca ctttttcctc tctttaactt caacaatgaa catgaccctt 120
gttgattcac ctcaatttct acttcttcaa aaatgggccg tggaaaaatt gagatcaaga 180
agattgaaaa ctcgacaaac aggcaggtca cttactccaa gagaagaaac ggtattttca 240
agaaagctaa agaacttact gttctttgtg acgctaagat ctctctcatc atgctatcaa 300
gcaccaggaa gtatcatgag tacacaagcc caaacactac gtatgttatg ttctcaacac 360
aaaaaaattt actttattga aatcaaaaag aggtttaatt tttttttcct atcaggacaa 420
aaaagatgat tgatcagtat cagagtgcac ttggagttga tatctggagc attcactacg 480
aggtataatt ttagcgttga ttttgtatac tcttacccta gaaattgaaa tcagtttgta 540
cattgaattt atgtgtacag aaaatgcaag aaaacttgaa gagattgaaa gagatcaata 600
acaagctaag aagagagata aggtaattat tttgtatccg ttactgttct gtactactct 660
gcatatcatt catgttactt cacccatatt tttattccct ttttcaaaac tatttgaaaa 720
tgctttatgc ttatgaggta gggctaagat atgtgtgcac tctacccttc ccctaaaccc 780
taaccctact ggtggggtta cattgaatat gttttatatt aataacacag tttttaactt 840
tctaatttga gcaattgaag gatggttaat gagtcatgtg atcagttttt tttggtatgt 900
gtaatcaagc aatgataatg aaatgtctga tgttggtgtc tgttgatagg cagagaacag 960
gggaagacat gagcggacta aatttgcagg aactatgtca cttgcaggag aacatcactg 1020
aatctgttgc tgagattcgt gaacgaaagg ttattgttca taccttactc tttacatttt 1080
ttgggttatg ttagtctaga ataaattgta tccatttctg aagttaaatg gacctaaatt 1140
aacttaagta atcaggatat attcttttat caaaatgtga aatagtgtat gttaaatgtt 1200
aggttaaatt cactttattt tgagtcttga gaacagaaaa gtgttcaaca tttatttgaa 1260
gtataggcaa tgaatctttt cagcttggac caatttaatt taaacattag tgaatacaac 1320
aatagttctt caagctggtc ttgtttctac ttgccaaaaa tgcctataac attttgtgac 1380
aggtgaggat tcaaggttag actcaaggtt atttgtaata cgtttaggtc caacgaagag 1440
tgtctgggtg tctaaatatg aatttataaa agtcatgacc acttctatca caaaaatgat 1500
tatgtttgaa agaattgcta ctgtgactaa ttgataagtc gacttgccta aattaggttt 1560
gtcactctta gaattcattt cagttgacta acctgagcca gtccagtaat ctatgttcat 1620
tttattagtg atagagtgat acgtagacct actagaggca ggtttgtcac tggcaagatt 1680
ttgactggtt gacttcatat cgtgattgga ttggttagat ctgatagagc tatgaacaaa 1740
ggatttgtgc atgctattaa cttgcatttg caattcctaa atatcttcct gaagaaaaaa 1800
gtattttcta ttccacatac ttgcaatctt atttcctact ctttctttcc aagaataagt 1860
gtagagcttt cacatgcagc cgttgagtaa gtcttcatag tcttcaattg gtcttgatta 1920
gcttctagag ttttggaaag aaataggtgc tttgatactt gtttccatag aggccttttg 1980
attactgcct tgagatcttg agctttaata agtgcagaat cttgttattc agttttgctc 2040
tctcgagatg attccttctt taacagatgt tgattgagtt cttcccatac agatatatta 2100
gcatatagct attttactcg acttcccttc atatgcttct atgtgttaag ctgcatgatc 2160
ctgcatacat agaaagcact tatattaaac tcgtcatcat aaaattaatt aaatagaaga 2220
aaccaatgct tcaacccgtt gagcagcagc agcattagtg tccacaacaa ttttcagaac 2280
atctgcttca acccgttgag cagccgcagc attagtgtcc acaacaattt tcagaacctc 2340
tccaacatca taatcacaac acacttcaaa taccttctcc gtaagccatg tagctagttt 2400
gtgccacaca caatgcgtga cacacttgat ctttcaaaca cagccctctg ctcaaccctc 2460
aatctccaca agcccaaatc attgggcttt cacgcaacaa tagcaacttg tacacccaaa 2520
cattcactaa gcttaacaag cctttaaaac agttggcgac actacaacta cgttgaggcc 2580
caattctagt tttgttgaag cagtatttca cattgcatca taagaaagct catttagaac 2640
tgtgtaagtc gggggatgat accattaggg cctgttgaag aggcttagta caatctcaaa 2700
aatggtctct gtctatgtaa gtggtagcta tggagtgagc taatgtgctt tcttctgtac 2760
ctggatggcc ttccattgct ataatttttt gtctcgctac aatattttgc tcccccattt 2820
tgaatcagta cttggtagag aagaccattt aaacgaaaag aatagtacag tagtaatatt 2880
ttggtgactc attcatgtaa ttgatcatat gataggtcaa tcaaacttcg ctttggtgtt 2940
ctttttttgt gttttacatc gtcagcaaat gaaattagaa ttagttttcc acatgtatta 3000
ttgacgtact taactataag agtctctctg atttcctaca gtaccacgtg atcaagaatc 3060
aaacagacac ctgcaagaag aaggtaagtt tttcattgtt aatattttat atgaattcct 3120
ttcttttcat tttgcctggg cattttacaa agtgcaatgg gttcttctat aatgacaaaa 3180
ataggcgagg aacttagaag agcaaaatgg aaaccttgta cttgacttgg taagtatctc 3240
tttataaatt cagttcatat gctgatttat ttgtttttag ttgattaatg ggggttgttt 3300
actaacacaa aaagtaacgt aattgcttca tcaaaggaag caaaatgtga agatccaaag 3360
tatggtgttg tggaaaatga ggggcattac cactctgctg tggcatttgc gaatggagta 3420
cacaatcttt atgcttttcg cctacaacca ttgcacccca atcttcaaaa cgaaggagga 3480
tttggttctc gtgatctacg tctctcctga agatatcagt tcacagtaat ggcgttaaac 3540
attaatgctg agttacttat tcaaatcaac ttcccgaatt atatcttatt cctaaaaaaa 3600
attaaatatt gcaagctgca aacactactt tatctaacta atttgctccg agtctggatt 3660
tggttctgtg ttaagcactc tattattcta ggtgtttcaa ctcctttcta tatatgaatt 3720
atgatgcctt gaacgcatgt tcaattaatc aattttcctt ttcgacttga t 3771
<210>2
<211>2064
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
caacatttaa aaagggcacc tcataactct tttgaacaaa acaaaaaatg gcaccttcaa 60
cactaacagc tttagctaat gaaaagaccc ttgaaacaag ttttattagg gatgaagaag 120
aacgtccaaa agttgcttac aataaattta gtgacgaaat tccagtaata tcgttgcaag 180
gtattgatga tgttaatgga agaagaagtg aaatatgtga gagaatcgta aatgcttgtg 240
aagattgggg tgtttttcag gtaattgatc atggggttga tgctcaatta atatcacaaa 300
tgacaaaatt agcgaaggaa tttttcgaat tgcctcctga ggaaaagctt cggtttgaca 360
tgtctggtgg caagaaaggt ggcttcattg tctcaagcca cttacaggta acaattattt 420
caccgcaact tattttttat tttgatttat aggaataaat agaaaaaaag ttagtgataa 480
atttctaaat acagaaaaga tatacctacg gatgaaaaag tgtttgtaac agatcccctt 540
tttttccgag gtagccgttg tatcgatagt ttgaaaaata taaagtttgt tttaattgtt 600
atttaaattc tatgatattg tatatgtaga tgaaaaaaaa atattttttt aacgacaatt 660
tgataggatc atgttattat tttagtattt tcagttaatt ttgtctttat ttattattga 720
gttattttat tttatctatt tacaccattt ttattagtag ctcatcatag cagtggcgga 780
ttaccggggt caacctgacc tccaggcggg aaattatagg gttgaaatta ttttttaggt 840
agatgtatat agttaatgtc aaatttcttc agctacttcg tgtatctatt gaacctctta 900
tttaaaattg gctccaccat tatttcgtac tttacttttt cttgtagatt cattattcaa 960
aatatgggtg tataacgata taatataatt tatcaattta ctataacact acaattgttt 1020
tgtagggtga agtggttcaa gactggcgtg aaatagtgac ttacttttca taccccattc 1080
gagctagaga ctattctaga tggccagaca aaccacaagg ctggataggt gtaactgagc 1140
aatacagtga aaagttgatg gatttggctt gcaaattatt agaagtacta tcagaggcaa 1200
tgggcttaga gaaagaggct ttaaccaagg catgtgtcga tatggaccaa aaagtagttg 1260
tgaattttta cccaaagtgt ccagagcctg accttactct tgggctcaaa cgacacaccg 1320
atccaggaac cattacctta ttgttacaag accaagttgg tgggcttcaa gccactaaag 1380
ataatggcaa aacatggatc actgttcagc ccgttgaagg tgcttttgtg gttaatcttg 1440
gcgatcacgg tcatgtaagt tggtactaca tattccgata aaattaaaat tatgtgaatt 1500
taattatgtg aattttggac agtatttgag caatggaagg ttcaagaatg ctgatcatca 1560
agcagtggtg aattcgaata gcagtagatt atcgatagcc acattccaga atccagcacc 1620
agatgcaaaa gtgtatccgt taaaaattag agaaggagag aagtcaataa tggatgagcc 1680
gattacattt gcagaaatgt acaggaggaa aatgagtaag gatcttgagc tagctaggct 1740
gaagaaactg gccaaggaag agaagataca aactgaagag gccaagttgg agtccaagcc 1800
cattgaggaa attcttgctt aagtgtttta acacttgaaa caacaagcta tgcgcgtaat 1860
ttcttttatc agtattgtct tgaataacaa tcaatcatgt tcttgtgaat tggtgatgtt 1920
tttaatctta ttacaaaaca aacttagtgt tcctttattc aaattaaagt cttttagatg 1980
atgcataacg ccatttccta cggaggaagg taaaattata aaattggata tacataaaac 2040
tatactcgta gatccataag actt 2064
<210>3
<211>293
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>3
cattcggagt ttttgtatct tgtttcatag tttgtcccag gattagaatg attaggcatc 60
gaaccttcaa gaatttgatt gaataaaaca tcttcattct taagatatga agataatctt 120
caaaaggccc ctgggaatct gaaagaagag aagcaggccc atttatatgg gaaagaacaa 180
tagtatttct tatataggcc catttaagtt gaaaacaatc ttcaaaagtc ccacatcgct 240
tagataagaa aacgaagctg agtttatata cagctagagt cgaagtagtg att 293
<210>4
<211>92
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>4
gtttcagagc tatgctggaa acagcatagc aagttgaaat aaggctagtc cgttatcaac 60
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 92
<210>5
<211>982
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>5
gatgggaaat tcattgaaaa ccctaaaccc aaatcaacag ctgcaattca aaaggggact 60
aattgacaaa caaaaattga taacaaatag aggtaggggg agagtttcgt acgcgacaat 120
gagattgagc tcttgaggac ttgtgaagtt gccaacgcac gagtgagtga cactggtcgg 180
tttgtgagcc gtaacaacgt agttccatga gctcatcttc ctcttctttg tctccaggga 240
atttgagttc gactttctac gcgagggccc tcgaggaagc ttctagattt ctgaatcgag 300
ctttcggaat tttaacatag agaagttaga gagagaatga aaagccaaag gaggcgaaaa 360
tcgaacaagg aagaagaaag acaactttcg acaaagactg gtcggtcggt tttggtagac 420
aattgaaatt agatggatgg tccggttcgg tatactataa gattaaaaac agttttaaat 480
tcagctaaac cgaactcatt tgattttatt aaaccggaat catccgattc gagtttgtaa 540
aaaataccga aattgaaaac actaaacaaa aactgtatta aactgttact gaaataagag 600
aatctcccaa ttcggtttac gtactactct tcagaaatca gaaccaaaaa ttcagaaatc 660
ggattgaacc aaacttaaat tgacggtccg gttagtcttc ggctctacaa attaaaggcc 720
caagtttctg ctttaaaaga acgaaatagt taatgggctc aaaccataga ccaggtaagt 780
catgggcttg gttagtccgg gtcaacccgg tagacccgat tcctgaagaa aacctagtgg 840
aaggtttaaa gttgtaaact ttccgaccaa ataaacaaaa tcgttttcca gcttcttccg 900
tcgccactaa accctgaggc taaacctaga cgagtcaaag tgtaaaatcg ttaaacccta 960
agagggagtg agagagagaa ga 982
<210>6
<211>225
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<400>6
Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Lys Ile Glu Asn Ser Thr Asn
1 5 10 15
Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Ile Phe Lys Lys Ala
20 25 30
Lys Glu Leu Thr Val Leu Cys Asp Ala Lys Ile Ser Leu Ile Met Leu
35 40 45
Ser Ser Thr Arg Lys Tyr His Glu Tyr Thr Ser Pro Asn Thr Thr Thr
50 55 60
Lys Lys Met Ile Asp Gln Tyr Gln Ser Ala Leu Gly Val Asp Ile Trp
65 70 75 80
Ser Ile His Tyr Glu Lys Met Gln Glu Asn Leu Lys Arg Leu Lys Glu
85 90 95
Ile Asn Asn Lys Leu Arg Arg Glu Ile Arg Gln Arg Thr Gly Glu Asp
100 105 110
Met Ser Gly Leu Asn Leu Gln Glu Leu Cys His Leu Gln Glu Asn Ile
115 120 125
Thr Glu Ser Val Ala Glu Ile Arg Glu Arg Lys Tyr His Val Ile Lys
130 135 140
Asn Gln Thr Asp Thr Cys Lys Lys Lys Ala Arg Asn Leu Glu Glu Gln
145 150 155 160
Asn Gly Asn Leu Val Leu Asp Leu Glu Ala Lys Cys Glu Asp Pro Lys
165 170 175
Tyr Gly Val Val Glu Asn Glu Gly His Tyr His Ser Ala Val Ala Phe
180 185 190
Ala Asn Gly Val His Asn Leu Tyr Ala Phe Arg Leu Gln Pro Leu His
195 200 205
Pro Asn Leu Gln Asn Glu Gly Gly Phe Gly Ser Arg Asp Leu Arg Leu
210 215 220
Ser
225
<210>7
<211>362
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<400>7
Met Ala Pro Ser Thr Leu Thr Ala Leu Ala Asn Glu Lys Thr Leu Glu
1 5 10 15
Thr Ser Phe Ile Arg Asp Glu Glu Glu Arg Pro Lys Val Ala Tyr Asn
20 25 30
Lys Phe Ser Asp Glu Ile Pro Val Ile Ser Leu Gln Gly Ile Asp Asp
35 40 45
Val Asn Gly Arg Arg Ser Glu Ile Cys Glu Arg Ile Val Asn Ala Cys
50 55 60
Glu Asp Trp Gly Val Phe Gln Val Ile Asp His Gly Val Asp Ala Gln
65 70 75 80
Leu Ile Ser Gln Met Thr Lys Leu Ala Lys Glu Phe Phe Glu Leu Pro
85 90 95
Pro Glu Glu Lys Leu Arg Phe Asp Met Ser Gly Gly Lys Lys Gly Gly
100 105 110
Phe Ile Val Ser Ser His Leu Gln Gly Glu Val Val Gln Asp Trp Arg
115 120 125
Glu Ile Val Thr Tyr Phe Ser Tyr Pro Ile Arg Ala Arg Asp Tyr Ser
130 135 140
Arg Trp Pro Asp Lys Pro Gln Gly Trp Ile Gly Val Thr Glu Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Glu Lys Leu Met Asp Leu Ala Cys Lys Leu Leu Glu Val Leu Ser
165 170 175
Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ala Leu Thr Lys Ala Cys Val Asp
180 185 190
Met Asp Gln Lys Val Val Val Asn Phe Tyr Pro Lys Cys Pro Glu Pro
195 200 205
Asp Leu Thr Leu Gly Leu Lys Arg His Thr Asp Pro Gly Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Leu Gln Asp Gln Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Lys Asp Asn
225 230 235 240
Gly Lys Thr Trp Ile Thr Val Gln Pro Val Glu Gly Ala Phe Val Val
245 250 255
Asn Leu Gly Asp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe Lys Asn
260 265 270
Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Asn Ser Ser Arg Leu Ser Ile
275 280 285
Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Pro Asp Ala Lys Val Tyr Pro Leu Lys
290 295 300
Ile Arg Glu Gly Glu Lys Ser Ile Met Asp Glu Pro Ile Thr Phe Ala
305 310 315 320
Glu Met Tyr Arg Arg Lys Met Ser Lys Asp Leu Glu Leu Ala Arg Leu
325 330 335
Lys Lys Leu Ala Lys Glu Glu Lys Ile Gln Thr Glu Glu Ala Lys Leu
340 345 350
Glu Ser Lys Pro Ile Glu Glu Ile Leu Ala
355 360