阅读说明：本技术 一种检测硝基呋喃的免疫胶体检测卡的制备 (Preparation of immune colloidal detection card for detecting nitrofuran ) 是由 杜霞 张淑雅 袁超 于 2019-05-01 设计创作，主要内容包括：本发明硝基呋喃的免疫胶体金检测卡及其制备方法,涉及动物源食品兽药残留检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条,由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫组成；胶体金膜为含硝基呋喃单克隆抗体的玻璃纤维素膜,包被膜是硝酸纤维素膜,其上设有T线和C线,T线包被有硝基呋喃蛋白质偶联物,C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测硝基呋喃,方便、快捷、结果准确。(The invention discloses an immune colloidal gold detection card for nitrofuran and a preparation method thereof, and relates to the technical field of animal-derived food and veterinary drug residue detection. The test strip in the shell of the detection card consists of a PVC rubber plate, a sample pad, a colloidal gold combination pad, a coating film and a water absorption pad; the colloidal gold membrane is a glass cellulose membrane containing a nitrofuran monoclonal antibody, the coating membrane is a nitrocellulose membrane, a T line and a C line are arranged on the nitrocellulose membrane, the nitrofuran protein conjugate is coated on the T line, and the goat anti-mouse IgG antibody is coated on the C line. The method is effectively used for quickly detecting the nitrofuran, and is convenient, quick and accurate in result.)

一种检测硝基呋喃的免疫胶体检测卡的制备

技术领域

本发明涉及畜禽、水产中兽药残留检测技术领域，特别是涉及硝基呋喃的免疫胶体金检测卡及其制备方法。

背景技术

硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用，曾经被广泛应用为禽类、水产等的促生长添加剂。但因此药物可以使实验动物发生癌变和基因突变，导致此药物禁止在治疗和饲料中使用。

目前有关动物源性食品中硝基呋喃及其代谢物的测定方法主要为理化检测法，如用化学分析法测定虾肉中 的硝基呋喃残留量，检出限为0.0125ug/kg，用高效液相色谱法测定鱼肉中的硝基呋喃残留量，检出限为0.0125ug/kg。但这些方法仪器设备昂贵，操作复杂，灵敏度低，且不适 用于大批量样品的检测，无法满足国内食品安全检测市场的迫切需要。

免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性，以及测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。虽然农兽药残留分析的方法虽然有很多，但是利用免疫学技术进行分析是特异性最好、检测时间最短的方法。

现有技术对于硝基呋喃的检测主要是气相色谱-质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种硝基呋喃的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出硝基呋喃的问题。

本发明的硝基呋喃胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了硝基呋喃-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。

本发明的硝基呋喃胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现：

(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的***时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的硝基呋喃抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml，过0.22µm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成硝基呋喃单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)硝基呋喃蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含硝基呋喃蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、硝基呋喃蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；

所述步骤(6)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化钠(NaCl)，用含有0.5%TRITON-100的0.01 mol/L PBS定容至100 mL；

本发明可有效用于测定硝基呋喃，方法简单，方便、快捷，结果准确。

附图说明

图1为本发明硝基呋喃的免疫胶体金检测卡的结构图：图中1.加样孔 2.检测线3.质控线 4.检测孔 5.试纸条 6.检测卡外壳。

图2为本发明硝基呋喃的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图，图中7.样品垫 8.胶体金结合垫 9.PVC胶板 10.硝酸纤维素膜 11.吸水垫 。

具体实施方式

实施例1

图1、图2所示的实施例：图中9为PVC胶板；7为样品垫；8为胶体金结合垫，该胶体金结合垫上包被了单克隆抗体胶体金标记物；10为包被膜，即硝酸纤维素膜，该硝酸纤维素膜上包被了硝基呋喃-BSA和羊抗鼠IgG；11为吸水垫，由吸水材料如滤纸制成。

在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、结合垫8，样品垫7和结合垫8为并排结构。

在PVC胶板9的中间粘附硝酸纤维素膜10。在硝酸纤维素膜10上设置有羊抗鼠IgG质控线3和硝基呋喃-BSA检测线2。

在PVC胶板9的另一端粘附吸水垫11。硝酸纤维素膜10的一端与结合垫8略交叉，另一端与吸水垫11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中，制成检测卡，在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4，样品垫7正对加样孔1，硝酸纤维素膜10正对检测孔4。

实施例2

硝基呋喃胶体金检测卡制备，是由以下步骤具体实现：

胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的***时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

抗体的预处理：将要标记的硝基呋喃抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/ml，过0.22 µm滤膜；

胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成硝基呋喃单克隆抗体胶体金标记物；

胶体金膜的制备：将步骤(3)硝基呋喃蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含硝基呋喃蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、硝基呋喃蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉，组装成试纸条，切割成一定宽度长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。