I.

技术领域

本公开总体上涉及用于测量人类生物材料样品中、且尤其是流体样品中的帽柱木碱浓度的组合物、试剂盒和方法，所述流体样品包括口腔液、尿液、血清、血浆或全血。具体地，本公开涉及衍生自帽柱木碱并且可用于生产对帽柱木碱和/或帽柱木碱的代谢物特异的抗体的半抗原(hapten)(免疫原前体)和免疫原(immunogen)的制备和用途，以及用于测量帽柱木碱或帽柱木碱的代谢物的浓度的标记缀合物和免疫测定(immunoassay)，以及制造和使用它们的方法。

II.相关技术

帽柱木碱(mitragynine)(IUPAC名称：(E)-2-[(2S,3S,12bS)-3-乙基-8-甲氧基-1,2,3,4,6,7,12,12b-八氢吲哚并[2,3-a]喹嗪-2-基]-3-甲氧基丙-2-烯酸甲酯)是植物物种美丽帽柱木(Mitragyna speciosa，通常被称为“卡痛(kratom)”或“biak-biak”)的主要柯楠(corynanthe)型吲哚生物碱组分。尽管卡痛叶在一些国家有药用传统，但卡痛的娱乐用途和滥用导致了帽柱木碱成瘾和死亡的增加。近期娱乐性药物引起的精神刺激的增加，以及伴随而来的为达到这种效果而摄入的物质的种类和数量的增加，包括卡痛的使用。卡痛据称具有药用性质，并且尽管在某些国家是非法的，但它在英国以及欧洲和美国的大部分地区仍然是合法的，尽管它被美国缉毒局(U.S.Drug Enforcement Agency)列为关注物质并在某些州被禁止。

近期已有许多与其摄入相关的死亡报告，并且人们对于借助于帽柱木碱和卡痛的其他生物碱来检测卡痛以用于毒理学和研究目的的兴趣日益增加，所述卡痛的其他生物碱包括但不限于佩楠台因(paynantheine)、美艳帽柱木碱(speciogynine)、斯佩西亭(speciociliatine)、7-羟基-帽柱木碱(7-hydroxy-mitragine)。已描述的用于检测和定量帽柱木碱和其他卡痛生物碱的分析方法使用相对昂贵、依赖于专业操作员的高效液相色谱(HPLC)技术或与气相色谱(GC-MS)或液相色谱(LC-MS)联用的质谱技术(例如，Kaewklum,2005；Janchawee,2007；Le,2012)。由于在分析之前需要对样品进行预处理，这些技术可能是更复杂的。因此，在临床和司法鉴定上需要快速且经济地检测和定量患者样品和怀疑掺入卡痛的物质中的帽柱木碱及其代谢物。

用于检测和定量帽柱木碱的早期方法包括高效液相色谱(HPLC)，以及通过气相色谱(GC-MS)或液相色谱(LC-MS)进行分离后的质谱。

WO 2013/147586(Tan et al.)和US 9,952,206(Benchikh et al.)描述了用于检测和测量帽柱木碱和其他相关生物碱的免疫测定方法。具体地，Tan等人描述了合成帽柱木碱-对氨基苯甲酸(PABA-帽柱木碱)以生产用于产生抗体的免疫原的方法。Benchikh等人教导了8-去甲基帽柱木碱(8-desmethylmitragynine，也称为9-羟基柯楠碱(9-hydroxycorynantheidine))的衍生物用于生产与帽柱木碱、8-去甲基帽柱木碱、8-磺酰基帽柱木碱(8-sulphonylmitragynine)和/或8-葡萄糖醛酸苷基帽柱木碱(8-glucuronidylmitragynine)特异性结合的多克隆抗体。

Limsuwanchote等人(Forensic Science International,244:70–77；2014)教导了由帽柱木碱酸(16-羧基帽柱木碱)和牛血清白蛋白的免疫原性缀合物产生的单克隆抗体(1A6)。根据Limsuwanchote等人，将羧基添加到帽柱木碱以允许与抗原蛋白缀合(以生产免疫原)。所得单克隆抗体用于测量与包被抗原(帽柱木碱-戊二醛-卵白蛋白(mitragynine-glutaraldehyde-ovalbumin))的结合的间接ELISA测定，并显示出对包被的抗原-卵白蛋白复合物比对游离帽柱木碱更高的亲和力。因为ELISA免疫测定被开发用于对从卡痛叶提取的样品中的帽柱木碱进行定量的目的，没有检测人类样品。Limsuwanchote等人开发的测定法的测量范围是32.92–250μg/ml，这对于检测人类样品中是否存在帽柱木碱是不够灵敏的。

Randox Laboratories Limited已将ELISA免疫测定商业化，所述ELISA免疫测定从尿液和全血定量测量帽柱木碱和9-O-去甲基帽柱木碱，其对7-α-羟基帽柱木碱具有低水平的交叉反应性，检测限为约0.54ng/ml(全血中)。

Philipp等人(Anal Bioanal Chem,400:127-135,2011)使用GC-MS程序筛选尿液中的帽柱木碱，尿液是筛选药物滥用的常见样品。由于卡痛生物碱的强代谢，Philipp等人强调了在筛选卡痛使用时需要包括代谢物，并确定了除帽柱木碱之外，代谢物16-羧基帽柱木碱(帽柱木碱酸)、9-O-去甲基帽柱木碱和/或9-O-去甲基-16-羧基帽柱木碱也适用于包括在监测卡痛使用的测定中。

III.本领域中的问题

至少一种对靶抗原具有特异性的抗体通常构成可用的免疫测定的基础，但小分子例如药物通常不具有免疫原性，并且因此在注射到动物中时不引发免疫应答，所述动物包括那些常用于商业抗体生产的动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、马以及本领域已知的其他哺乳动物。此外，靶标药物的一些活性形式可能对动物接受者有毒，即使是小剂量。因此，可能需要制备靶标药物的衍生物作为用于抗体产生的免疫原。然而，针对衍生的靶标产生的抗体必须仍然能够与预期存在于患者样品中的药物交叉反应。

因此，在小分子的免疫测定产生领域(包括用于帽柱木碱检测的免疫测定)中存在许多问题可以解决，尤其是当开发抗体和其他试剂时。