阅读说明：本技术 痰热清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用 (Application of phlegm-heat clearing medicine in preparation of medicine for treating novel coronavirus pneumonia ) 是由 张小利 穆竟伟 刘绍勇 杜学航 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及痰热清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用。本发明的痰热清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用可以缩短新型冠状病毒肺炎肺炎患者病毒核酸转阴时间；可以缩短新型冠状病毒肺炎肺炎患者退热时间；可以缩短新型冠状病毒肺炎肺炎患者咳嗽时间；可以改善新型冠状病毒肺炎肺炎患者咳嗽症状；可以提高新型冠状病毒肺炎肺炎患者指氧饱和度。(The invention relates to application of phlegm-heat clearing in preparation of a novel medicine for treating coronavirus pneumonia. The application of the phlegm-heat clearing medicine in preparing the medicine for treating the novel coronavirus pneumonia can shorten the time for turning the virus nucleic acid of a patient with the novel coronavirus pneumonia to negative; can shorten the time of defervescence of the patients with the novel coronavirus pneumonia; the cough time of a patient with the novel coronavirus pneumonia can be shortened; can improve cough symptom of patients with novel coronavirus pneumonia; can improve the finger oxygen saturation of patients with the novel coronavirus pneumonia.)

痰热清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及，尤其涉及痰热清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎感染肺炎作为一种新出现疾病，尚未有针对性疫苗及特效 药，因此我们开展由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘五味药材组成的痰热 清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供痰热清在制备治疗新型冠状病 毒肺炎药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明提供痰热清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用。

优选地，所述药物的剂型为胶囊或注射液。

优选地，痰热清缩短新型冠状病毒肺炎肺炎患者病毒核酸转阴时间、退热时 间、咳嗽时间。

优选地，痰热清改善新型冠状病毒肺炎肺炎患者咳嗽症状、提高新型冠状病 毒肺炎肺炎患者指氧饱和度。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明的痰热清在制备治疗新型冠状病毒肺炎药物中的应用可以缩短新型 冠状病毒肺炎肺炎患者病毒核酸转阴时间；可以缩短新型冠状病毒肺炎肺炎患者 退热时间；可以缩短新型冠状病毒肺炎肺炎患者咳嗽时间；可以改善新型冠状病 毒肺炎肺炎患者咳嗽症状；可以提高新型冠状病毒肺炎肺炎患者指氧饱和度。

附图说明

图1为病毒核酸转阴时间曲线；

图2为退热时间曲线；

图3为咳嗽症状消失时间曲线；

图4为痰热清胶囊相关蛋白靶点的PPI网络；

图5为痰热清胶囊相关蛋白靶点的Cluster模块的PPI网络图；

图6为痰热清胶囊相关蛋白靶点的GO富集分析；

图7为痰热清胶囊相关蛋白靶点KEGG通路富集分析的前20条通路；

图8为痰热清胶囊“化合物-靶点-通路-药理作用-功效”网络图；

图9为痰热清注射液成分-靶点网络图；

图10为痰热清注射液相关靶点的PPI网络图；

图11为痰热清注射液核心靶点；

图12为GO生物过程分析；

图13为KEGG信号通路富集分析。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全 部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳 动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可 以相互组合。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限 定。

实施例1：痰热清胶囊治疗新型冠状病毒肺炎临床研究结果

以常规治疗为对照，采用平行随机、开放、单中心临床试验设计：

①采用区组随机化方法。运用专业统计软件分别产生2组共72例受试者所 接受处理(试验组和对照组)的随机表，即流水号为001～072所对应的治疗分配 表。并按照随机表内容产生72个随机分配信件，每个信件内容为每个随机号对 应的组别和治疗方案。受试者入组后按照按由小到大的顺序依次拆开对应的分配 信件，并采取信件内显示的治疗方案。

②本试验为初步评价痰热清胶囊用于治疗新型冠状病毒肺炎肺炎患者的临 床有效性及安全性的探索性试验，设1个试验组和1个对照组，两组的例数按1∶1 的比例安排，每组30例，同时按20％的预脱落率增设，故每组为36例，本试验 拟定总例数为72例。

③试验组治疗使用常规治疗+痰热清胶囊，对照组治疗使用常规治疗。

新型冠状病毒肺炎肺炎诊断参照《新型冠状病毒肺炎感染的肺炎诊疗方案 (试行第五版)》制定，疗效分析如下：

1.病毒核酸转阴时间

FAS结果：试验组36例受试者中，共有34例(94.4％)病毒核酸转阴，其 中2例删失(5.6％)，病毒核酸转阴时间的中位数为8.5天；对照组36例受试者 中，共有33例(91.7％)病毒核酸转阴，其中3例删失(8.3％)，病毒核酸转阴 时间的中位数为9.0天。见表1、图1。

PPS结果：与FAS结果相似。

表1 两组病毒核酸转阴时间比较分析(FAS)

两组病毒核酸转阴时间风险比及病毒核酸转阴时间曲线图的结果可见，试验 组在病毒核酸转阴时间上具有一定的优势。

2.退热时间

FAS结果：试验组36例受试者中，共有18例出现发热症状，其中有16例 (88.9％)退热，退热时间的中位数为2天；对照组36例受试者中，有12例出 现发热症状，其中10例(83.3％)退热，退热时间的中位数为3天。

在入组时或入组前开始发热的人群中，试验组中共有7例受试者出现发热症 状，其中的6例(85.7％)退热，退热时间中位数为2天；对照组中6例出现发 热症状的受试者全部退热，退热时间中位数为3.5天。

对于入组后开始发热的人群，试验组中共有11例受试者出现发热症状，其 中有10例(90.9％)退热，退热间中位数为2天；对照组中共有6例出现发热症 状，其中4例(66.7％)退热，退热时间中位数为2.5天。见表2、图2。

PPS结果：与FAS结果相似。

表2 两组退热情况比较分析(FAS)

从两组退热时间风险比及退热曲线的结果可见，试验组在退热趋势上具有一 定的优势。

3.指氧饱和度

FAS结果：两组治疗后所有时点的测量值均未表现出比基线检测值具有统计 学意义的改善的差别(P>0.05)。整体来看，试验组指氧饱和度在治疗后各个时 点较基线变化值都优于对照组，且于治疗后的第7天和第11天两组间指氧饱和 度的较基线变化值具有统计学意义的差别(P<0.05)，试验组优于对照组，见表 3。

表3 指氧饱和度变化分析(FAS)

注：组内前后比较采用配对t检验；治疗前后差值的组件比较采用t检验。

两组于治疗后较治疗前未见有统计学意义的改善(P>0.05)。但整体上试验 组治疗后各个时点较基线变化值都优于对照组，且于治疗后的第7天和第11天 两组间指氧饱和度的较基线变化值具有统计学意义的差别(P<0.05)，试验组优 于对照组。

4.咳嗽症状

FAS结果：试验组36例受试者中，24例(66.7％)未出现咳嗽症状；在12 例(33.3％)出现咳嗽症状的受试者中9例(75％)咳嗽消失，3例(25％)好转， 咳嗽消失时间的中位数为7天；对照组36例受试者中，29例(80.6％)未出现 咳嗽症状；在7例(19.4％)出现咳嗽症状的受试者中5例(71.4％)咳嗽消失， 2例(28.6％)好转，咳嗽消失时间的中位数为12天。见表4、图3。

表4 两组咳嗽症状变化比较分析(FAS)

咳嗽消失时间中位数试验组(7天)明显短于对照组(14天)；且从两组咳 嗽消失时间风险比及曲线的结果可见，试验组在咳嗽消失时间的趋势上具有一定 的优势。

综上所述，痰热清胶囊对新型冠状病毒肺炎肺炎患者缩短病毒核酸转阴时 间、退热时间，改善咳嗽症状及缩短咳嗽时间，提高指氧饱和度等方面具有一定 的可预见的优势；试验期间未见有与痰热清胶囊相关的不良反应及实验室指标等 的异常改变。

实施例2：痰热清注射液治疗新型冠状病毒肺炎临床研究结果

1.体温复常时间

对比对照组与治疗组体温复常时间，对照组基线水平时3人未发热，治疗组 基线水平时4人未发热。对照组为平均退热2.76天，中位数为2(1，2)天，试 验组平均退热1.68天，中位数为3(2，4)天，差异有统计学意义(P<0.01)， 提示使用痰热清注射液治疗新冠肺炎患者能够缩短体温复常时间1.08天。见表5。

表5 两组患者体温复常平均使用时间

2两组患者住院天数比较

通过分析两组患者的住院天数，试验组的平均住院天数明显少于对照组，差 异有统计学意义(P<0.01)。见表6。

表6 两组患者平均住院天数比较

综上所述，本研究提示痰热清注射液治疗新型冠状病毒肺炎感染肺炎临床疗 效主要表现为缩短体温复常时间和减少住院时间；研究中未发现与痰热清注射液 相关的不良反应。

实施例3：基于网络药理学的痰热清胶囊治疗新型冠状病毒肺炎机制研究结 果

痰热清胶囊由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘5味药材提取制成，根 据前期化学物质组研究结果，结合该方的功能主治、药味作用特点以及制备工艺、 成分含量等方面，选取了来源于5味药材中的黄酮类、木脂素类、苯乙醇苷类、 有机酸类、氨基酸类、胆汁酸类19个化合物为研究对象，应用ChemBio Office 2010件绘制19个化合物的结构，包括：野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O-葡 萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、连翘苷、连翘酯苷E、连翘酯苷D、绿 原酸、咖啡酸、异绿原酸A、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、酪氨 酸、亮氨酸、熊去氧胆酸和鹅去氧胆酸。

通过Swiss Target Prediction服务器反向对接实验和TCMSP数据库检索，得 到19个化合物共163个相关靶点(靶点具体信息见表7)。从STRING 10数据库 中获得蛋白间相互作用关系(PPI)，然后利用Cytoscape软件构建PPI网络图(见 图4)并对网络进行分析，结果显示，处于痰热清PPI网络中心的蛋白TNF6(度 值＝50)、EGFR(度值＝46)、NOS3(度值＝41)、PTGS2(度值＝41)、APP(度值 ＝39)、JUN(度值＝38)、HRAS(度值＝30)、REN(度值＝29)、MMP2(度值＝28)、 MAPK14(度值＝25)、VCAM1(度值＝24)等拥有较多相互作用关系，这些蛋白 涉及炎症反应、免疫调节、抗菌抗病毒、解热、止痛、镇静、化痰、镇咳等方面， 提示痰热清胶囊清热、化痰、解毒功效机制可能与这些蛋白有关。

表7 核心蛋白靶点信息

为了进一步了解PPI网络的生物作用，使用Cytoscape的MCODE插件对网 络进行Cluster模块分析，共获得8个Cluster模块(见图5，具体模块信息见表 8)。对8个模块分别进行GO分析，了解其生物学功能，发现Cluster1主要与平 滑肌收缩的调节、免疫应答调节、调节血管收缩、胆碱能突触传递等生物过程有 关；Cluster2主要与正调控发热的产生、免疫应答、调节NO的生物合成等通路 过程有关；Cluster3主要与刺激神经组织的配体-受体相互作用、谷氨酸能突触、 全身性红斑狼疮、多巴胺能合成等通路过程有关；Cluster4主要与激活胆汁酸受 体、炎症反应、抗氧化应激、镇静等生物过程有关；Cluster5主要与花生四烯酸 分泌与代谢、脂氧合酶途径、脂质分解代谢等生物过程有关；Cluster6主要与免 疫炎症过程、脂质代谢、蛋白质代谢等生物过程有关；Cluster7主要与刺激神经 组织的配体-受体相互作用、血管平滑肌收缩等通路过程有关；Cluster8主要与氨 基酸的合成与代谢有关。

表8 痰热清胶囊相关蛋白靶点的PPI网络的Cluster数据

利用OmicsBean分析软件对相关靶点蛋白进行功能注释分析(GO分析)， 包含细胞组分(CellularComponent)、分子功能(MolecularFunction)和生物过程(BiologicalProcess)3个方面，选取p值最小的前10个进行作图呈现(见图6)。 结果发现，这些蛋白在细胞组分方面主要参与构成谷氨酸受体、树突树结构、细 胞囊泡等过程；在分子功能方面主要参与蛋白结合绑定、酶结合、药物结合等过 程；在生物过程方面主要涉及有机物或含氧化合物的应激反应、对内源性刺激的 反应等过程。推测痰热清胶囊清热化痰解毒功效可能与以上功能过程相关。

在STRING 10数据库中得到142条相关通路，取false discovery rate<0.01的 通路共106条，随后对这106条通路进行KEGG通路分析及相关文献查阅，得 到68条相关信号通路(具体信息见表9)，通过Omicshare在线平台对false discovery rate值前20的通路进行可视化处理(见图7)，其中Richfactor表示相 关基因中位于该通路的基因数目与所有注释基因中位于该通路的基因总数的比 值，该值越大代表富集程度越高。

分析富集的通路发现，主要涉及与炎症免疫相关的通路，如花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、白介素17信号通路(IL-17signaling pathway) 肿瘤坏死因子α信号通路(TNF-αsignaling pathway)等；与解热止痛相关的通 路，如环磷酸腺苷信号通路(cAMP signaling pathway)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)等；与化痰镇咳相关的通路，如环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号 通路(cGMP-PKG signaling pathway)、cAMP signaling pathway等；与镇静相关 的通路，如神经活性配体-受体相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction) 等。

表9 68条富集通路信息表

根据对应关系在Cytoscape 3.6.1软件中，构建“化合物-靶点-通路-药理作用 -功效”的网络关系图(见图8)通过拓扑属性分析发现，该网络有67340条边， 且构建网络的节点度分布服从幂分布【P(x)＝106.67×x-1.275(R2＝0.81)】， 表明痰热清胶囊网络为无标度网络。特征路径长度3.331，即网络路径长度为3 步，大多数蛋白的联系非常密切，表明该网络具有较快的传播速度和较小的反应 时间，具有小世界性质。网络异质性为0.883，平均相邻节点数目7.169，网络中 心度0.155。提示痰热清胶囊网络具有无标度、小范围的体系结构。分析发现， 网络中既存在一个分子与多个靶点蛋白的相互作用，也存在不同分子作用于同一 个靶点蛋白的现象，显示了痰热清胶囊的多成分、多靶点、多通路的作用特点，初步阐释了痰热清胶囊清热、化痰、解毒药效物质基础和作用机制。

由此可见，痰热清胶囊中主要化学成分野黄芩苷、黄芩苷、千层纸素-7-O- 葡萄糖醛酸苷、白杨素-7-O-葡萄糖醛酸苷、连翘苷、连翘酯苷E、绿原酸、咖啡 酸、异绿原酸A、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、熊去氧胆酸、鹅 去氧胆酸等可能通过作用于TNF、EGFR、NOS3、PTGS2、IL2、GABBR1、 MAPK14、ADRB2、REN、VCAM1、ACHE、PTPRC等关键蛋白干预了多个与 清热、化痰、解毒相关的生物过程，从而发挥对COVID-19的治疗作用。

实施例4：基于网络药理学的痰热清注射液治疗新型冠状病毒肺炎机制研究 结果

结合BATMANTCM和TCMSP数据库，根据其MW、DL和HL值筛选出 候选化合物54个，其中黄芩化合物32个；熊胆粉化合物1个；山羊角化合物5 个，主要是氨基酸类，虽然DL值小于0.18，但作为主要成分仍被保留；金银花 化合物14个和连翘化合物10个。其中黄芩和金银花共有2个化合物，黄芩和连 翘共有1个化合物，金银花和连翘共有3个化合物，黄芩、金银花和连翘共有1 个化合物。54个候选化合物中，有48个候选化合物可在TCMSP数据库中匹配到287个人类靶点，6个候选化合物未能匹配到相关靶点。

将候选化合物与靶蛋白的关系构建成化合物-靶蛋白网络(图9)，网络中共 有335个节点(其中48个化合物节点及287个靶蛋白节点)和984条边。每个 候选化合物平均作用于5.979(287/48)个靶点，而每个靶蛋白平均连接药物的 数量为3.429(984/287)，说明TRQI是通过多成分-多靶点整体发挥作用。结合 网络拓扑学分析，该网络图的网络集中度为0.440、网络密度为0.018、网络异质 性为2.029、最短路径为111890。在图9中，节点的平均度值为5.8746，大于该 平均度值的节点有74个；节点平均介值中心度为0.006378，大于该平均介值中 心度的节点有42个。共有39个节点的度值和介值中心度均高于均值(见表10)， 其中化合物有23个，靶蛋白有16个。排名前1位的化合物和靶点分别为槲皮 素(M98，quercetin)、山柰酚(M422，kaempferol)、木犀草素(M6，luteolin)、 汉黄芩素(M173，wogonin)、PTGS2、β-谷甾醇(M358，β-sitosterol)、丝氨酸 (M3969，L-serin)、黄芩素(M2714，baicalein)、PTGS1和HSP90AA1。

表10 痰热清注射液成分-靶点网络关键节点及其拓扑学特征

以“coronavirus”为关键词，在Genecards数据库中挖掘出冠状病毒相关靶 点347个。将痰热清注射液的287个药物靶点与347个冠状病毒相关靶点在Venny 2.1.0中映射得出54个共同靶点，为了更好地探讨痰热清注射液的作用机制，将 痰热清注射液54个冠状病毒相关靶点蛋白输入STRING数据库，构建靶蛋白相 互作用PPI网络(图10)。该网络共有46个节点，116条相互作用关系，平均度 值为5.04。将在STRING平台中构建的PPI网络数据导入Cytoscape 3.2.1中，利 用Cytohubba插件中的Degree降序排列筛选出大于平均度值的核心靶点19个(图 11)。

综合之前得到的34个(其中CASP3重复)痰热清注射液关键靶点进行GO 生物过程富集分析，筛选出P<0.05的生物过程29个。利用Cytoscape插件 “ClueGo”得出GO生物过程富集分析的可视化结果如图12所示。涉及核质转 运正向调控、炎症反应、免疫系统、信号通路和细胞凋亡过程等，这些通路即是 痰热清注射液重要靶标干预的生物学过程。

对34个痰热清注射液关键靶点进行KEGG信号通路富集分析，筛选出 P<0.05的信号通路70条，利用Cytoscape插件“ClueGo”得出KEGG分析的可 视化结果如图13所示，涉及IL-17信号通路、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染、Th17细胞分化、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、非小细胞肺癌和趋化因子 信号通路等。

一般认为，配体与受体结合的构象稳定时能量越低，结合可能性越大。分子 对接结果显示，β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、黄芩素、木犀草素、汉黄芩素和丝 氨酸与2019-nCoV3CL水解酶的分子对接亲和力均远远小于-5.0kJ/mol，由此表 明痰热清注射液核心活性化合物与2019-nCoV 3CL水解酶有较好的结合活性， 结果见表11。山柰酚、槲皮素、黄芩素、木犀草素和汉黄芩素结合能与瑞德西 韦和匹洛那韦相近。

表11 痰热清注射液核心化合物以及临床报道有效药物与2019-nCoV 3CL水解酶结合能

由此可见，痰热清注射液的核心化合物可通过与2019-nCoV 3CL水解酶结 合发挥抗病毒作用并可调节多个信号通路，这可为痰热清注射液治疗COVID-19 提供理论依据。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护 范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内 容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保 护范围内。