阅读说明：本技术 利用癌特异性酶活性的前药型抗癌剂 (Prodrug-type anticancer agent utilizing cancer-specific enzyme activity ) 是由 浦野泰照 神谷真子 林健人 于 2019-03-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种有望作为前药型抗癌剂的新型化合物。以下的通式(I)所示的化合物或其盐。<Image he="382" wi="514" file="DDA0002662665530000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The present invention provides a novel compound which is expected to be a prodrug-type anticancer agent. A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof.)

利用癌特异性酶活性的前药型抗癌剂

技术领域

本发明涉及有望作为前药型抗癌剂的新型化合物和使用该化合物的前药型抗癌剂、医药组合物。

背景技术

在依然起到癌症治疗的重要作用的癌症化学疗法中，抗癌剂本身的组织·细胞·靶选择性并未令人满意，因此，总是伴有在显现药效的同时表现出严重的副作用的风险。

在癌细胞中特异性地释放这些抗癌剂的方法之一已知有前药化。前药化是对药剂实施通过癌细胞内的酶反应、化学反应而首次转变为活性体(抗癌剂)这样的结构修饰的方法。另一方面，作为问题可举出：难以鉴定癌细胞特异性亢进的酶，对具有复杂结构的现有的抗癌剂的结构修饰并不容易等。

发明内容

本发明的目的在于提供有望作为前药型抗癌剂的新型化合物。

在本发明人等的研究室中，进行了以建立一种能够全面且非侵入性地在新鲜临床样本上评价疾病部位特征性的代谢反应特性的探索基础技术为目标的研究，并且本发明人等考虑了是否能够通过运用迄今为止由人临床样本直接得到的有关疾病部位的代谢反应性的有用的信息来有效地进行基于前药方法的特异性高的治疗药的开发。

另外，本发明人等的研究小组基于以醌甲基化物化学(quinone methidechemistry)为基础的想法，开发出了通过酶反应而发出荧光，并且被标记为细胞内硫醇类，从而具有不会从细胞漏出的性质的SPiDER探针(图1)。

在此，本发明人等在进行本探针的活细胞应用实验时，明确了如果以高浓度使用探针，则发现显著的细胞毒性。毒性的机制尚未明确，但认为是因为细胞内谷胱甘肽之类的硫醇类被伴随酶反应而生成的醌甲基化物中间体消耗，对细胞造成氧化应激。

因此，本发明人等想到是否能够利用如上所述的现象，通过癌细胞特异性的酶活性而细胞选择性地造成较强的损伤，进行了新型前药型抗癌剂的开发，结果以至完成了本发明。

即，本发明提供如下方案。

[1]以下的通式(I)所示的化合物或其盐。

(式中，

X选自氟原子、酯基(－OC(＝O)－R’)、碳酸酯基(－OCO₂－R’)、氨基甲酸酯基(－OCONH－R’)、磷酸和磷酸酯基(－OP(＝O)(－OR’)(－OR”)以及硫酸和硫酸酯基(－OSO₂－OR’)，

在此，R’、R”各自独立地选自取代或无取代的烷基或者取代或无取代的芳基，

Y为－NH－CO－L、－NH－L’或－OL’，

在此，L为氨基酸的部分结构，

L’为糖类或糖类的部分结构、具有自切割型接头的糖类、具有自切割型接头的氨基酸类或肽，

R¹和R²各自独立地选自氢原子或一价的取代基，

R³表示氢原子或者存在于苯环上的1～4个相同或不同的一价的取代基。)

[2]根据[1]所述的化合物或其盐，其中，L的氨基酸的部分结构与其所键合的C＝O一起构成氨基酸、氨基酸残基、肽、氨基酸的一部分。

[3]根据[1]所述的化合物或其盐，其中，L’的糖类的部分结构与其所键合的O一起构成糖类、糖类的一部分。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的化合物或其盐，其中，相对于－C(R¹)(R²)X，通式(I)中的－Y键合在苯环的邻位或对位上。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的化合物或其盐，其中，Y具有选自以下的结构。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的化合物或其盐，其中，X为氟原子或酯基(－OCO－R’)。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的化合物或其盐，其中，R¹和R²各自独立地选自氢原子或氟原子。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的化合物或其盐，其中，R³的一价的取代基选自烷基、烷氧基羰基、硝基、氨基、羟基、烷基氨基(－NHR’、－NHCOR’)、烷氧基(－OR’、－OCOR’)、卤素原子、硼基、氰基(R’为取代或无取代的烷基或者取代或无取代的芳基)。

[9]根据[8]所述的化合物或其盐，其中，R³的一价的取代基为烷基(例如，甲基)或烷氧基羰基(例如，甲氧基羰基)。

[10]一种前药型抗癌剂，含有[1]～[9]中任一项所述的化合物或其医药上可允许的盐。

[11]一种前药型抗癌剂，含有[1]～[9]中任一项所述的化合物或其医药上可允许的盐，并通过癌细胞特异性的酶活性而细胞选择性地发挥作用。

[12]根据[11]所述的前药型抗癌剂，其中，所述酶为肽酶或糖苷酶。

根据本发明，能够提供有望作为前药型抗癌剂的新型化合物。

附图说明

图1是SPiDERβ－Gal探针的荧光发光的示意图。

图2是本发明的新型前药型抗癌剂的表达机制的示意图。

图3是醌甲基化物释放型前药化合物的结构。

图4表示使化合物1、2、3分别与β－Gal、DPP－IV、GGT进行体外反应而得的生成物的LC－MS分析结果。

图5是化合物1的CCK－8检测的试验结果。

图6是化合物2的CCK－8检测的试验结果。

图7是化合物3的CCK－8检测的试验结果。

图8是使用化合物3的SHIN3细胞中的有关细胞死亡观察的研究结果。

图9是使用化合物3的共培养条件下的有关细胞死亡观察的研究结果。

图10表示使用化合物3的SHIN3细胞和H226细胞中的细胞增殖的流式细胞术分析的结果。

图11是实施例中合成的具有酰基系离去基团的衍生物的结构式。

图12是使用苄基位离去基团转化衍生物确认酶识别能力的结果。

图13是关于苄基位离去基团转化衍生物的CCK－8检测的结果。

图14是实施例中合成的4位取代衍生物的CCK－8检测的结果。

图15是实施例中合成的5位取代衍生物的CCK－8检测的结果。

图16是对腹膜接种模型小鼠的gGlu－FMA给药试验概要。

图17是肠系膜上的肿瘤成像结果(上段：PBS给药小鼠，下段：gGlu－FMA给药小鼠)。

具体实施方式

本说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。

本说明书中，“烷基”可以为由直链状、支链状、环状或它们的组合构成的脂肪族烃基中的任一者。烷基的碳原子数没有特别限定，例如为碳原子数1～6个(C_1～6)、碳原子数1～10个(C_1～10)、碳原子数1～15个(C_1～15)、碳原子数1～20个(C_1～20)。指定碳原子数时，是指具有该数量范围的碳原子数的“烷基”。例如，C_1～8烷基包含甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基等。本说明书中，烷基可以具有1个以上任意的取代基。作为这样的取代基，例如可举出烷氧基、卤素原子、氨基、单或二取代氨基、取代甲硅烷基或者酰基等，但不限定于这些。烷基具有2个以上的取代基时，它们可以相同，也可以不同。对于包含烷基部分的其它取代基(例如烷氧基、芳基烷基等)的烷基部分也同样。

本说明书中，对于某官能团定义为“可以被取代”时，取代基的种类、取代位置和取代基的个数没有特别限定，具有2个以上的取代基时，它们可以相同，也可以不同。作为取代基，例如可举出烷基、烷氧基、羟基、羧基、卤素原子、磺基、氨基、烷氧基羰基、氧代基等，但不限定于这些。在这些取代基中可以进一步存在取代基。作为这样的例子，例如可举出卤代烷基、二烷基氨基等，但不限定于这些。

本说明书中，“芳基”可以为单环式或稠合多环式的芳香族烃基中的任一种，也可以为含有1个以上杂原子(例如，氧原子、氮原子或硫原子等)作为环构成原子的芳香族杂环。此时，有时也将其称为“杂芳基”或“杂芳香族”。芳基为单环和稠环中的任一种的情况也可以在所有可能的位置进行键合。作为单环式的芳基的非限定性的例子，可举出苯基(Ph)、噻吩基(2－或3－噻吩基)、吡啶基、呋喃基、噻唑基、

唑基、吡唑基、2－吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、哒嗪基、3－异噻唑基、3－异唑基、1,2,4－

二唑－5－基或1,2,4－

二唑－3－基等。作为稠合多环式的芳基的非限定性的例子，可举出1－萘基、2－萘基、1－茚基、2－茚基、2,3－二氢茚－1－基、2,3－二氢茚－2－基、2－蒽基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1,2－二氢异喹啉基、1,2,3,4－四氢异喹啉基、吲哚基、异吲哚基、酞嗪基、喹喔啉基、苯并呋喃基、2,3－二氢苯并呋喃－1－基、2,3－二氢苯并呋喃－2－基、2,3－二氢苯并噻吩－1－基、2,3－二氢苯并噻吩－2－基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、芴基或噻吨基等。本说明书中，芳基可以在其环上具有1个以上任意的取代基。作为该取代基，例如可举出烷氧基、卤素原子、氨基、单或二取代氨基、取代甲硅烷基或酰基等，但不限定于这些。芳基具有2个以上的取代基时，它们可以相同，也可以不同。对包含芳基部分的其它取代基(例如芳氧基、芳基烷基等)的芳基部分也同样。

本说明书中，“芳基烷基”表示被上述芳基取代的烷基。芳基烷基可以具有1个以上任意的取代基。作为该取代基，例如可举出烷氧基、卤素原子、氨基、单或二取代氨基、取代甲硅烷基或酰基等，但不限定于这些。酰基具有2个以上的取代基时，它们可以相同，也可以不同。作为芳基烷基的非限定性的例子，可举出苄基、2－噻吩基甲基、3－噻吩基甲基、2－吡啶基甲基、3－吡啶基甲基、4－吡啶基甲基、2－呋喃基甲基、3－呋喃基甲基、2－噻唑基甲基、4－噻唑基甲基、5－噻唑基甲基、2－唑基甲基、4－

唑基甲基、5－

唑基甲基、1－吡唑基甲基、3－吡唑基甲基、4－吡唑基甲基、2－吡嗪基甲基、2－嘧啶基甲基、4－嘧啶基甲基、5－嘧啶基甲基、1－吡咯基甲基、2－吡咯基甲基、3－吡咯基甲基、1－咪唑基甲基、2－咪唑基甲基、4－咪唑基甲基、3－哒嗪基甲基、4－哒嗪基甲基、3－异噻唑基甲基、3－异

唑基甲基、1,2,4－

二唑－5－基甲基或1,2,4－二唑－3－基甲基等。

本说明书中，“烷氧基”是指上述烷基键合于氧原子而成的结构，例如可举出直链状、分枝状、环状或它们的组合的饱和烷氧基。例如可举出甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、环丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、环丁氧基、环丙基甲氧基、正戊氧基、环戊氧基、环丙基乙氧基、环丁基甲氧基、正己氧基、环己氧基、环丙基丙氧基、环丁基乙氧基或环戊基甲氧基等作为优选的例子。

本说明书中，“亚烷基”是指由直链状或支链状的饱和烃构成的二价的基团，例如可举出亚甲基、1－甲基亚甲基、1,1－二甲基亚甲基、亚乙基、1－甲基亚乙基、1－乙基亚乙基、1,1－二甲基亚乙基、1,2－二甲基亚乙基、1,1－二乙基亚乙基、1,2－二乙基亚乙基、1－乙基－2－甲基亚乙基、三亚甲基、1－甲基三亚甲基、2－甲基三亚甲基、1,1－二甲基三亚甲基、1,2－二甲基三亚甲基、2,2－二甲基三亚甲基、1－乙基三亚甲基、2－乙基三亚甲基、1,1－二乙基三亚甲基、1,2－二乙基三亚甲基、2,2－二乙基三亚甲基、2－乙基－2－甲基三亚甲基、四亚甲基、1－甲基四亚甲基、2－甲基四亚甲基、1,1－二甲基四亚甲基、1,2－二甲基四亚甲基、2,2－二甲基四亚甲基、2,2－二正丙基三亚甲基等。

1.通式(I)所示的化合物或其盐

本发明的1个实施方式是以下的通式(I)所示的化合物或其盐。

即，本发明人等基于以醌甲基化物化学为基础的想法，并运用上述的由通过酶反应而发出荧光并且被标记为细胞内硫醇类而具有不会从细胞漏出的性质的SPiDER探针等得到的本发明人等的研究的见解，对通过癌细胞特异性的酶活性而活化从而释放醌甲基化物的化合物进行分子设计，结果发现上述的通式(I)所示的化合物能够通过癌细胞特异性的酶活性而细胞选择性地造成较强的损伤，在新型前药型抗癌剂中有用(图2参照)。

在此，通式(I)中，Y为酶识别部位，是通过癌细胞特异性酶活性而将其一部切断而诱发醌甲基化物的形成的部位。

Y可以根据酶的种类而选择。前药型抗癌剂的目标酶为糖苷酶时，Y选自来自糖类的基团，目标酶为肽酶时，Y选自来自氨基酸类的基团、含有氨基酸类的基团。

通式(I)中，Y优选为－NH－CO－L、－NH－L’或－OL’。

在此，L为氨基酸的部分结构。L的氨基酸的部分结构是指与L所键合的C＝O一起构成氨基酸、氨基酸残基、肽、氨基酸的一部分。

本说明书中，“氨基酸”只要是具有氨基和羧基这两者的化合物就可以使用任意的化合物，包含天然和非天然的化合物。可以为中性氨基酸、碱性氨基酸或酸性氨基酸中的任一者，除其本身作为神经递质等递质发挥作用的氨基酸以外，还可以使用作为生理活性肽(除二肽、三肽、四肽以外，还包含寡肽)、蛋白质等多肽化合物的构成成分的氨基酸，例如可以为α氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸等。作为氨基酸，优选使用光学活性氨基酸。例如，对于α氨基酸，可以使用D－或L－氨基酸中的任一者，但有时优选选择在生物体中发挥功能的光学活性氨基酸。

本说明书中，“氨基酸残基”是指与从氨基酸的羧基除去羟基而得的剩余的部分结构对应的结构。

氨基酸残基包含α氨基酸的残基、β氨基酸的残基、γ氨基酸的残基。作为优选的氨基酸残基，可举出GGT底物的“γ－谷氨酰胺基”、DPP4底物的二肽“由氨基酸－脯氨酸构成的二肽”等。

L’为糖类或糖类的部分结构、具有自切割型接头的糖类、具有自切割型接头的氨基酸类或肽。

L’的糖类的部分结构与L’所键合的O一起构成糖类、糖类的一部分。

作为糖类，可举出β－D－葡萄糖、β－D－半乳糖、β－L－半乳糖、β－D－木糖、α－D－甘露糖、β－D－岩藻糖、α－L－岩藻糖、β－L－岩藻糖、β－D－***糖、β－L－***糖、β－D－N－乙酰葡糖胺、β－D－N－乙酰半乳糖胺等，优选为β－D－半乳糖。

自切割型接头是指自发地被切断·分解的接头，例如可举出氨基甲酸酯、脲、对氨基苄氧基等。

本发明的1个优选的方面中，Y具有选自以下的结构。

通式(I)中，Y的酶识别部位通过癌细胞特异性酶活性将其一部分切断，从而X作为从苯环离去的离去基团发挥作用，其结果，形成醌甲基化物。

X选自氟原子、酯基(－OC(＝O)－R’)、碳酸酯基(－OCO₂－R’)、氨基甲酸酯基(－OCONH－R’)、磷酸和磷酸酯基(－OP(＝O)(－OR’)(－OR”)以及硫酸和硫酸酯基(－OSO₂－OR’)。

在此，R’、R”各自独立地选自取代或无取代的烷基或者取代或无取代的芳基。

作为X，优选氟原子或酯基(－OCO－R’)。虽然无意受理论约束，但X为氟原子或酯基(－OCO－R’)时，如果Y被切断，则迅速地形成醌甲基化物。

R¹和R²各自独立地选自氢原子或一价的取代基。作为一价的取代基，为卤素原子、碳原子数1以上的烷基(例如，碳原子数1～6左右的烷基)。

R¹和R²优选各自独立地选自氢原子或氟原子。

通式(I)中的－Y优选相对于－C(R¹)(R²)X键合在苯环的邻位或对位上。如果－Y和－C(R¹)(R²)X在苯环上处于这样的位置关系，则在Y被切断时能够形成醌甲基化物结构。

R³表示氢原子或者存在于苯环上的1～4个相同或不同的一价的取代基。

作为R³的一价的取代基，选自碳原子数1以上的烷基(例如，碳原子数1～6左右的烷基)、烷氧基羰基、硝基、氨基、羟基、烷基氨基(－NHR’、－NHCOR’)、烷氧基(－OR’、－OCOR’)、卤素原子、硼基、氰基。在此，R’为取代或无取代的烷基或者取代或无取代的芳基。

作为R³的一价的取代基，优选为碳原子数1以上的烷基(例如，碳原子数1～6左右的烷基(例如，甲基))。虽然无意受理论约束，但烷基能够提高供电子性而提高杀细胞活性。

作为R³的位置，优选相当于－C(R¹)(R²)X的对位的5位或相当于间位的4位。

另外，通式(I)所示的化合物只要没有特别说明，则也包含其互变异构体、几何异构体(例如，E体、Z体等)、镜像异构体等立体异构体。即，通式(I)所示的化合物中包含1个或2个以上的不对称碳时，对于不对称碳的立体化学，可以各自独立地采取(R)体或(S)体中的任一者，有时以该衍生物的镜像异构体或非对映异构体等立体异构体的形式存在。因此，作为本发明的微小管聚合抑制剂的有效成分，可以使用纯的形态的任意的立体异构体、立体异构体的任意的混合物、外消旋体等，均包含在本发明的范围中。

将通式(I)所示的化合物或其盐的非限定性的例子示于以下。

2.前药型抗癌剂

本发明的另一个实施方式是一种前药型抗癌剂(以下也称为“本发明的前药型抗癌剂”)，其含有通式(I)的化合物或其医药上可允许的盐。

另外，本发明的另一个实施方式是一种前药型抗癌剂，其含有通式(I)的化合物或其医药上可允许的盐，并通过癌细胞特异性的酶活性而细胞选择性地发挥作用。

作为癌细胞特异性的酶，为肽酶或糖苷酶。

作为肽酶，肽酶可举出γ－谷氨酰转肽酶(GGT)、二肽基肽酶IV(DPP－IV)、钙蛋白酶。

作为糖苷酶，可举出β－半乳糖苷酶、β－葡萄糖苷酶、α－甘露糖苷酶、α－L－岩藻糖苷酶、β－氨基己糖苷酶、β－N－乙酰半乳糖苷酶等。

另外，本发明的另一个实施方式是一种用于治疗或预防乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌、口腔癌、肝癌等癌的医药组合物(以下也称为“本发明的医药组合物”)，其含有通式(I)的化合物或其医药上可允许的盐。

另外，本发明的另一个实施方式是哺乳动物、特别是人的乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌、口腔癌、肝癌等癌的治疗方法，该方法对需要这样的治疗的哺乳动物给予有效量的通式(I)的本发明的化合物或其医药上可允许的盐或者含有通式(I)所示的化合物或其医药上可允许的盐的医药组合物。

本发明的前药型抗癌剂或医药组合物不仅含有通式(I)所示的化合物，还可以含有其盐或它们的溶剂化物或者水合物。作为盐，只要是医药上可允许的盐就没有特别限定，例如可举出碱加成盐、酸加成盐、氨基酸盐等。作为碱加成盐，例如可举出钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等碱土金属盐、铵盐、或三乙胺盐、哌啶盐、吗啉盐等有机胺盐，作为酸加成盐，例如可举出盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、丙酸盐、酒石酸、富马酸、马来酸、苹果酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、肉桂酸、乳酸、乙醇酸、葡萄糖醛酸、抗坏血酸、烟酸、水杨酸等有机酸盐。作为氨基酸盐，可示例甘氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等。另外，也可以为铝盐等金属盐。

形成溶剂化物的溶剂的种类没有特别限定，例如可例示乙醇、丙酮、异丙醇等溶剂。

作为可利用本发明的前药型抗癌剂来治疗或预防的疾病，在广泛的癌种、特别是乳腺癌、食道癌、肺癌、头颈部癌、口腔癌、肝癌等中可期待大的效果。

本发明的前药型抗癌剂或医药组合物可以给予作为有效成分的通式(I)所示的化合物或其医药上可允许的盐、水合物或者溶剂化物本身，但一般而言，优选以含有作为有效成分的上述物质和1种或2种以上的制剂用添加物的医药组合物的形态进行给药。医药组合物这样的术语“组合物”不仅包含含有活性成分和构成载体的惰性成分(医药上可允许的赋形剂)的生成物，还包含作为任意的2种以上的成分的缔合、复合物化或凝聚的结果，或者作为1种以上的成分的解离的结果，或者作为1种以上的成分的其它类型的反应或相互作用的结果而直接或间接地产生的任意的生成物。

作为本发明的前药型抗癌剂或医药组合物的有效成分，可以组合使用上述化合物的2种以上。

另外，本发明的前药型抗癌剂或医药组合物也可以采用将作为有效成分的通式(I)所示的化合物或其医药上可允许的盐、水合物或者溶剂化物与现有的抗癌剂并用而成的组合医药。作为现有的抗癌剂，可以使用该技术领域中公知的抗癌剂，例如可举出甲氨喋呤、阿霉素、顺铂等。

本发明的前药型抗癌剂或医药组合物的种类没有特别限定，作为剂型，可举出片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、悬浮剂、栓剂、软膏、乳膏剂、凝胶剂、贴剂、吸入剂、注射剂等。这些制剂可以依据常规方法而制备。应予说明，对于液体制剂，可以为在使用时溶解或悬浮于水或其它适当的溶剂的形态。另外，片剂、颗粒剂可以利用周知的方法进行包衣。在注射剂的情况下，使本发明的化合物溶解于水而制备，但也可以根据需要溶解于生理盐水或葡萄糖溶液，另外，也可以添加缓冲剂、保存剂。以口服给药用或非口服给药用的任意的制剂形态提供。例如，可以作为颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂或液剂等形态的口服给药用医药组合物、静脉内给药用、肌肉内给药用或皮下给药用等的注射剂、点滴剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂、滴鼻剂、吸入剂、栓剂等形态的非口服给药用医药组合物而制备。注射剂、点滴剂等也可以以冷冻干燥形态等粉末状的剂形而制备，在使用时溶解于生理盐水等适当的水性介质而使用。另外，也可以将用高分子等被覆的缓释制剂向脑内直接给药。

本发明的前药型抗癌剂或医药组合物的制造中使用的制剂用添加物的种类、制剂用添加物相对于有效成分的比例或医药组合物的制造方法可以根据组合物的形态由本领域技术人员适当选择。作为制剂用添加物，可以使用无机或有机物质或者固体或液体的物质，一般而言，可以以相对于有效成分重量为1重量％～90重量％之间进行配合。具体而言，作为这样的物质的例子，可举出乳糖、葡萄糖、甘露醇、糊精、环糊精、淀粉、蔗糖、偏硅酸铝酸镁、合成硅酸铝、羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、羧甲基纤维素钙、离子交换樹脂、甲基纤维素、明胶、***胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、轻质无水硅酸、硬脂酸镁、滑石、黄蓍胶、膨润土、蜂胶、氧化钛、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、甘油、脂肪酸甘油酯、纯化羊毛脂、甘油明胶、聚山梨酸酯、聚乙二醇、植物油、蜡、液体石蜡、白色凡士林、碳氟化合物、非离子性表面活性剂、丙二醇、水等。

为了制造口服给药用的固形制剂，将有效成分和赋形剂成分例如乳糖、澱粉、结晶纤维素、乳酸钙、无水硅酸等进行混合而制成散剂，或者进一步根据需要添加白糖、羟丙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等粘合剂、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙等崩解剂等进行湿式或干式造粒而制成颗粒剂。为了制造片剂，只要将这些散剂和颗粒剂直接或加入硬脂酸镁、滑石等润滑剂进行压片即可。这些颗粒或片剂也可以用羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸－甲基丙烯酸甲酯聚合物等肠溶剂基剂被覆而制成肠溶剂制剂或者用乙基纤维素、巴西棕榈蜡、硬化油等被覆而制成持续性制剂。另外，为了制造胶囊剂，可以将散剂或颗粒剂填充于硬胶囊，或者将有效成分直接或溶解于甘油、聚乙二醇、芝麻油、橄榄油等后用明胶膜被覆而制成软胶囊。

为了制造注射剂，可以将有效成分根据需要与盐酸、氢氧化钠、乳糖、乳酸、钠、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等pH调节剂、氯化钠、葡萄糖等等渗剂一起溶解于注射用蒸馏水，进行无菌过滤并填充于安瓿中，或者进一步加入甘露醇、糊精、环糊精、明胶等进行真空冷冻干燥，制成使用时溶解型的注射剂。另外，也可以在有效成分中加入卵磷脂、聚山梨酸酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油等使其在水中乳化而制成注射剂用乳剂。

本发明的前药型抗癌剂或医药组合物的给药量和给药次数没有特别限定，可以根据治疗对象疾病的恶化·发展的防止和/或治疗的目的、疾病的种类、患者的体重和年龄、疾病的严重度等条件由医生的判断而适当选择。一般而言，口服给药中的成人每天的给药量为0.01～1000mg(有效成分重量)左右，可以一天1次或一天几次，或者每隔几天进行给药。作为注射剂使用时，优选将一天量0.001～100mg(有效成分重量)对成人进行连续给药或间歇给药。

通式(I)所示的化合物的制造方法没有特别限定，将通式(I)中所包含的化合物中关于代表性化合物的合成方法具体地示于本说明书的实施例。本领域技术人员可以参照本说明书的实施例和下述的方案并根据需要对起始原料、反应试剂、反应条件等进行适当改变或修饰来制造式(I)中所包含的化合物。

实施例

以下，利用实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于此。

1.醌甲基化物释放型前药化合物的合成

首先，如图3所示，通过以下的步骤合成3种在酶(β－Gal、DPP－IV、GGT)的酶识别部位、离去基团具有氟的单环式的化合物。

[合成实施例1]

通过以下的方案1合成本发明的化合物1(β－Gal－FMP)。

方案1

(1)化合物1的合成

化合物1

将2－(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯酚(301mg、1.26mmol)和碳酸铯(4.11g、12.6mmol)溶解于脱水DMF(7mL)，在氩气氛下以0℃搅拌5分钟。加入(2R,3S,4S,5R,6R)－2－(乙酰氧基甲基)－6－溴四氢－2H－吡喃－3,4,5－三苯甲基三乙酸酯(4.51g、11.0mmol)，在0℃搅拌5小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶，20％→40％乙酸乙酯/己烷)进行精制，得到无色液体的目标物(626.8mg，87％)。

¹H NMR(CD₂Cl₂，400MHz)：δ7.50(d，1H，J＝8.0Hz)，7.20(dd，1H，J＝8.0Hz，J＝7.3Hz)，7.08(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.00(d，1H，J＝7.8Hz)，5.47－5.43(m，2H)，5.13(dd，1H，J＝11Hz，J＝3.7Hz)，5.08(d，1H，J＝8.2Hz)，4.75(d，1H，J_gem＝15Hz)，4.62(d，1H，J_gem＝15Hz)，4.22－4.09(m，3H)，2.16(s，3H，OCOCH₃)，2.04(s，3H，OCOCH₃)，2.03(s3H，OCOCH₃)，1.98(s，3H，OCOCH₃)，0.96(s，9H，Si(CH₃)₃)，0.12(s，6H，Si(CH₃)₂).

(2)化合物2的合成

化合物2

使化合物1(76.7mg、0.135mmol)溶解于脱水二氯甲烷(5mL)，冷却至－78℃。加入TBAF(ca.1mol/L in THF、39μL、0.135mmol)，在－78℃搅拌1小时。接下来，加入Deoxo－Flour(注册商标)(132μL、0.675mmol)，进一步搅拌1小时。确认反应结束，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷进行2次萃取。乙酸乙酯层用水和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、20％→40％乙酸乙酯/己烷)进行精制，得到浅黄色液体的目标物(29.7mg、48％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ7.38(d，1H，J＝7.8Hz)，7.32(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.8Hz)，7.10(dd，1H，J＝8.2Hz，J＝7.8Hz)，7.07(d，1H，J＝8.2Hz)，5.54(dd，1H，J＝11Hz，J＝7.8Hz)，5.47(dd，1H，J_HBn－F＝48Hz，J_gem＝11Hz)，5.46(d，1H，J＝2.7Hz)，5.23(dd，1H，J_HBn－F＝48Hz，J_gem＝11Hz)，5.11(dd，1H，J＝11Hz，J＝3.7Hz)，5.03(d，1H，J＝7.8Hz)，4.25(dd，1H，J＝11Hz，J＝6.9Hz)，4.15(dd，1H，J＝11Hz，J＝6.0Hz)，4.08(dd，1H，J＝6.9Hz，J＝6.0Hz)，2.18(s，3H，OCOCH₃)，2.06(s，3H，OCOCH₃)，2.06(s，3H，OCOCH₃)，2.01(s，3H，OCOCH₃).

(3)化合物3的合成

化合物3

使化合物2(29.7mg、0.0650mmol)溶解于脱水甲醇(5mL)，冷却至0℃。加入28％NaOMe/MeOH(50μL)，在－78℃搅拌12小时。确认反应结束，用Amberlite IR120(注册商标)进行中和，进行过滤、浓缩。残渣利用反相HPLC(0％→100％乙腈/水)进行精制，得到白色固体的目标物(2.25mg，12％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.35(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.29(dd，1H，Hc，J_Hc－Hd＝8.2Hz，J_Hc－Hb＝7.3Hz)，7.21(d，1H，Hd，J_Hd－Hc＝8.2Hz)，7.03(dd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝J_Hb－Hc＝7.3Hz)，5.51(d，2H，H_Bn，J_HBn－F＝48Hz)，4.85(d，1H，H1，JH1－H2＝7.8Hz)，3.88(d，1H，H4，J_H4－H3＝3.7Hz)，3.79(dd，1H，H2，J_H2－H3＝9.6Hz，J_H2－H1＝7.8Hz)，3.78－3.70(m，2H，H6，6‘)，3.65(dd，1H，H5，J_H5－H6＝6.9Hz，J_H5－H6’＝5.0Hz)，3.55(dd，1H，H3，J_H3－H2＝9.6Hz，J_H3－H4＝3.7Hz)；HRMS311.08976(M+Na⁺).

[合成实施例2]

通过以下的方案2来合成本发明的化合物2(GP－FMA)。

方案2

(1)化合物4的合成

化合物4

(S)－(2－(2－((2－(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基7)吡咯烷－1－基)－2－氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(86.4mg、0.176mmol)溶解于脱水DMF(2mL)，冷却至0℃。加入HATU(206mg、0.532mmol)和DIPEA(183μL、1.06mmol)，在0℃搅拌5分钟。接下来，加入溶解于脱水DMF(1mL)的2－(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯胺(101mg、0.425mmol)，升温至室温，进一步搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶，40％→50％乙酸乙酯/己烷)进行精制，得到白色固体的目标物(88.1mg、51％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.44－7.41(m，2H)，7.28－7.18(m，2H)，4.75(d，1H，HBn，J_gem＝14Hz)，4.70(d，1H，HBn‘，J_gem＝14Hz)，4.53(dd，1H，J＝8.5Hz，J＝2.7Hz)，3.95(d，1H，J_gem＝17Hz)，3.88(d，1H，J_gem＝17Hz)，3.71－3.56(m，2H)，2.17－1.91(m，3H)，1.41(s，9H，NHCOO(CH₃)3)，0.91(s，9H，Si(CH₃)₃)，0.09(s，6H，Si(CH₃)₂).

(2)化合物5的合成

化合物5

使化合物4(96.5mg、0.354mmol)溶解于脱水THF(5mL)，加入TBAF(ca.1mol/L inTHF、879μL、0.879mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶、0％→7％甲醇/二氯甲烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(63.9mg、96％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.70(d，1H，J＝7.8Hz)，7.30(d，1H，J＝7.8Hz)，7.25(ddd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.8Hz，J＝1.4Hz)，7.13(ddd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.8Hz，J＝1.4Hz)，4.61(dd，1H，HBn，J_gem＝14Hz，J＝4.1Hz)，4.57(dd，1H，HBn，J_gem＝14Hz，J＝4.1Hz)，4.55(dd，1H，J＝8.5Hz，J＝3.7Hz)，3.94(s，2H)，3.73－3.55(m，2H)，2.30－2.12(m，2H)，2.10－2.03(m，2H)，1.43(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(3)化合物6的合成

化合物6

使化合物5(63.9mg、0.169mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，冷却至0℃。加入Deoxo－Flour(注册商标)(166μL、0.847mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、50％→70％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到浅黄色液体的目标物(22.9mg、36％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.93(brs，1H，－CONH－)，7.95(d，1H，J＝7.8Hz)，7.36(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.8Hz)，7.29(d，1H，J＝7.3Hz)，7.13(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，5.41(brs，1H，－OCONH－)，5.39(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz)，4.76(d，1H，J＝6.9Hz)，4.03(dd，1H，J_gem＝17Hz，J＝5.0Hz)，3.93(dd，1H，J_gem＝17Hz，J＝4.6Hz)，3.60－3.54(m，1H)，3.49－3.40(m，1H)，2.22－2.11(m，1H)，2.11－2.02(m，1H)，2.01－1.90(m，1H)，1.44(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(4)化合物7的合成

化合物7

使化合物6(22.9mg、0.0604mmol)溶解于乙酸乙酯(1mL)，加入4M.盐酸/乙酸乙酯(2mL)，在室温下搅拌12小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(0.1％乙酸，0％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(5.7mg、30％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.46(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.41－7.27(m，3H，Hb，Hc，Hd)，5.38(ddd，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz，J_HBn‘－_F＝34Hz，J_gem＝11Hz)，4.61(dd，1H，Hα₂，J_α2－_β2＝8.2Hz，J_α2－β₂’＝3.7Hz)，3.88(d，2H，Hα1，J_gem＝4.1Hz)，3.68－3.52(m，2H，Hδ)，2.39－2.28(m，1H，Hβ2)，2.17－1.97(m，3H，Hβ2，Hγ2)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ172.1，164.8，128.9，128.1，126.6，125.9，60.6，46.4，40.2，29.5，24.5；HRMS 280.14657(M+H⁺).

[合成实施例3]

通过以下的方案3来合成本发明的化合物3(gGlu－FMA)。

方案3

(1)化合物8的合成

化合物8

使(S)－5－(叔丁氧基)－4－((叔丁氧基羰基)氨基)－5－氧代戊酸(1.26g、4.17mmol)溶解于脱水DMF(15mL)，冷却至0℃。加入HATU(2.42g、6.25mmol)和DIPEA(2.16mL、12.5mmol)，在0℃搅拌5分钟。接下来，加入溶解于脱水DMF(5mL)的2－(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯胺(1.19g、5.00mmol)，升温至室温，进一步搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、10％→30％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到黄色液体的目标物(2.18g，定量的)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.88(brs，1H，－CONH－)，8.15(d，1H，J＝8.2Hz)，7.29(dd，1H，J＝8.2Hz，J＝7.3Hz)，7.10(d，1H，J＝6.9Hz)，7.13(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝6.9Hz)，5.20(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，4.75(d，1H，HBn，J_gem＝13Hz)，4.71(d，1H，HBn‘，J_gem＝13Hz)，4.27－4.15(m，1H)，2.52－2.34(m，2H)，2.32－2.20(m，1H)，2.07－1.95(m，1H)，1.46(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.42(s，9H，NHCOO(CH₃)₃)，0.90(s，9H，Si(CH₃)₃)，0.07(s，6H，Si(CH₃)₂).

(2)化合物9的合成

化合物9

使化合物8(2.18g、4.17mmol)溶解于脱水THF(10mL)，加入TBAF(ca.1mol/L inTHF、10mL、10mmol)，在室温下搅拌2小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、20％→80％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(943mg、54％)。

¹H NMR(CD₂Cl₂，400MHz)：δ8.69(brs，1H，－CONH－)，7.91(d，1H，J＝7.3Hz)，7.29(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.23(d，1H，J＝7.3Hz)，7.09(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝6.3Hz)，4.66(m，2H，HBn)，4.22－4.11(m，1H)，2.80(brs，1H，－CH₂OH)，2.51－2.35(m，2H)，2.29－2.16(m，1H)，1.97－1.85(m，1H)，1.44(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.40(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(3)化合物10的合成

化合物10

使化合物9(215mg、0.527mmol)溶解于脱水二氯甲烷(10mL)，冷却至0℃。加入Deoxo－Flour(注册商标)(514μL、2.64mmol)，在室温下搅拌12小时。确认反应结束，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、20％→30％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到浅黄色液体的目标物(151.8mg、70％)。

¹H NMR(CD₂Cl₂，40MHz)：δ8.04(brs，1H，－CONH－)，7.84(d，1H，J＝8.2Hz)，7.37(dd，1H，J＝8.2Hz，J＝7.3Hz)，7.33(d，1H，J＝6.9Hz)，7.17(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝6.9Hz)，5.43(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz，J_gem＝11Hz)，4.22－4.11(m，1H)，2.80(brs，1H，－CH₂OH)，2.51－2.35(m，2H)，2.29－2.16(m，1H)，1.97－1.85(m，1H)，1.44(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.40(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(4)化合物11的合成

化合物11

使化合物10(70.3mg、0.171mmol)溶解于乙酸乙酯(2mL)，加入4M.盐酸/乙酸乙酯(2mL)，在室温下搅拌12小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(0.1％乙酸、0％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(28.9mg、58％)。

¹H NMR(CD₂Cl₂，400MHz)：δ7.49(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.8Hz)，7.43(dd，1H，Hc，J_Hc－Hb＝J_Hc－Hd＝7.8Hz)，7.36(dd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝J_Hb－Hc＝7.8Hz)，7.29(d，1H，Hd，J_Hd－Hc＝7.8Hz)，5.35(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz)，3.80－3.77(m，1H，Hα)，2.67－2.56(m，2H，Hγ)，2.20－2.15(m，2H，Hβ)；¹³C NMR(D₂O，100MHz)：δ174.7，173.8，134.3，132.0，130.4，130.0，128.1，127.5，82.9，81.3，54.1，31.6，26.3；HRMS 255.11370(M+H⁺).

[实施例1]

接着，使用合成的3种化合物和纯化酶在以下的条件下进行酶反应。

化合物终浓度：100μM

酶终浓度：4nM(β－Gal)、8.5μg/mL(DPP－IV)、10U/mL(GGT)

反应温度：37℃

(1)使用β－半乳糖苷酶的酶反应

机种：ACQUITY UPLC(Waters公司制)

柱：Poroshell 120、4.6×100mm(Agilent公司制)

流动相A：水(0.01M甲酸铵)

流动相B：80％乙腈/水(0.01M甲酸铵)

梯度：A/B：95/5→5/95、5分钟

(2)使用DPP－IV和GGT的酶反应

机种：1260Infinity(Agilent公司制)

柱：Poroshell 120、4.6×100mm(Agilent公司制)

流动相A：水(0.01M甲酸铵)

流动相B：80％乙腈/水(0.01M甲酸铵)

梯度：A/B：95/5→50/50、20分钟

将结果示于图4。

化合物1～3分别被β－Gal、DPP－IV、GGT切断，作为反应生成物确认到醌甲基化物与H₂O反应而成的2－羟基苄基醇(β－Gal)或2－氨基苄基醇(DPP－IV、GGT)。

对GGT也进行了放入抑制剂的实验，但确认了如果以100μM的浓度添加作为GGT抑制剂的GGsTop(注册商标)，则会抑制模型化合物的酶反应。

[实施例2]

使用酶高表达/低表达细胞的体外药效试验

接着，将化合物1～3给予酶高表达/低表达细胞时，验证它们是否可以作为前药发挥作用而改变细胞存活率。药效试验通过使用一般的比色定量法即CCK－8检测(以从无色的WST－8向橙色的甲臜的还原这样的形式对活细胞内的脱氢酶活性进行定量的方法)对活细胞数进行定量来进行。以下记载CCK－8检测的评价方法。

(1)使用的培养细胞

β－半乳糖苷酶活化前药的评价使用HEK/lacZ细胞(来自人肾细胞的细胞、β－Gal高表达)和HEK293细胞(来自人肾细胞的细胞、β－Gal低表达)进行。DPP－IV活化前药的评价使用H226细胞(人肺扁平上皮癌细胞、DPP－IV高表达)和H460细胞(人非小细胞性上皮性肺癌细胞、DPP－IV低表达)进行。GGT活化前药的评价使用SHIN3细胞(人卵巢癌细胞、GGT高表达)和H226细胞(人肺扁平上皮癌细胞、GGT低表达)进行。

(2)评价方法

将各种细胞接种于96孔板(细胞密度：1.0×10⁴/孔)，孵育一晩。更换为新鲜的培养基，添加合成的衍生物(最终浓度1～50μM、0.5％DMSO、n＝3)。进一步将细胞培养24小时后，添加Cell counting Kit－8(10μL/孔、Promega公司制)，2.5小时后，利用读板器测定450nm的吸光度，进行存活细胞数的定量。

将CCK－8检测的结果示于图5～7。

首先，将β－半乳糖苷酶用的化合物1(β－Gal－FMP)给予高表达细胞(HEK/lacZ)和低表达细胞(HEK293)，在24小时后算出存活率。其结果，即使以50μM这样的高浓度进行给药，两种细胞的存活率也完全未降低，也没有观测到显著的差异(图5)。与利用β－半乳糖苷酶的结果对照地，使用作为氨基肽酶的DPP－IV和GGT的化合物2、3(GP－FMA、gGlu－FMA)时，在酶高表达/低表达细胞间细胞观测到存活率的变化(图6、7)。根据该结果，提示(i)DPP－IV、GGT(细胞膜)与β－半乳糖苷酶(细胞质)的局部存在的差异、(ii)醌甲基化物种的差异(DPP－IV和GGT释放氮杂醌甲基化物)是重要的，但现阶段并未明确。特别是GGT前药由于细胞种选择性高且利用GGT抑制剂的GGsTop(注册商标)使存活率完全恢复，因此，预测大部分药效显现依赖于GGT活性。

[实施例3]

共培养条件下的有关细胞死亡观察的研究

进行细胞种的变更，并将培养基统一为RPMI－1640，从而能够进行共培养，因此，接下来旨在共培养条件下的细胞死亡观察和定量法的构建。根据迄今为止的结果，使用GGT用化合物3(gGlu－FMA)进行这些研究，首先，作为初期研究，使用1种细胞，调查是否能够通过荧光观察来视觉上观察细胞死亡(图8)。实验以以下的规程1进行。

(规程1)

图8表示使用化合物3和EthD－1的SHIN3细胞(上)和H226细胞(下)的经时荧光成像(死细胞染色、Ex/Em＝525nm/511～564nm)。

镜头63x/1.4油镜。

扫描模式：xyzt、x＝512、y＝512、z＝4、t＝24。

比例尺：50μm。

根据图8的结果，能够确认作为GGT高表达细胞株的SHIN3细胞更加引起细胞死亡的情形，因此，接下来进行共培养系统中的评价。实验以以下的规程2进行。

(规程2)

将结果示于图9。

图9表示使用化合物3和EthD－1的共培养细胞的延时摄影荧光成像(死细胞染色、Ex/Em＝525nm/511－564nm)(上)。

24小时成像后的其它3个视场中的细胞的共聚焦成像(下)。

镜头63x/1.4油镜。

扫描模式：xyzt、x＝512、y＝512、z＝4、t＝24。

比例尺：50μm。

由图9上段所示的24小时延时成像的结果可知，明确了GGT用化合物3(gGlu－FMA)即使在共培养系统中也选择性地损伤高表达细胞。另外，由于在迄今为止的研究中进行10切片×24次的摄像时观测到光毒性(视场内的细胞大量死亡)，因此，本次虽然是4切片×24次的摄像，但担心光毒性的影响。因此，在24小时的成像结束后对其它视场摄像3个视场左右(图9下段)，结果发现在低表达细胞(绿色)的间隙存在死细胞的同样的趋势，因此，判断为化合物3很好地工作从而实现了分开杀死。

[实施例4]

利用Flow Cytometry(流式细胞术)的药效评价

通过使用荧光色素的成像表明，共培养条件下的细胞死亡能够实时观测。另一方面，由于无法定量地讨论高表达/低表达细胞的存活率发生了何种程度的变化，因此，研究它们是否能够使用流式细胞术进行评价(图10)。实验以以下规程3进行。

(规程3)

图10表示使用化合物3的SHIN3细胞(绿色)和H226细胞(未被染色)中的细胞增殖的流式细胞术分析的结果。(上)25μM模型化合物、(中央)25μM模型化合物+100μM GGsTop、(下)0.25％DMSO对照。分析在24小时的孵育后进行。

根据图10的结果，仅GGT前药给药组诱导了细胞死亡(发现EthD－1的死亡染色)，并且通过流式细胞术也明确了引起作为GGT高表达细胞的SHIN3细胞选择性的细胞死亡。

苄基位离去基团转化衍生物的合成

接着，进行了以GGT为靶的苄基位转化衍生物的合成的研究。参考Evans的pK_a表(参照D.H.Ripin；D.A.Evans，http://evans.rc.fas.harvard.edu/pdf/evans_pKa_table.pdf)来验证是否能够合成图11所示这样的具有有酰基系离去基团的衍生物。

[合成实施例4]

通过以下的方案4来合成本发明的化合物。

方案4

(1)化合物11的合成

化合物11

使(S)－5－(烯丙氧基)－4－(((烯丙氧基)羰基)氨基)－5－氧代戊酸(930mg、3.45mmol)溶解于脱水DMF(17mL)，冷却至0℃。加入HATU(1.96g，5.14mmol)和DIPEA(1.75mL、10.3mmol)，在0℃搅拌5分钟。接下来，加入溶解于脱水DMF(5mL)的2－(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯胺(1.22g、5.14mmol)，升温至室温，进一步搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶，50％→60％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到黄色液体的目标物(848mg、86％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.91(brs，1H，－CONH－)，8.16(d，1H，J＝7.8Hz)，7.29(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.08(d，1H，J＝7.3Hz)，7.02(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝7.3Hz，5.95－5.82(m，2H)，5.61(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.32(d，1H，J＝17Hz)，5.28(d，1H，J＝17Hz)，5.24(d，1H，J＝11Hz)，5.18(d，1H，J＝11Hz)，4.73(s，2H，HBn)，4.64(d，1H，J＝5.5Hz)，4.56－4.52(m，2H)，4.47－4.37(m，1H)，2.56－2.39(m，2H)，2.38－2.27(m，1H)，2.18－2.05(m，1H)，0.90(s，9H，Si(CH₃)₃)，0.08(s，6H，Si(CH₃)₂).

(2)化合物12的合成

化合物12

使化合物11(1.29g、2.63mmol)溶解于脱水THF(20mL)，加入TBAF(ca.1mol/L inTHF，7.89mL、7.89mmol)和乙酸(304μL、5.26mmol)，在室温下搅拌3小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、50％→60％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(848mg、86％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.73(brs，1H，－CONH－)，7.97(d，1H，J＝8.2Hz)，7.30(dd，1H，J＝8.2Hz，J＝7.8Hz)，7.18(d，1H，J＝7.3Hz)，7.07(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，5.95－5.79(m，2H，5.67(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.32(d，1H，J＝17Hz)，5.27(d，1H，J＝17Hz)，5.24(d，1H，J＝10Hz)，5.19(d，1H，J＝10Hz)，4.74－4.61(m，2H，HBn)，4.63(d，1H，J＝6.0Hz)，4.57－4.45(m，2H)，4.45－4.35(m，1H)，2.97(brs，1H，CH₂OH)，2.55－2.40(m，2H)，2.39－2.26(m，1H)，2.12－1.96(m，1H).

(3)化合物13的合成

化合物13

使化合物12(29.6mg、0.0786mmol)和三乙胺(110μL、0.786mmol)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，加入乙酸酐(15μL、0.157mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶、30％→40％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(31.8mg、97％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.86(brs，1H，－CONH－)，7.96(d，1H，J＝7.8Hz)，7.35(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.34(d，1H，J＝7.3Hz)，7.13(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，5.95－5.81(m，2H)，5.68(brd，1H，－OCONH－，J＝7.3Hz)，5.32(d，1H，J＝17Hz)，5.27(d，1H，J＝17Hz)，5.24(d，1H，J＝11Hz)，5.18(d，1H，J＝11Hz)，5.13(d，1H，HBn，J_gem＝12Hz)，5.08(d，1H，HBn‘，J_gem＝12Hz)，4.63(d，1H，J＝5.5Hz)，4.58－4.48(m，2H)，4.48－4.39(m，1H)，2.62－2.46(m，2H)，2.41－2.27(m，1H)，2.19－2.05(m，1H)，2.08(s，3H，OCOCH₃).

(4)化合物14的合成

化合物14

使化合物13(31.7mg、0.0758mmol)和苯基硅烷(234μL、1.89mmol)溶解于脱水二氯甲烷(20mL)，加入四(三苯基膦)钯(21.8mg、0.0189mmol)，在室温下搅拌2小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(0％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(8.0mg、36％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.40(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.38(d，1H，Hd，J_Hd－Hc＝7.3Hz)，7.32(dd，1H，Hc，J_Hc－Hb＝J_Hc－Hd＝7.3Hz)，7.24(dd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝J_Hb－Hc＝7.3Hz)，5.09(s，2H，HBn)，3.63(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.2Hz)，2.65(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝J_Hγ－Hβ＝7.3Hz)，2.18(td，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝7.3Hz，J_Hβ－Hα＝6.2Hz)，2.05(s，3H，CH₃COO－)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ172.3，172.4，171.4，135.3，131.1，129.4，128.6，126.3，126.1，62.6，54.3，32.0，26.5，19.5；HRMS 317.11124(M+Na⁺).

(5)化合物15的合成

化合物15

使化合物12(35.1mg、0.0933mmol)、DIPEA(96μL、0.560mmol)和DMAP(3.5mg)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，加入4－甲氧基苯甲酰氯(19mg、0.112mmol)，在室温下搅拌4小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶，20％→40％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(43.2mg、91％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ9.20(brs，1H，－CONH－)，8.00(d，2H，J＝9.2Hz)，8.00(d，1H，J＝7.3Hz)，7.43(d，1H，J＝7.8Hz)，7.37(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.14(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝7.3Hz)，6.90(d，2H，J＝9.2Hz)，5.95－5.82(m，2H)，5.71(brd，1H，－OCONH－，J＝6.9Hz)，5.35(d，1H，HBn，J_gem＝12Hz)，5.34(d，1H，J＝19Hz)，5.31(d，1H，HBn‘，J_gem＝12Hz)，5.27(d，1H，J＝19Hz)，5.23(d，1H，J＝11Hz)，5.17(d，1H，J＝11Hz)，4.63(d，1H，J＝6.0Hz)，4.58－4.50(m，2H)，4.50－4.41(m，1H)，3.85(s，3H，ArOCH₃)，2.67－2.52(m，2H)，2.42－2.30(m，1H)，2.24－2.07(m，1H).

(6)化合物16的合成

化合物16

使化合物15(26.4mg、0.0517mmol)和苯基硅烷(160μL、1.29mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，加入四(三苯基膦)钯(14.9mg、0.0129mmol)，在室温下搅拌3小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(7.8mg、39％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.96(d，2H，He，Hf，J_He－Hh＝J_Hf－_Hg＝9.2Hz)，7.50(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.41(d，1H，Hd，J_Hd－_Hc＝6.9Hz)，7.34(dd，1H，Hc，J_Hc－Hb＝7.8Hz，J_Hc－Hd＝6.9Hz)，7.26(dd，1H，Hb，J_Hb－Hc＝7.8Hz，J_Hb－Ha＝7.3Hz)，6.97(d，2H，Hg，Hh，J_Hg－Hf＝J_Hh－He＝9.2Hz)，5.32(s，2H，HBn)，3.83(s，3H，－OCH₃)，3.62(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.0Hz)，2.66(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝J_Hγ－Hβ＝7.3Hz)，2.17(td，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝7.3Hz，J_Hβ－Hα＝6.0Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ172.9，166.5，164.0，135.3，131.4，131.3，129.4，128.6，126.4，126.0，122.0，113.6，62.8，54.7，54.4，32.0，26.5；HRMS 409.13271(M+Na⁺).

(7)化合物17的合成

化合物17

使化合物12(29.7mg、0.0789mmol)、DIPEA(82μL、0.473mmol)和DMAP(3.0mg)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，加入4－氯苯甲酰氯(13μL、0.0947mmol)，在室温下搅拌4小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶，20％→40％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(33.8mg、83％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ9.02(brs，1H，－CONH－)，7.97(d，2H，J＝8.7Hz)，7.95(d，1H，J＝7.3Hz)，7.43(d，1H，J＝7.8Hz)，7.43(d，2H，J＝8.7Hz)，7.37(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.16(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝7.3Hz)，5.95－5.79(m，2H)，5.69(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.38(d，1H，HBn，J_gem＝12Hz)，5.35(d，1H，J＝17Hz)，5.33(d，1H，HBn‘，J_gem＝12Hz)，5.26(d，1H，J＝17Hz)，5.23(d，1H，J＝9.6Hz)，5.16(d，1H，J＝9.6Hz)，4.63(d，1H，J＝6.0Hz)，4.56－4.48(m，2H)，4.49－4.40(m，1H)，2.66－2.51(m，2H)，2.43－2.30(m，1H)，2.20－2.05(m，1H).

(8)化合物18的合成

化合物18

使化合物17(33.7mg、0.0654mmol)和苯基硅烷(203μL，1.63mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，加入四(三苯基膦)钯(18.9mg、0.0163mmol)，在室温下搅拌3小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(3.8mg、15％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.99(d，2H，He，Hf，J_He－Hh＝J_Hf－Hg＝7.8Hz)，7.51(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.8Hz)，7.48(d，2H，Hg，Hh，J_Hg－Hf＝J_Hh－He＝7.8Hz)，7.40(d，1H，Hd，J_Hd－Hc＝7.8Hz)，7.34(dd，1H，Hc，J_Hc－Hd＝7.8Hz，J_Hc－Hb＝7.3Hz)，7.27(dd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝7.8Hz，J_Hb－Hc＝7.3Hz)，5.36(s，2H，HBn)，3.62(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.0Hz)，2.66(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝J_Hγ－Hβ＝7.3Hz)，2.16(td，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝7.3Hz，J_Hβ－Hα＝6.0Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ172.9，172.5，165.6，139.4，135.4，131.1，130.9，129.5，128.8，128.6，126.5，126.2，63.3，54.3，32.0，26.5；HRMS 413.08817(M+Na⁺).

(9)化合物19的合成

化合物19

使化合物12(31.5mg、0.0837mmol)、DIPEA(87μL、0.502mmol)和DMAP(3.2mg)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，加入4－硝基苯甲酰氯(18.6mg、0.100mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶，30％→40％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(40.5mg、92％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.86(brs，1H，－CONH－)，8.27(d，2H，J＝8.7Hz)，8.21(d，2H，J＝8.7Hz)，7.91(d，1H，J＝7.8Hz)，7.45(d，1H，J＝7.3Hz)，7.38(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.18(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝7.3Hz)，5.95－5.78(m，2H)，5.67(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.44(d，1H，HBn，J_gem＝12Hz)，5.39(d，1H，HBn’，J_gem＝12Hz)，5.31(d，1H，J＝17Hz)，5.25(d，1H，J＝17Hz)，5.23(d，1H，J＝11Hz)，5.16(d，1H，J＝11Hz)，4.63(d，1H，J＝6.0Hz)，4.56－4.39(m，3H)，2.65－2.51(m，2H)，2.43－2.29(m，1H)，2.20－2.03(m，1H).

化合物20(N⁵－(2－(((4－硝基苯甲酰基)氧基)甲基)苯基)－L－谷氨酰胺)的合成

化合物20

使化合物19(40.5mg、0.0771mmol)和苯基硅烷(239μL、1.92mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，加入四(三苯基膦)钯(22.3mg、0.0192mmol)，在室温下搅拌2小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(6.3mg、20％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ8.31(d，2H，He，Hf，J_He－Hh＝J_Hf－Hg＝9.2Hz)，8.22(d，2H，Hg，Hh，J_Hg－Hf＝J_Hh－He＝9.2Hz)，7.53(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.40－7.34(m，2H，Hc，Hd)，7.29(ddd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝J_Hb－Hc＝7.3Hz，J_Hb－Hd＝1.8Hz)，5.41(s，2H，HBn)，3.62(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.0Hz)，2.66(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝J_Hγ－Hβ＝7.3Hz)，2.16(td，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝7.3Hz，J_Hβ－Hα＝6.0Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ173.0，172.5，164.7，150.8，135.5，130.9，130.5，129.7，129.0，128.0，127.6，126.5，125.6，124.6，123.3，63.9，54.3，32.0，26.6；HRMS 413.11126(M+Na⁺).

(11)化合物21的合成

化合物21

使化合物12(30.8mg、0.0818mmol)、DIPEA(85μL、0.491mmol)和DMAP(3.1mg)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，加入2－氯苯甲酰氯(12.4μL、0.0978mmol)，在室温下搅拌1.5小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶，20％→30％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(27.3mg、63％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.74(brs，1H，－CONH－)，7.94(d，1H，J＝8.2Hz)，7.83(d，1H，J＝7.6Hz)，7.47－7.41(m，3H)，7.37(ddd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.8Hz，J＝1.4Hz)，7.30(ddd，1H，J＝7.3Hz，J＝6.9Hz，J＝1.8Hz)，7.16(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝7.3Hz)，5.95－5.80(m，2H)，5.66(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.40(d，1H，HBn，J_gem＝12Hz)，5.36(d，1H，HBn’，J_gem＝12Hz)，5.31(d，1H，J＝17Hz)，5.26(d，1H，J＝17Hz)，5.22(d，1H，J＝11Hz)，5.16(d，1H，J＝11Hz)，4.63(d，1H，J＝6.0Hz)，4.58－4.49(m，2H)，4.49－4.39(m，1H)，2.67－2.50(m，2H)，2.44－2.30(m，1H)，2.18－2.04(m，1H).

(12)化合物22的合成

化合物22

使化合物21(27.3mg、0.0530mmol)和苯基硅烷(164μL、1.32mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，加入四(三苯基膦)钯(15.3mg、0.0132mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(11.1mg、54％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.81(d，1H，He，J_He－Hf＝7.3Hz)，7.53(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.49－7.48(m，2H，Hc，Hd)，7.41－7.34(m，3H，Hb，Hg，Hh)，7.29(dd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝J_Hb－Hc＝7.3Hz)，5.37(s，2H，HBn)，3.63(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.0Hz)，2.67(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝J_Hγ－Hβ＝7.3Hz)，2.18(td，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝7.3Hz，J_Hβ－Hα＝6.0Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ172.9，172.7，135.4，133.1，132.7，131.1，130.8，130.7，130.1，129.6，128.8，126.7，126.4，126.1，63.6，54.4，32.0，26.6；HRMS 413.08882(M+Na⁺).

(13)化合物23的合成

化合物23

使化合物12(32.2mg、0.0855mmol)、DIPEA(89μL、0.513mmol)和DMAP(3.2mg)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，加入3－硝基苯甲酰氯(14μL、0.103mmol)，在室温下搅拌3小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶，30％→50％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(37.8mg、84％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.90(brs，1H，－CONH－)，8.85(s，1H)，8.41(dd，1H，J＝8.0Hz，J＝2.3Hz)，8.36(d，1H，J＝7.8Hz)，7.91(d，1H，J＝7.8Hz)，7.65(dd，1H，J＝8.2Hz，J＝7.8Hz)，7.47(d，1H，J＝7.8Hz)，7.38(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.18(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝7.3Hz)，5.95－5.78(m，2H)，5.68(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.45(d，1H，HBn，J_gem＝12Hz)，5.40(d，1H，HBn’，J_gem＝12Hz)，5.31(d，1H，J＝17Hz)，5.25(d，1H，J＝17Hz)，5.23(d，1H，J＝11Hz)，5.15(d，1H，J＝11Hz)，4.63(d，1H，J＝6.0Hz)，4.56－4.40(m，2H)，2.67－2.51(m，2H)，2.44－2.30(m，1H)，2.22－2.05(m，1H).

(14)化合物24的合成

化合物24

使化合物23(36.9mg、0.0702mmol)和苯基硅烷(217μL、1.76mmol)溶解于脱水DMF(2mL)，加入四(三苯基膦)钯(20.3mg、0.0176mmol)，在室温下搅拌2小时。确认反应结束，将反应液直接利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(10.0mg、35％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ8.78(s，1H，He)，8.45(d，1H，Hh，J_Hh－Hg＝8.2Hz)，8.39(d，1H，Hf，J_Hf－_Hg＝7.6Hz)，7.75(dd，1H，Hg，J_Hg－Hh＝8.2Hz，J_Hg－Hf＝7.6Hz)，7.54(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.43－7.35(m，2H，Hc，Hd)，7.41－7.34(m，3H，Hb，Hg，Hh)，7.30(dd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝J_Hb－Hc＝7.3Hz)，5.43(s，2H，HBn)，3.60(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.0Hz)，2.66(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝J_Hγ－Hβ＝7.3Hz)，2.16(td，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝7.3Hz，J_Hβ－Hα＝6.0Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：no data；HRMS 424.11063(M+Na⁺).

(15)化合物25的合成

化合物25

使化合物12(37.3mg、0.0991mmol)、DIPEA(103μL、0.595mmol)和DMAP(3.7mg)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，加入2－硝基苯甲酰氯(16μL、0.119mmol)，在室温下搅拌1.5小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶、30％→50％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到白色固体的目标物(40.5mg、78％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.23(brs，1H，－CONH－)，7.91(d，1H，J＝7.8Hz)，7.74(d，1H，J＝8.0Hz)，7.71－7.60(m，2H)，7.38(dd，1H，J＝7.8Hz，J＝7.3Hz)，7.37(d，1H，J＝7.3Hz)，7.16(dd，1H，J＝7.3Hz，J＝7.3Hz)，5.95－5.80(m，2H)，5.69(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.38(d，1H，HBn，J_gem＝12Hz)，5.31(d，1H，HBn’，J_gem＝12Hz)，5.31(d，1H，J＝17Hz)，5.26(d，1H，J＝17Hz)，5.22(d，1H，J＝11Hz)，5.15(d，1H，J＝11Hz)，4.63(d，1H，J＝6.0Hz)，4.58－4.40(m，2H)，2.68－2.53(m，2H)，2.42－2.30(m，1H)，2.18－2.20(m，1H).

(16)化合物26的合成

化合物26

使化合物25(40.2mg、0.0765mmol)和苯基硅烷(236μL、1.91mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，加入四(三苯基膦)钯(22.1mg、0.0191mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，将反应液直接利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(7.2mg、23％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.94(d，1H，He，J_He－Hf＝7.8Hz)，7.82－7.69(m，3H，Hf，Hg，Hh)，7.46(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.3Hz)，7.42－7.33(m，2H，Hc，Hd)，7.27(dd，1H，Hb，J_Hb－Ha＝J_Hb－Hc＝7.3Hz)，5.34(s，2H，HBn)，3.63(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝5.3Hz)，2.69(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝J_Hγ－Hβ＝6.6Hz)，2.18(td，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝6.6Hz，J_Hβ－Hα＝5.3Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：173.0，172.6，165.3，135.5，133.0，132.3，130.2，129.8，129.0，126.9，126.4，126.1，123.8，64.4，54.4，32.0，26.5；HRMS 424.11207(M+Na⁺).

[实施例5]

(1)使用苄基位离去基团转化衍生物的酶识别能力的确认

接着，使用合成的苄基位离去基团转化衍生物和纯化酶在以下的条件下进行酶反应。

化合物终浓度：100μM

酶终浓度：10U/mL(GGT)

反应温度：37℃

使用GGT的酶反应

机种：1260Infinity(Agilent公司制)

柱：Poroshell 120、4.6×100mm(Agilent公司制)

流动相A：水(0.01M甲酸铵)

流动相B：80％乙腈/水(0.01M甲酸铵)

梯度：A/B：95/5→50/50、20分钟

将结果示于图12。图12从上方起分别表示原料的质量峰的0小时后、1小时后的色谱图、酶反应生成物的质量峰的0小时后、1小时后的色谱图。

根据图12的结果确认了具有酰基系离去基团的衍生物组虽然根据纯化GGT而速度不同，但释放氮杂醌甲基化物。

(2)使用苄基位离去基团转化衍生物的体外药效试验(CCK－8检测)

接着，对苄基位离去基团转化衍生物进行上述的CCK－8检测。将结果示于图13。

如图13所示，得到在离去基团为氟的模型化合物显示药效的25μM的浓度下，具有酰基系离去基团的衍生物均未显示抗肿瘤活性的结果。

苯环上取代基转化衍生物的合成

进而，作为GGT前药衍生物，进行在苯环上4、5位导入了取代基的以下的4种化合物的合成。通过导入甲基(供电子基团)和甲酯基(吸电子基团)，苯环的電子密度发生变化，所释放的氮杂醌甲基化物的反应性发生变化，因此，预测对细胞死亡也造成影响。

[合成实施例5]

通过以下的合成方案5来合成4位取代体。

(方案5)

(1)化合物27的合成

化合物27

使(S)－5－(叔丁氧基)－4－((叔丁氧基羰基)氨基)－5－氧代戊酸(347mg，1.14mmol)溶解于脱水DMF(10mL)，冷却至0℃。加入HATU(408mg，1.72mmol)和DIPEA(743μL，3.43mmol)，在0℃搅拌5分钟。接下来，加入甲基－4－氨基－3－(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲酸酯(405mg，1.37mmol)，升温至室温，进一步搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶，10％→20％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，以混合物的形式得到目标物(197mg)。使该混合物溶解于脱水THF(5mL)，加入TBAF(ca.1mol/L in THF，1mL，1.00mmol)和乙酸(46μL、0.678mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶，40％→60％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(39.9mg、2个步骤为6％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ9.16(brs，1H，－CONH－)，8.24(d，1H，J＝8.2Hz)，7.97(d，1H，J＝8.2Hz)，7.85(s，1H)，5.31(brd，1H，－OCONH－，J＝7.3Hz)，4.84－4.64(m，2H，HBn)，4.27－4.15(m，1H)，3.88(s，3H，ArCOOCH₃)，3.26－3.18(m，1H，CH₂OH)，2.36－2.22(m，1H)，2.03－1.88(m，1H)，1.45(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.41(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(2)化合物28的合成

化合物28

使化合物27(38.6mg，0.0824mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，冷却至0℃。加入DAST(54μL、0.412mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶，20％→60％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(25.9mg、67％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.48(brs，1H，－CONH－)，8.23(d，1H，J＝8.2Hz)，8.07(d，1H，J＝8.2Hz)，7.99(s，1H)，5.70－5.38(m，2H，HBn)，5.30(brs，1H，－OCONH－)，4.28－4.18(m，1H)，3.91(s，3H，ArCOOCH₃)，2.62－2.42(m，2H)，2.40－2.26(m，1H)，2.20－1.82(m，1H)，1.46(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.44(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(3)化合物29的合成

化合物29

使化合物28(29.5mg、0.0553mmol)溶解于4M.盐酸/乙酸乙酯(2mL)，在室温下搅拌12小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(0％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(11mg、64％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ8.09(s，1H，Ha)，7.99(d，1H，Hb，J_Hb－Hc＝8.7Hz)，7.66(d，1H，Hb，J_Hb－Hc＝8.7Hz)，5.44(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz)，4.06(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.4Hz)，3.89(s，3H，ArCOOCH₃)，2.76(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝6.9Hz)，2.25(tt，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝6.9Hz，J_Hβ－Hα＝6.4Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ173.1，171.4，167.7，140.7，131.9，131.4，131.0，128.7，126.0，82.2(d，CH₂F，J_C－F＝164Hz)，53.4，52.7，32.7，26.8；HRMS 335.10105(M+Na⁺).

[合成实施例6]

通过以下的合成方案6来合成4位取代体。

(方案6)

(1)化合物30的合成

化合物30

使(S)－5－(叔丁氧基)－4－((叔丁氧基羰基)氨基)－5－氧代戊酸(811mg、2.67mmol)溶解于脱水DMF(20mL)，冷却至0℃。加入HATU(952mg、4.01mmol)和DIPEA(174μL、8.02mmol)，在0℃搅拌5分钟。接下来，加入2－(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)－4－甲基苯胺(807mg、3.21mmol)，升温至室温，进一步搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、10％→20％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(1.31g，91％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.78(brs，1H，－CONH－)，8.00(d，1H，J＝7.8Hz)，7.09(d，1H，J＝7.8Hz)，6.91(s，1H)，5.21(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，4.70(d，1H，HBn，J_gem＝13Hz)，4.67(d，1H，HBn’，J_gem＝13Hz)，4.28－4.14(m，1H)，2.52－2.33(m，2H)，2.32－2.18(m，1H)，2.29(s，3H，ArCH₃)，2.06－1.92(m，1H)，1.46(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.42(s，9H，NHCOO(CH₃)₃)，0.90(s，9H，Si(CH₃)₃)，0.08(s，6H，Si(CH₃)₂).

(2)化合物31的合成

化合物31

使化合物30(1.31g、2.43mmol)溶解于脱水THF(14mL)，加入TBAF(ca.1mol/L inTHF、7.3mL、7.3mmol)和乙酸(329μL、4.87mmol)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、40％→60％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(1.03g、定量的)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.75(brs，1H，－CONH－)，7.68(d，1H，J＝7.8Hz)，7.07(d，1H，J＝7.8Hz)，7.01(s，1H)，5.36(brd，1H，－OCONH－，J＝8.2Hz)，4.60(d，1H，HBn，J_gem＝13Hz)，4.54(d，1H，HBn’，J_gem＝13Hz)，4.22－4.10(m，1H)，2.48－2.32(m，2H)，2.32－2.06(m，1H)，2.27(s，3H，ArCH₃)，2.20－1.82(m，1H)，1.44(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.40(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(3)化合物32的合成

化合物32

使化合物31(476mg、1.13mmol)溶解于脱水二氯甲烷(10mL)，冷却至0℃。加入DAST(738μL、5.63mmol)，搅拌1小时。确认反应结束，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、20％→30％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(129mg、27％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.14(brs，1H，－CONH－)，7.68(d，1H，J＝8.2Hz)，7.17(d，1H，J＝8.2Hz)，7.12(s，1H)，5.38(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz，J_gem＝11Hz)，5.30(brd，1H，－OCONH－，J＝6.0Hz)，4.32－4.16(m，1H)，2.56－2.36(m，2H)，2.36－2.20(m，1H)，2.31(s，3H，ArCH₃)，2.20－1.84(m，1H)，1.45(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.43(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(4)化合物33的合成

化合物33

使化合物32(38.5mg、0.0907mmol)溶解于4M.盐酸/乙酸乙酯(1mL)，在室温下搅拌12小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(0％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(7.5mg、31％)。

¹H NMR(CD₂Cl₂，400MHz)：δ7.26(s，1H)，7.23(d，1H，Hc，J_Hc－Hb＝7.8Hz)，7.17(d，1H，Hb，J_Hb－Hc＝7.8Hz)，5.32(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz)，3.62(t，1H，Hα，J_Ha－Hβ＝6.0Hz)，2.63(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hβ＝7.3Hz)，2.33(s，3H，ArCH₃)，2.22－2.10(m，2H，Hβ)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ174.2，173.6，137.7，133.6，132.8，130.8，130.2，127.2，82.5(d，CH₂F，J_C－F＝163Hz)，55.4，33.2，27.8，21.0；HRMS269.13277(M+H⁺).

[合成实施例7]

接下来，通过以下的方案7来进行5位取代体的合成。

(方案7)

(1)化合物34的合成

化合物34

使(S)－5－(叔丁氧基)－4－((叔丁氧基羰基)氨基)－5－氧代戊酸(170mg、0.560mmol)溶解于脱水DMF(6mL)，冷却至0℃。加入HATU(200mg、0.840mmol)和DIPEA(364μL，1.68mmol)，在0℃搅拌5分钟。接下来，加入甲基－3－氨基－4－(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)苯甲酸酯(198mg、0.672mmol)，升温至室温，进一步搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶，20％→40％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(199mg、61％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.93(brs，1H，－CONH－)，8.77(s，1H)，7.73(d，1H，J＝7.8Hz)，7.20(d，1H，J＝7.8Hz)，5.20(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，4.78(d，1H，HBn，J_gem＝13Hz)，4.74(d，1H，HBn’，J_gem＝13Hz)，4.26－4.16(m，1H)，3.88(s，3H，ArCOOCH₃)，2.53－2.34(m，2H)，2.34－2.20(m，1H)，2.06－1.90(m，1H)，1.45(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.41(s，9H，NHCOO(CH₃)₃)，0.90(s，9H，Si(CH₃)₃)，0.08(s，6H，Si(CH₃)₂).

(2)化合物35的合成

化合物35

使化合物34(199mg、0.343mmol)溶解于脱水THF(10mL)，加入TBAF(ca.1mol/L inTHF、1.03mL、1.03mmol)和乙酸(42μL、0.687mmol)，在室温下搅拌2小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、40％→60％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(116mg、73％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.96(brs，1H，－CONH－)，8.55(d，1H，J＝8.2Hz)，7.75(d，1H，J＝7.8Hz)，7.29(d，1H，J＝7.8Hz)，5.34(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，4.74(dd，1H，HBn，J_gem＝13Hz，J＝6.0Hz)，4.67(dd，1H，HBn’，J_gem＝13Hz，J＝5.5Hz)，4.26－4.12(m，1H)，3.88(s，3H，ArCOOCH₃)，3.51(dd，1H，CH₂OH，J＝6.0Hz，J＝5.5Hz)，2.54－2.38(m，2H)，2.34－2.20(m，1H)，2.01－1.84(m，1H)，1.45(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.41(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(3)化合物36的合成

化合物36

使化合物35(110mg、0.236mmol)溶解于脱水二氯甲烷(10mL)，冷却至0℃。加入Fluolead(注册商标)(119mg、0.472mmol)，搅拌1.5小时。确认反应结束，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷进行2次萃取。二氯甲烷层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶，20％→40％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(43.6mg、39％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.47(brs，1H，－CONH－)，8.45(s，1H)，7.85(d，1H，J＝8.2Hz)，7.43(d，1H，J＝8.2Hz)，5.48(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz，J_gem＝12Hz)，5.33(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，4.28－4.17(m，1H)，3.90(s，3H，ArCOOCH₃)，2.57－2.40(m，2H)，2.35－2.22(m，1H)，1.97－1.82(m，1H)，1.45(s，9H，COO(CH₃)₃)，1.43(s，9H，NHCOO(CH₃)₃).

(4)化合物37的合成

化合物37

使化合物36(43.6mg、0.0931mmol)溶解于4M.盐酸/乙酸乙酯(10mL)，在室温下搅拌12小时。确认反应结束，进行反应液的浓缩。残渣利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(19.4mg、60％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ8.04(s，1H，Hc)，7.91(d，1H，Hb，J_Hb－Ha＝7.8Hz)，7.56(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.8Hz)，5.44(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz)，4.07(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.4Hz)，2.75(t，2H，Hγ，J_Hγ－Hα＝7.3Hz)，2.26(tt，2H，Hβ，J_Hβ－Hγ＝7.3Hz，J_Hβ－Hα＝6.4Hz)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ172.0，170.2，166.3，136.5，134.6，130.7，127.8，126.9，126.6，80.7(d，CH₂F，J_C－F＝165Hz)，52.1，51.5，31.1，25.6；HRMS 313.11879(M+H⁺).

[合成实施例8]

进而，通过以下的方案8来进行5位取代体的合成。

(方案8)

(1)化合物38的合成

化合物38

使(S)－5－(烯丙氧基)－4－(((烯丙氧基)羰基)氨基)－5－氧代戊酸(63.0mg、0.232mmol)溶解于脱水DMF(5mL)，冷却至0℃。加入HATU(83.0mg、0.348mmol)和DIPEA(151μL、0.697mmol)，在0℃搅拌5分钟。接下来，加入2－(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)－5－甲基苯胺(70mg、0.279mmol)，升温至室温，进一步搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(34g硅胶、20％→30％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(59.0mg、50％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.80(brs，1H，－CONH－)，7.93(s，1H)，6.89(d，1H，J＝7.6Hz)，6.76(d，1H，J＝7.6Hz)，5.90－5.70(m，2H)，5.56(brd，1H，－OCONH－，J＝8.0Hz)，5.28－5.10(m，4H)，4.62(s，2H，HBn)，4.58－4.40(m，4H)，4.40－4.30(m，1H)，2.51－2.30(m，2H)，2.36－2.21(m，1H)，2.26(s，3H，ArCH₃)，2.13－1.95(m，1H)，0.83(s，9H，Si(CH₃)₃)，0.00(s，6H，Si(CH₃)₂).

(2)化合物39的合成

化合物39

使化合物39(59.0mg、0.117mmol)溶解于脱水THF(3mL)，加入TBAF(ca.1mol/L inTHF，351μL、0.351mmol)和乙酸(16μL、0.234mmol)，在室温下搅拌12小时。确认反应结束，加入水，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用水和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶，40％→60％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到无色液体的目标物(32.6mg、71％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ8.68(brs，1H，－CONH－)，7.80(s，1H)，7.06(d，1H，J＝7.8Hz)，6.88(d，1H，J＝7.8Hz)，5.96－5.80(m，2H)，5.66(brd，1H，－OCONH－，J＝7.8Hz)，5.36－5.14(m，4H)，4.71－4.35(m，8H)，2.87(brs，1H，CH₂OH)，2.55－2.41(m，2H)，2.39－2.27(m，1H)，2.32(s，3H，ArCH₃)，2.14－1.97(m，1H).

(3)化合物40的合成

化合物40

使化合物39(32.6mg、0.0835mmol)溶解于脱水二氯甲烷(2mL)，冷却至0℃。加入DAST(55μL、0.417mmol)，搅拌3小时。确认反应结束，加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯进行2次萃取。乙酸乙酯层用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行清洗，用硫酸钠使其干燥后进行浓缩。残渣利用硅胶色谱(14g硅胶、20％→40％乙酸乙酯/己烷)进行纯化，得到浅黄色液体的目标物(10.3mg，31％)。

¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ7.77(s，1H)，7.17(d，1H，J＝7.3Hz)，6.96(d，1H，J＝7.3Hz)，5.97－5.82(m，2H)，5.57(brd，1H，－OCONH－，J＝6.9Hz)，5.40(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz，J_gem＝11Hz)，5.36－5.17(m，4H)，4.65(d，2H，J＝5.5Hz)，4.59－4.42(m，3H)，2.59－2.42(m，2H)，2.45－2.27(m，1H)，2.36(s，3H，ArCH₃)，2.15－2.00(m，1H).

(4)化合物41的合成

化合物41

使化合物40(10.3mg、0.0262mmol)和苯基硅烷(33μL、0.262mmol)溶解于脱水二氯甲烷(1mL)，四(三苯基膦)钯(7.6mg、25mol％)，在室温下搅拌1小时。确认反应结束，将反应液直接利用反相HPLC(20％→100％乙腈/水)进行纯化，得到白色固体的目标物(3.1mg、44％)。

¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ7.31(d，1H，Hb，J_Hb－Ha＝7.8Hz)，7.22(s，1H，Hc)，7.09(d，1H，Ha，J_Ha－Hb＝7.8Hz)，5.32(d，2H，HBn，J_HBn－F＝48Hz)，3.65(t，1H，Hα，J_Hα－Hβ＝6.0Hz)，2.71－2.59(m，2H，Hγ)，2.32(s，3H，ArCH₃)，2.23－2.10(m，2H，Hβ)；¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ172.0，170.1，139.4，134.8，130.0，128.7，127.0，126.4，81.1(d，CH₂F，J_C－F＝163Hz)，52.3，31.2，25.7，19.8；HRMS291.08980(M+Na⁺).

[实施例6]

苯环上取代基转化衍生物的体外药效评价

将4位取代衍生物的CCK－8检测的结果示于图14。发现取代有供电子基团的衍生物显示相对强的抗肿瘤活性的趋势。

将5位取代衍生物的CCK－8检测的结果示于图15。相当于离去基团的对位的5位的取代基效果比4位强，5－COOMe、5－H、5－Me的药效的差异变得更显著。另外，将关于5－COOMe衍生物的基于GGT低表达细胞的药效评价示于图15的下段。

如以上所示，本发明的前药型抗癌剂以如下的机制来显示抗肿瘤效果：在利用高表达GGT的癌细胞膜上的GGT将L－谷氨酸部切断的同时，释放具有氮杂醌甲基化物结构的高反应性物质(毒性诱发物质)。通过使用GGT高表达/低表达细胞株的共培养成像确认药效，结果本发明的前药型抗癌剂能够在不杀灭相邻的GGT低表达细胞的情况下仅选择性地杀灭GGT高表达细胞株。其结果启示本发明的前药型抗癌剂即使在体内也显示宽安全域的可能性。

[实施例7]

gGlu－FMA(化合物3)对腹膜接种模型小鼠的给药试验

(1)关于腹膜接种

腹膜接种是指将肿瘤细胞散布于覆盖腹膜内的腹膜的表面，并生长的状态。在临床中，从胃癌·大肠癌、卵巣癌等转移来的情况较多，尚未确立包括化学疗法在内的划时代的治疗方法。

(2)模型小鼠制作和试验概要

腹膜接种的模型小鼠通过向腹腔内将悬浮于PBS的SHIN3细胞(来自卵巣癌的癌细胞株，高GGT活性)进行腹腔内给予来制作。从细胞接种后第7天向腹腔内连日给予5mg/kg的gGlu－FMA或PBS(对照)，在细胞接种后第21天腹腔内给予gGlu－HMRG，在10分钟后将小鼠处死，开腹后利用体内成像装置maestro进行荧光图像的取得(图16)。

(3)结果

图17示出PBS和gGlu－FMA给予小鼠的肠系膜的宏观画像和其荧光图像2个例子。宏观图像和荧光图像均可见gGlu－FMA给予小鼠的肿瘤整体减少。

[产业上的可利用性]

本发明的前药型抗癌剂能够识别邻近的2个细胞间的代谢酶活性的不同而仅杀灭酶活性亢进的癌细胞，可期待成为能够改善因严重的副作用所致的患者的QOL降低这样的癌症化学疗法中的大问题的革新性的临床药剂。进而，未使用现有的抗癌剂的氮杂醌甲基化物释放型的本发明的前药能够简便地合成，因此，可期待对开发成本也带来较大贡献。如此，认为开发的前药在医疗上、产业上的利用价值、经济价值极大。