超分子核壳复合物、超分子载药核壳复合物、二者的制备方法和应用
阅读说明：本技术 超分子核壳复合物、超分子载药核壳复合物、二者的制备方法和应用 (Supramolecular core-shell compound, supramolecular drug-loaded core-shell compound, and preparation methods and applications of supramolecular core-shell compound and supramolecular drug-loaded core-s) 是由 韩杰 王自遥 孙晓环 郭荣 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种超分子核壳复合物及其制备方法、超分子载药核壳复合物及其制备方法和应用,以水溶性柱[5]芳烃(WP5)作为主体,聚乙二醇链段修饰的两亲性苯胺四聚体(TAPEG)为客体分子,通过主体与客体之间的主客体识别相互作用,自组装形成一种具有光热性能的超分子核壳复合物。本案超分子核壳复合物的核心疏水,壳层亲水,生物相容性好,疏水核心负载抗癌药物阿霉素(DOX),在肿瘤细胞的微酸条件下,结构崩解,药物释放出来从而起到化疗治疗的效果；构建的超分子核壳复合物光热性能较佳,在近红外二区的低激光功率密度(1.0W/cm～(2))照射下,实现了化学-光热联合肿瘤治疗,在临床上具有很好的应用前景。(The invention discloses a supramolecular core-shell compound, a preparation method thereof, a supramolecular drug-loaded core-shell compound, a preparation method and application thereof, wherein a water-soluble column [5]]Aromatic hydrocarbon (WP5) is used as a host, amphiphilic aniline Tetramer (TAPEG) modified by polyethylene glycol chain segments is used as a guest molecule, and the host-guest recognition interaction between the host and the guest is utilized to form the supramolecular core-shell complex with photo-thermal properties through self-assembly. Supermolecule core-shell composite in schemeThe core of the product is hydrophobic, the shell layer is hydrophilic, the biocompatibility is good, the hydrophobic core is loaded with anticancer drug adriamycin (DOX), under the condition of micro acid of tumor cells, the structure is disintegrated, and the drug is released, thereby achieving the effect of chemotherapy treatment; the constructed supramolecular core-shell compound has better photo-thermal performance and low laser power density (1.0W/cm) in a near-infrared two-region 2 ) Under irradiation, the chemical-photothermal combined tumor treatment is realized, and the application prospect is good in clinic.)
技术领域
本发明属于纳米医药
技术领域
，具体涉及超分子核壳复合物、超分子载 药核壳复合物、二者的制备方法和应用。背景技术
当代社会，由于各种外源性和内源性因素，恶性肿瘤越来越严重危害人 类生命健康。对于恶性肿瘤的治疗手段仍然是以手术治疗，放射治疗，化学 药物治疗为主，但传统药物治疗由于药物靶向性较差在治疗恶性肿瘤的同时 也给人体带来不可避免的副作用。具有pH刺激响应性的超分子核壳复合物 可以把抗癌药物包载在其核心，到肿瘤的酸性微环境中释放出来，从而减少 药物的毒副作用。光热治疗作为近些年新兴的治疗方法，利用激光照射肿瘤 区域使其局部高温使癌细胞受热坏死，不伤及正常组织，具有明显优势。第 二红外光区生物窗(1064nm)的激光具有更大的允许暴露量，能量更低，穿透 力更强。通过将化学药物治疗与光热治疗结合起来，即联合治疗，可以减少 抗癌药物的使用以减小毒副作用并且增加疗效。
申请人在之前的工作(CN110934830A)中利用十羧酸钠修饰的柱[5]芳 烃(WP5)与苯胺四聚体(G)之间的主客体作用，以WP5提供的一个疏水 空腔将G包含在疏水的WP5空腔中，从而构建出了一种超分子囊泡。囊泡 具有双分子层结构，用其负载抗癌药物阿霉素(DOX)，能在肿瘤环境中快速 释放。在近红外激光的照射下，可以作为肿瘤光热治疗剂，协同治疗肿瘤。 但是构建超分子囊泡的客体分子G水溶性较差，在水中溶解度较低，因此在制备超分子囊泡过程中需要借助有机溶剂，制备过程略繁琐。且超分子囊泡 虽然探索了在近红外二区的光热疗效，但仍然使用了高激光功率密度(3.0 W/cm2)。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种超分子核壳结构的复合 物，其具有良好的生物相容性，可利用疏水核负载阿霉素，在近红外二区的 低激光功率密度下就可实现对肿瘤的清除。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，提供一种超分子核壳复合物的制备方法，包括：
将十羧酸钠修饰的柱[5]芳烃溶于水中，用缓冲溶液将pH调至5～7，得 十羧酸钠修饰的柱[5]芳烃的水溶液；
取两亲性苯胺四聚体溶于所述柱[5]芳烃的水溶液，超声使其充分混合， 用缓冲溶液将混合溶液pH调至7～8，即得超分子核壳复合物水溶液；其中， 所述两亲性苯胺四聚体具有如下分子结构式： 其中，n为8～16的整数。
在上述方案中，所述两亲性苯胺四聚体与十羧酸钠修饰的柱[5]芳烃的摩 尔比优选为1:1。
第二方面，提供一种如上所述的制备方法制得的超分子核壳复合物水溶 液。
第三方面，提供一种超分子载药核壳复合物的制备方法，取设定量的抗 癌药物加入如上所述的超分子核壳复合物水溶液中，机械搅拌使抗癌药物载 入超分子核壳复合物的疏水核心，得到超分子载药核壳复合物溶液，通过透 析法除去未包载的抗癌药物，即得。
在上述方案中，所述抗癌药物优选为阿霉素。
在上述方案中，所述抗癌药物与超分子核壳复合物摩尔比优选为1：2。
第四方面，提供一种如上所述的制备方法制得的超分子载药核壳复合物。
本发明进一步提供一种如上所述的超分子载药核壳复合物在制备抗肿瘤 药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明制得的复合物组装结构为超分子核壳结构，有效增加了其水溶 性，同时也保留了苯胺四聚体的疏水特性，在制备过程中直接借助于水溶液 即可得到超分子复合物，减少了有机溶剂的使用；由于具有良好的生物相容 性，不容易被免疫系统清除，因此核壳组装体血液循环时间长，在肿瘤部分 的富集作用增强；超分子核壳复合物在较低的激光功率密度1.0W/cm2下具有 较高的光热转换效率η＝60.16％，具有光热转换能力，无毒副作用。
2、利用超分子核壳复合物的疏水核可以高效包载抗癌药物，该超分子核 壳复合物在人体正常生理pH下形貌稳定，但在肿瘤微酸性环境下核壳结构 崩解成小的胶束，药物从核中释放出来；由此将化学药物治疗和光热治疗结 合，两者具有协同作用，联合疗法对肿瘤治疗效果更佳。其突破了目前光热 材料大多局限在近红外一区激光和近红外二区高激光密度照射下的现状，实 现了在近红外二区低激光密度下对肿瘤的有效治疗，近红外二区激光具有穿 透力强，能量低等优势，具有很好的临床应用和前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面 将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而 易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术 人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的 附图。
图1为本发明实施例1超分子核壳复合物的TEM图。
图2为本发明实施例1不同pH超分子核壳复合物与TAPEG在相同功率 密度1064nm激光照射下的升温曲线图。
图3为超分子囊泡不同激光密度下的升温曲线图。
图4为超分子核壳复合物与超分子囊泡的光热性能表征图(a、1.0W/cm2激光功率密度下一个冷却周期的光热曲线图；b、a图的冷却时 间与热驱动常数(θ)的自然对数的负值点线图；c、3.0W/cm2激光功率密度下 一个冷却周期的光热曲线图；d、c图的冷却时间与热驱动常数(θ)的 自然对数的负值点线图)。
图5为超分子核壳复合物在不同TAPEG的相对浓度下，对正常细胞(L02) 和小鼠结肠癌细胞(CT26)的毒性实验结果图。
图6为超分子载药核壳复合物的共聚焦荧光显微镜图。
图7为超分子载药核壳复合物在不同pH及1064nm激光照射条件下的 药物释放曲线图。
图8为超分子载药核壳复合物用1064nm激光照射10分钟(1.0W/cm2) 的小鼠肿瘤部位的红外热像图。
图9为实施例3中治疗期间各组小鼠的相对肿瘤体积随时间的变化趋势 图。
图10为实施例3中治疗期间各组小鼠的体重随时间的变化趋势图。
图11为实施例3中治疗结束后各组小鼠肿瘤成像及小鼠活体成像结果 图。
图12为实施例3中治疗结束后各组小鼠肿瘤质量结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中 的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有 其他实施例，都属于本发明保护的范围。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此 之间未构成冲突就可以相互结合。
本案中所用化学试剂如无特殊说明均可通过市场购得，其中，十羧酸钠 修饰的柱[5]芳烃(WP5)依据文献J.Am.Chem.Soc.2013,135,4,1570–1576. 制得。聚乙二醇修饰的两亲性苯胺四聚体(TAPEG)的制备方法如下：
在氩气保护下，0℃，向NaH(0.43g，60％在矿物油中，107.4mmol) 的无水THF(20mL)悬浮液加入含有聚乙二醇单甲醚(MW＝550,3.938g,7.16 mmol)在THF(8mL)中的溶液，0℃下搅拌30min；加入溴乙酸叔丁酯(4.19 g，2.148mmol)，在25℃搅拌24小时；随后用水猝灭，所得混合物用乙酸乙 酯萃取，合并有机层用无水硫酸钠干燥，真空浓缩，通过硅胶快速色谱纯化 (DCM∶MeOH＝20∶1)，得到淡黄色产物。
取上述淡黄色产物(1.2g，1.85mmol)、苯甲醚(0.4mL，3.69mmol)和三 氟乙酸(2.75mL，37.01mmol)在DCM(15mL)中的溶液，25℃下搅拌4h。真 空浓缩后，将残余物溶解在乙醚中，水洗，收集水层用DCM萃取，合并有 机层用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，得到无色油状物。
取0.5mmol无色油状物产物溶于10mL二氯甲烷，氩气保护，加入催化 量的DMF,0℃下加入0.2ml(2.5mmol)草酰氯，搅拌半小时后撤去冰浴，室 温下搅拌0.5h，回流0.5h后冷却至室温，真空旋转蒸干，再溶解于二氯甲烷 中，真空浓缩，重复三次。将苯胺四聚体(0.183g,0.5mmol)溶于二氯甲烷(10 mL)，0℃下加N,N-二异丙基乙胺(0.2mL,1mmol)向其中滴加上一步所得 无色油状产物，搅拌半小时，撤去冰浴搅拌过夜。所得混合物用水萃取(10mL， 3次)。将合并的有机层用无水硫酸钠干燥，真空浓缩，通过硅胶快速色谱纯 化(DCM∶MeOH＝20∶1)，得到紫色油状物，即聚乙二醇修饰的两亲性苯胺 四聚体，分子式为
实施例1：超分子核壳复合物的制备
将7.6mg WP5用10mL超纯水溶解于样品瓶中，加入缓冲溶液将其pH 调至6.8。取5.0mg TAPEG直接加入到上述WP5的水溶液中，超声10min 使其充分混合，加入PBS缓冲溶液最终将其pH调至7.4，得到超分子核壳复合物的水溶液。
1-1、超分子核壳复合物的微观结构
通过透射电子显微镜照片，如图1所示，可以看出的聚集 体为规则的核壳结构，TAPEG的苯胺四聚体部分进入WP5的疏水空腔微环 境得到主客体复合物，所得复合物由于两端亲水，中间疏水，具有bola型表 面活性剂特征，复合物表面活性剂可在一定条件下形成胶束，所得胶束由于 TAPEG的苯胺四聚体部分的强π-π堆积作用以及疏水作用会以多胶束聚集的 机理进一步堆积为较大尺寸的组装体。在多胶束聚集过程中，由于胶束在组 装体内部堆积紧密，可形成一个大疏水核区，而组装体外部由于靠近水层会 有水分子嵌入，因此胶束之间堆积松散，所以呈现出壳层结构。即本案通过 对苯胺四聚体分子接枝聚乙二醇链段，有效增加了其水溶性，同时也保留了 苯胺四聚体的疏水特性，在制备过程中直接借助于水溶液即可得到超分子复 合物，减少了有机溶剂的使用。
核壳组装体的构建使得苯胺四聚体片段处于双重疏水环境，具体表现为： 1、由于主客体作用，TAPEG的苯胺四聚体部分嵌入WP5的疏水空腔；2、 两亲性苯胺四聚体TAPEG与十羧酸钠修饰柱[5]芳烃WP5形成的复合物 紧密堆积形成疏水性核心；这种双重疏水环境的构建使得 TAPEG自由基稳定性及相应的光热转化效率增强，因此低激光功率密度下具 有较高的光热转换效率。
1-2、超分子核壳复合物的光热性能
按照上述制备方法，最后利用PBS缓冲溶液将水溶液的pH调至7.4，6.5 以及5.5，分别在比色皿中加入3mL上述制备的三种不同pH值的超分子核 壳复合物溶液，用1064nm激光器照射比色皿，激光功率密度为1.0W/cm2， 利用热电偶温度计测量10min内温度变化。如图2所示，激光照射10min 内，超分子核壳溶液温度明显升高，且在酸性环境下，升温更加显著；说明 该超分子核壳复合物在近红外二区激光照下即使在较低的 激光功率密度下，光热性能也很好。图3为先前工作(CN110934830A)制得 的超分子囊泡在激光功率密度为1.0～3.0W/cm2下的升温曲线图， 对比下，在低激光功率密度1.0W/cm2下，超分子核壳聚合溶液温度升高更高。
比较用1064nm激光器照射(pH＝7.4)在1.0W/cm2激光 功率密度与(pH＝7.4)在3.0W/cm2激光功率密度下的光热转换效率 (η)。一个冷却周期的光热曲线分别如图4(a)和图4(c)，依据图4(a) 和图4(c)分别得到图(b)和(d)，从而计算得到(pH＝7.4) 在1.0W/cm2激光功率密度下的η＝60.16％，而(pH＝7.4)在3.0W/cm2激光功率密度下的η＝31.20％。这也进一步证实了本案核壳结构的超分子复合 物相比囊泡结构的超分子复合物在较低的激光功近红外率密度下仍具有更高 的光热转换效率，突破了目前光热材料大多局限在一区激光和近红外二区高 激光密度照射下的现状。
1-3超分子核壳复合物的细胞毒性分析
采用CCK-8法评价超分子核壳复合物和TAPEG的细胞毒性，将L02细 胞(人体肝细胞)和CT26细胞(小鼠结肠癌细胞)以每孔1×104个细胞的密 度接种在96孔板中，并在37℃、5％CO2培养24小时。然后，将细胞分别 与不同浓度(10、25、50、80、100μg/mL)的超分子核壳复合物和TAPEG (37℃，24小时)一起孵育。最后每孔加入CCK-8溶液，再孵育4h。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
如图5所示，由细胞毒性实验可见，即使在较高浓度下，人体正常细胞 L02的存活率依然很高，可以达到80％以上，而与鼠结肠癌细胞CT26孵育 后细胞死亡率较大。说明超分子核壳复合物对肿瘤的治疗具有靶向选择性毒 性，且对正常细胞生物相容性较好。
实施例2：超分子载药核壳复合物的制备
取10mL实施例1制备的超分子核壳复合物的水溶液 (pH＝7.4)，按照抗癌药物与超分子核壳复合物摩尔比为1：2的比例称取一 定量的阿霉素(DOX)，加入超分子核壳复合物溶液中，搅拌一天使其载入超 分子核壳复合物核内。用截留分子量为14000的透析袋将上述制备得到的超 分子载药核壳复合物溶液进行透析，去除未包进复合物内的药物，定时更换 透析袋外的水溶液，检测其荧光强度，直至透析袋外的溶液中检测不到DOX， 即得到超分子载药核壳复合物。
将发射红色荧光的疏水性阿霉素负载到所得核壳组装体后，通过激光共 聚焦显微镜(图6)，可看出疏水性阿霉素处于核心位置，从而进一步证实了 所得组装体的核心呈现疏水性，壳层呈现亲水性。
2-1超分子载药核壳复合物的载药性能
根据测得的荧光强度从DOX荧光发射特征峰592nm处的“荧光强度- 浓度”标准曲线(纯水：y＝2.005×108x+0.1507,x＝2.0×10-7～8.0×10-7mol/L) 算出透析出的游离的阿霉素总量，从而可以计算得出负载药物的载药率(负 载药物的质量/材料的质量)和包封率(负载药物的质量/药物投入总量)。最 终计算得到的载药率和包封率分别为12.0％和96.6％，说明该超分子核壳复 合物是抗癌药物阿霉素的良好载体。
2-2超分子载药核壳复合物的药物释放
1)不同pH条件下的药物释放行为
取3mL实施例2制备超分子载药核壳复合物水溶液加入透析袋，将其浸 入含有30mL PBS缓冲溶液的离心管中，PBS缓冲溶液选择pH＝7.4，pH＝ 6.5，pH＝5.5的0.1M磷酸缓冲盐水溶液，用以模拟人体正常生理环境、肿 瘤微酸性环境和细胞溶酶体pH环境。
将离心管放入恒温摇床(37℃；118rpm)进行震荡，每隔一定时间从离 心管中取出3mL溶液，使用荧光光谱仪测定DOX在592nm的荧光强度， 根据测得的荧光强度，从DOX荧光发射特征峰592nm处的“荧光强度-浓度” 标准曲线，三种pH值下的标准方程式分别为：
pH＝5.5:y＝2.414×108x-75.44；
pH＝6.5:y＝2.092×108x-80.62；
pH＝7.4:y＝1.844×108x-75.14；
其中，x＝2.0×10-7～1.0×10-5mol/L，算出释放药物浓度，进而进一步得 出化疗药物的释放率与时间的关系图(图7(a))，从图中可以看出相较于正 常生理条件，在酸性pH下，药物释放更快，释放量更大。
2)1064nm激光照射下药物的释放行为：
该实验在pH＝6.5的0.1M磷酸缓冲盐中进行，用1064nm的激光照射， 用以模拟对肿瘤部位的光热治疗。取3mL超分子载药核壳复合物水溶液加入 透析袋，将其浸入含有30mL PBS缓冲溶液(pH＝6.5)的离心管中。将离心 管放入恒温摇床(37℃；118rpm)震荡，再以1064nm的激光照射(持续照射15 min，暂停15min，循环2次后，持续照射30min，暂停30min，循环2次， 总时间4h)。每隔一定时间从离心管中取出3mL溶液，采用荧光光谱仪测定阿霉素(DOX)在592nm的紫外吸收强度，然后再倒回母液中继续震荡，根据 测得的荧光强度，592nm处的“荧光强度-浓度”标准曲线为y＝2.092×108 x-80.62(pH＝6.5)算出药物浓度，得出药物的释放率如图7(b)所示，可以 看出在1064nm激光照射条件下，药物释放速率与释放量都得到了提高。
实施例3：超分子载药核壳复合物对结肠癌小鼠的治疗
结肠癌细胞小鼠模型的建立：将100μL含有2×106个小鼠结肠癌细胞 (CT26)皮下注射到雄性Balb/c小鼠的腿部。当肿瘤生长体积达到大约100 mm3时，开始进行实验。
将小鼠随机分为5组(每组6只)：PBS；超分子核壳复合物；超分子载 药核壳复合物；超分子核壳复合物+1064nm激光；超分子载药核壳复合物 +1064nm激光。在第1、3、5、7、9、11、13天，通过尾静脉对小鼠注射材 料，并对小鼠称重并记录肿瘤体积。对于使用激光组的小鼠，在注射3小时 后用1064nm激光(1.0W/cm2)照射肿瘤部位，光照时间为10min/只，利用 红外热像仪，拍摄激光照射部位温度变化(图8)，超分子核壳复合物使小鼠 的肿瘤部位在激光照射下温度显著升高，10分钟内，肿瘤部位的温度分别从 约35℃迅速升高到54℃，这产生的热量足够杀死癌细胞。
每次治疗前测量并计算小鼠肿瘤体积相对变化，记录小鼠体重。小鼠肿 瘤生长趋势见图9，从图9中可以看出：
第一组(PBS)：小鼠肿瘤体积迅速并持续增大；
第二组(超分子核壳复合物)：与第一组相比，第二组的小鼠的肿瘤生长 受到轻微抑制；
第三组(超分子载药核壳复合物组)：由于抗癌药物的作用，抑制作用更 为明显，但小鼠的总体肿瘤体积仍呈增大趋势；
通过上述第一、二和三组实验表明载药核壳复合物在小鼠内发挥化疗效 果，但仅靠化疗难以根除肿瘤。
第四组(超分子核壳复合物+1064nm激光)：小鼠肿瘤在光热治疗下明 显缩小，并逐渐愈合，最终消失；
第五组(超分子载药核壳复合物+1064nm激光)：相比第四组，第五组 的小鼠肿瘤在光热治疗下治愈更加明显；
通过上述五组实验说明化学-光热联合治疗的肿瘤治疗效果最好。
图10为治疗过程中小鼠的体重变化趋势图，各组小鼠体重均无明显下 降，证明了本案材料与生物体具有良好的生物相容性。
第14天治疗终止，对小鼠肿瘤部位拍照，将小鼠处死，取出肿瘤清洗、 拍照并称重得到图11和图12。从图11中，可以直观地看到不同治疗14天后 肿瘤的大小和相应小鼠的照片；肿瘤质量称重结果与上述结论一致(图12)。
综上所述，本发明提供的超分子载药核壳复合物制备方法简单，生物相 容性较好，光热转换能力强，在化疗-光热联合抗癌治疗中对恶性肿瘤有显著 的治疗效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方 式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领 域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范 围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图 例。
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