阅读说明：本技术 含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用 (Phenylboronic acid modified high polymer material and application thereof in intracellular delivery of gene editing ribonucleoprotein complex ) 是由 程义云 平渊 万涛 刘崇懿 吕佳 于 2019-04-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种含苯硼酸修饰的高分子材料在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用,所述含苯硼酸修饰的高分子材料由阳离子聚合物和含苯硼酸的功能基团组成,所述含苯硼酸功能基团共价连接在阳离子聚合物上；所述阳离子高分子包括聚酰胺-胺树形高分子、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸等；所述含苯硼酸修饰的高分子材料可以作为基因编辑核糖核蛋白复合物的胞内递送载体,即将基因编辑核糖核蛋白复合物由细胞外递送到细胞内的载体。本发明提供的含苯硼酸修饰的高分子材料作为基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送载体的方法可以达到高效率,在同一细胞不同基因位点以及不同种类细胞均有较好的基因编辑效果,并且可以保持核糖核蛋白复合物的生物活性,同时对细胞产生的毒性小,具有良好的生物相容性。(The invention provides an application of a high molecular material modified by phenylboronic acid in intracellular delivery of a gene-editing ribonucleoprotein complex, wherein the high molecular material modified by the phenylboronic acid consists of a cationic polymer and a functional group containing the phenylboronic acid, and the functional group containing the phenylboronic acid is covalently connected to the cationic polymer; the cationic polymer comprises polyamide-amine dendrimer, polypropylene imine, polylysine and the like; the high molecular material modified by phenylboronic acid can be used as an intracellular delivery carrier of a gene-editing ribonucleoprotein complex, namely a carrier for delivering the gene-editing ribonucleoprotein complex from the outside to the inside of a cell. The method for using the phenylboronic acid modified high polymer material as the intracellular delivery carrier of the gene editing ribonucleoprotein complex can achieve high efficiency, has good gene editing effect on different gene sites and different types of cells of the same cell, can keep the bioactivity of the ribonucleoprotein complex, has low toxicity on the cell, and has good biocompatibility.)

含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合 物胞内递送中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术、高分子化学、细胞生物学等领域，具体涉及一种新的含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用。

背景技术

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats sequences,CRISPR)系统源于细菌和古细菌的自适应性免疫系统，其主要用来抵御来自于噬菌体、质粒等外源性核酸的入侵。而利用这种天然存在的免疫系统，CRISPR/Cas系统已经被开发成为一种新型的基因编辑技术，它能够定点靶向基因组的目标序列或者同时靶向基因组多个目标序列用于基因组编辑。该系统目前已经被广泛应用于基因相关疾病的治疗，定向检测基因组区域的活体成像，疾病相关新靶点的鉴定，基因功能的识别以及动物疾病模型建立等多方面的研究。在众多CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9作为最具有代表性的基因编辑系统，主要包含两个核心组分：CRISPR/Cas9核酸内切酶及单联导向RNA(single guided RNA,sgRNA)，自2013年以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术被成功应用于哺乳细胞基因组编辑，该技术已经应用一系列难治愈的疾病上，包括恶性肿瘤、镰刀形细胞贫血症、I-H型粘多糖病、阿尔兹海默症、肝糖原贮积症、血友病、囊性纤维化、杜式肌肉营养不良症及其他疾病。在基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术被应用于临床之前，除了需要提高基因编辑的特异性，降低脱靶和基因组突变率等复杂的技术挑战外。另一方面，如何安全有效地将CRISPR/Cas9基因编辑系统导入到特定的细胞、组织或者器官中以获得期望的治疗效果是另一个需要解决的关键性问题。但是由于目前能够高效安全递送CRISPR/Cas9的载体系统的匮乏，导致了CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床应用上的潜力受到极大的限制。因此开发高效低毒的CRISPR/Cas9的递送载体系统，对推动CRISPR/Cas9基因编辑技术向临床应用转化，降低毒副作用，提高治疗的安全性，具有极其重要的科学价值和研究意义。目前在体外或体内使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑通常有三种方式。第一种方式是将Cas9蛋白和sgRNA编码进同一个pDNA载体中进行基因组编辑。第二种方式是同时递送Cas9mRNA和sgRNA进行基因组编辑。第三种方式是使用Cas9核糖核蛋白复合物和sgRNA形成的复合物进行基因组编辑。这三种递送方案各有优缺点，并且各自面临着独特挑战。在这三种CRSPR-Cas9的递送形式中，最简单有效的方法就是递送Cas9蛋白和sgRNA形成的复合物。与递送基于质粒pDNA的模式相比，递送Cas9蛋白与sgRNA形成的复合物可以避免递送pDNA所引起的***基因组风险以及转录及翻译的过程。另一方面，由于pDNA长期存在于细胞中，会持续表达Cas9蛋白，从而导致Cas9蛋白长时间存在于细胞中进行基因编辑，这也会导致强烈的免疫应答和更高的脱靶效应。而与递送mRNA的模式相比，Cas9蛋白的递送除了可以避免mRNA的翻译过程，而且还可以免受细胞内的RNA的干扰。然而，由于Cas9蛋白的分子量较大与结构的复杂性，在被细胞摄取后溶酶体逃逸效率比较低，同时在运输和储存的过程中易被降解和失活，因而发展能够递送Cas9核糖核蛋白复合物的纳米载体面临着巨大的挑战。目前报道的用于Cas9蛋白递送的非病毒载体有阳离子聚合物，阳离子脂质体，类脂质衍生物，脂质体复合物，水凝胶纳米粒，金纳米粒，DNA纳米线球，金属有机框架以及超薄二维黑磷纳米片。其中，相比于众多的递送方式，高分子载体具有合成成本低、易进行化学修饰、容易实现内涵体逃逸、生物相容性好等优势，在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中具有广阔的应用前景。现有针对核糖核蛋白复合物的递送方法通常需要对核酸内切酶如Cas9进行化学修饰或生物改造，合成成本高，并且可能会破坏蛋白质原有的生物活性，不便于普及和应用。

发明内容

为了解决现有技术中高分子载体不能很好地结合核糖核蛋白复合物的问题，本发明创新地提供了一类含苯硼酸修饰的高分子材料作为核糖核蛋白复合物胞内递送的载体。这类载体胞内递送效率高，递送到细胞内的复合物仍具有生物活性。同时材料自身及递送操作过程对细胞产生的毒性小。

本发明提出利用含苯硼酸的阳离子高分子来实现核糖核蛋白复合物的高效递送。本发明中，一方面，苯硼酸分子能与核酸内切酶表面的阳离子基团如氨基、咪唑等在中性条件下形成氮-硼配位键；另一方面，高分子上的阳离子基团可以和复合物中的核酸以及蛋白质表面的负电荷区域通过静电相互作用结合，形成稳定的复合物。本发明用这一创新构思，设计合成了一类含有苯硼酸分子的阳离子高分子，进而获得高效、低毒的核糖核蛋白复合物递送载体。

本发明提供了一类含苯硼酸修饰的高分子材料，所述含苯硼酸修饰的高分子材料包括阳离子聚合物和含苯硼酸的功能基团，所述含苯硼酸的功能基团通过共价键连接在阳离子聚合物上。

所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构如式(1)～式(3)所示：

式(1)-式(3)中，

R₁为阳离子聚合物，

R₂为连接键，所述连接键包括-NH-CH₂-、-NH-、-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-O-、-NH-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝S)-NH-等；

R₃、R₄、R₅、R₆为化学官能团，分别独立地选自H、卤素、C1-C5烷基、C1-C5甲氧基、硝基等；优选地，R₃、R₄、R₅、R₆分别独立地选自H、F、Cl、Br、甲基、甲氧基、硝基；进一步优选地，R₃、R₄、R₅、R₆分别独立地选自H。

X为含苯硼酸功能基团的连接数，X为1-256之间的整数；优选地，X为42-128之间的整数；进一步优选地，X为42-84之间的整数。

其中，R₁包括但不局限于如式(4)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(5)所示的支化聚乙烯亚胺、如式(6)所示的线性聚乙烯亚胺、如式(7)所示的α-聚赖氨酸、如式(8)所示的ε-聚赖氨酸等；

式(4)中，n为1-10之间的整数；优选地，n为4-6之间的整数；进一步优选地，n＝5；

m为2-4之间的整数；优选地，m＝3或4；进一步优选地，m＝4；

M是聚酰胺-胺树形高分子的核心；所述核心为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺时，m＝4；所述核心为氨时，m＝3；所述核心为甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、正辛胺、正癸胺、正十二胺时，m＝2；优选地，核心为氨或乙二胺。

式(5)中，n为2-100之间的整数。

式(6)中，n为20-1500之间的整数。

式(7)中，n为20-1000之间的整数。

式(8)中，n为20-1000之间的整数。

优选地，所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构如式(1)-式(3)所示；所述阳离子聚合物的结构式如式(4)所示，其中，n为1-10之间的整数，m为2-4之间的整数，M为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺时，m＝4；核心为氨时，m＝3；核心为甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、正辛胺、正癸胺、正十二胺时，m＝2；连接键R₂为-NH-CH₂-；R₃、R₄、R₅、R₆分别独立地选自H、F、Cl、Br、甲基、甲氧基、硝基；X为1-256之间的整数。在具体实施方案中，所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构包括以下：

式(9)中，R1为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，X分别为：44,72，84，58和59；

式(10)中，R1为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，苯硼酸的平均连接条数X为61；

式(11)中，R1为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，苯硼酸的平均连接条数X为59；

式(12)中，R1为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸的平均连接条数为53；

式(13)中，R1为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，2-氟-4-甲酰基苯硼酸的平均连接条数为61；

式(14)中，R1为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，4-甲酰基-2-甲氧基苯基硼酸的平均连接条数为55。

本发明还提供了所述含苯硼酸修饰的高分子材料在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用。其中，所述含苯硼酸修饰的高分子材料如式(1)-式(3)所示，其作为核糖核蛋白复合物胞内递送的载体。优选地，所述基因编辑核糖核蛋白复合物为CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物。

本发明还提供一种基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送载体，所述载体包含如上所述的含苯硼酸修饰的高分子材料。

本发明还提供一种新的复合物，其包括如式(1)-式(3)所示的含苯硼酸修饰的高分子材料和核糖核蛋白复合物；其中，在该基因编辑核糖核蛋白复合物中，由所述高分子材料携带所述基因编辑核糖核蛋白复合物。

本发明还提供了所述含苯硼酸修饰的高分子材料、所述基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送载体、所述复合物在基因编辑和基因治疗中的应用。

本发明还提供了一种基因编辑核糖核蛋白复合物细胞内递送方法，利用本发明式(1)-式(3)所示的含苯硼酸修饰的高分子材料，实现在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送。

利用本发明分别在293T，293T-EGFP，HCT-116和HT-29等细胞系中递送基因编辑核糖核蛋白复合物编辑不同的基因。实验结果表明本发明具有以下优点：本发明提出的含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用、以及基因编辑核糖核蛋白复合物细胞内递送方法具有较高的胞内递送效率，效率远高于商业化转染试剂Lipofectamine CRISPRMAX^TM；本发明制备的材料可以高效递送CRISPR-Cas9蛋白至293T-EGFP细胞内编辑EGFP基因，远优于商业化试剂Lipofectamine CRISPRMAX^TM；本发明含苯硼酸修饰的高分子材料可以高效的递送CRISPR-Cas9蛋白至293T细胞内编辑AAVS1和HBB基因，远优于商业化试剂Lipofectamine CRISPRMAX^TM；本发明含苯硼酸修饰的高分子材料可以高效递送CRISPR-Cas9蛋白至HT-116和HT-29细胞内编辑AAVS1和HBB基因；本发明提出的基因编辑核糖核蛋白复合物递送载体在细胞内递送过程中可以达到高递送效率，制备成本低，材料细胞毒性小，能够有效且安全地将基因编辑核糖核蛋白复合物递送到细胞质中，不需要对蛋白质和多肽分子进行化学修饰。

附图说明

图1为实施例1中含苯硼酸修饰的高分子材料P4与基因编辑核糖核蛋白复合物形成复合物的动态光散射表征。

图2为实施例1中含苯硼酸修饰的高分子材料P4向293T-EGFP细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物编辑EGFP基因的效率，及其与商品化试剂Lipofectamine CRISPRMAX的比较。

图3为实施例1中含苯硼酸修饰的高分子材料P4向293T细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物编辑AAVS1以及HBB基因的效率，及其与商品化试剂LipofectamineCRISPRMAX的比较。

图4为实施例1中含苯硼酸修饰的高分子材料P4向HCT-116细胞内和HT-29细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物编辑AAVS1以及HBB基因的效率。

图5为实施例7中含苯硼酸修饰的高分子材料P7-P11的合成路线及载体结构图。

图6为实施例7中含苯硼酸修饰的高分子材料P12的合成路线及载体结构图。

图7为实施例7中含苯硼酸修饰的高分子材料P13的合成路线及载体结构图。

图8为实施例7中含苯硼酸修饰的高分子材料P14的合成路线及载体结构图。

图9为实施例1中含苯硼酸修饰的高分子材料P4和实施例7中含苯硼酸修饰的高分子材料P7向SW-480细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物编辑KRAS基因的效率。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：基于聚酰胺-胺树形高分子和含苯硼酸功能基团合成蛋白质、多肽胞内递送载体P1-P6。

在一个具体的实施例中，含苯硼酸修饰的高分子材料的制备方法为：将4-溴甲基苯硼酸与第5代聚酰-胺胺树形高分子按照不同的摩尔比(26:1,38:1,96:1,128:1)加入甲醇溶液中，70℃加热反应24小时，转移至透析袋后分别在甲醇和去离子水中充分透析，分离提纯即可得到产物，分别得到4种不同接枝率的苯硼酸修饰的树形高分子(如式(9)所示)。根据¹H NMR核磁谱表征苯硼酸在聚酰胺-胺树形高分子表面的连接效率，根据树形高分子和苯硼酸的积分面积计算平均每一个树形高分子表面连接的苯硼酸的数量。根据计算结果，苯硼酸的平均连接条数X分别为：14、24、42和60，分别命名为P1、P2、P3和P4。同样的合成和纯化方法，分别使用3-溴甲基苯硼酸(摩尔比96:1)、2-溴甲基苯硼酸(摩尔比96:1)与第5代聚酰胺-胺树形高分子反应，制备含苯硼酸高分子载体，经过¹H NMR计算得到的平均连接条数分别为61、59，产物分别命名为P5和P6，其化学结构分别如式(10)和式(11)所示。

式(9)中，R₁为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，X分别为：14、24、42和60,相应的产物分明命名为P1、P2、P3和P4。

式(10)中，R₁为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，苯硼酸的平均连接条数X为61,相应的产物命名为P5。

式(11)中，R₁为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，苯硼酸的平均连接条数X为59,相应的产物命名为P6。

实施例2：含苯硼酸修饰的树形高分子材料P1-P6的基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR-Cas9)胞内递送效率比较。

具体操作方法如下：首先通过体外转录的方法制备靶向AAVS1的sgRNA(sgAAVS1)(AAVS1的靶点为GGCTCCCTCCCAGGATCCTCTC)，并通过试管内切割目的基因PCR片段确定sgAAVS1的活性。将293T细胞接种到6孔板中过夜，待293T细胞密度达到80％以上时，开始蛋白质递送实验。首先将CRISPR-Cas9蛋白与sgAAVS1在37℃孵育10分钟后形成CRISPR-Cas9/sgAAVS1复合物，再将CRISPR-Cas9/sgAAVS1复合物分别与P1-P6这六个含苯硼酸修饰的树形高分子材料充分混合后，加入100μL无血清DMEM培养基，震荡混匀。CRISPR-Cas9的剂量为每孔4μg，sgAAVS1的剂量为每孔2μg，P1-P6这六个含苯硼酸修饰的树形高分子材料的剂量为每孔8μg。待室温孵育30分钟后，然后向混合溶液加入900μL无血清DMEM培养基。移除细胞培养基，使用PBS清洗两次后，加入含苯硼酸修饰的树形高分子材料/Cas9蛋白复合物的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。移除培养基，加入1mL含有10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时。使用商业化试剂盒提取基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段(AAVS1-FP:CTATGTCCACTTCAGGACAGCATGT,AAVS1-RP:CCTCTTGGGAAGTGTAAGGAAGCTG)，加热变性退火复性处理，最后加入0.3μL的T7E1核酸内切酶，37℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。

实验结果：初步的结果表明苯硼酸在树形高分子表面修饰的接枝率达到一定量时，才能获得理想的基因编辑效率。其中，P4具有最高的基因编辑核蛋白胞内递送效率。同时结果表明对位苯硼酸修饰的树形高分子具有最高的基因编辑核蛋白递送效率，间位苯硼酸修饰的树形高分子次之，而邻位苯硼酸修饰的树形高分子递送效果较低。

实施例3：制备含苯硼酸修饰的树形高分子材料P4与基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR-Cas9)的复合物，并利用动态光散射(DLS)表征复合物的尺寸及表面电势。

具体操作方法如下：将CRISPR-Cas9蛋白与P4溶液混合均匀，室温孵育30分钟，加入1mL去离子水稀释后，使用激光纳米粒度仪检测溶液中纳米颗粒的尺寸分布和表面电势。

实验结果：图1表示本发明制备的P4与CRISPR-Cas9蛋白形成的复合物DLS表征的尺寸分布、表面电势。结果表明，苯硼酸修饰的树形高分子材料P4能与CRISPR-Cas9蛋白形成300nm左右尺寸的纳米颗粒，并且颗粒的表面电势为正。

实施例4：含苯硼酸修饰的树形高分子材料P4向293T-EGFP细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR-Cas9)编辑EGFP基因。

具体操作方法如下：首先通过体外转录的方法制备靶向EGFP的sgRNA(sgEGFP)(EGFP的靶点为GTGAACCGCATCGAGCTGAA)，并通过体外切割目的基因PCR片段确定sgEGFP的活性。然后将293T-EGFP细胞接种到共聚焦皿中过夜，待293T-EGFP细胞密度达到80％以上时，开始蛋白质递送实验。首先将CRISPR-Cas9蛋白与sgEGFP在37℃孵育10分钟后形成CRISPR-Cas9/sgEGFP复合物，再将CRISPR-Cas9/sgEGFP复合物与P4充分混合后，加入100μL无血清DMEM培养基，震荡混匀。CRISPR-Cas9的剂量为每孔2μg，sgEGFP的剂量为每孔1μg，P4的剂量为每孔4μg。待室温孵育30分钟后，然后向混合溶液加入900μL无血清DMEM培养基。移除细胞培养基，使用PBS清洗两次后，加入含有P4/Cas9蛋白复合物的培养基溶液，37℃培养箱孵育4小时。移除培养基，加入1mL含有10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时。使用激光共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度和分布。使用流式细胞仪定量分析293T-EFP细胞的平均荧光强度。使用商业化试剂盒提取基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段(EGFP-FP:ATGGTGAGCAAGGGCGAG,EGFP-RP:TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC)，加热变性退火复性处理，最后加入0.3μL的T7E1核酸内切酶，37℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。

实验结果：图2为本发明制备的材料P4在293T-EGFP细胞上递送CRISPR-Cas9蛋白的激光共聚焦显微镜观察的细胞荧光图片(a)，流式细胞仪统计的细胞平均荧光强度(b)和T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率(c)。结果表明本发明制备的材料P4可以高效的递送CRISPR-Cas9蛋白至293T-EGFP细胞内编辑EGFP基因，远优于商业化试剂LipofectamineCRISPRMAX。

实施例5：含苯硼酸修饰的树形高分子材料P4向293T细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR-Cas9)编辑AAVS1和HBB基因。

具体操作方法如下：首先通过体外转录的方法制备靶向AAVS1和HBB的sgRNA(sgAAVS1和sgHBB)(AAVS1的靶点为GGCTCCCTCCCAGGATCCTCTC；HBB的靶点为GGGTAACGGCAGACTTCTCCTC)，并通过试管内切割目的基因PCR片段确定sgAAVS1和sgHBB的活性。将293T细胞接种到6孔板中过夜，待293T细胞密度达到80％以上时，开始蛋白质递送实验。首先将CRISPR-Cas9蛋白与sgAAVS1或者sgHBB在37℃孵育10分钟后形成CRISPR-Cas9/sgEGFP复合物，再将CRISPR-Cas9/sgEGFP复合物与P4充分混合后，加入100μL无血清DMEM培养基，震荡混匀。CRISPR-Cas9的剂量为每孔4μg，sgAAVS1和sgHBB的剂量为每孔2μg，P4的剂量为每孔8μg。待室温孵育30分钟后，然后向混合溶液加入900μL无血清DMEM培养基。移除细胞培养基，使用PBS清洗两次后，加入含有P4/Cas9蛋白复合物的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。移除培养基，加入1mL含有10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时。使用商业化试剂盒提取基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段

(AAVS1-FP:CTATGTCCACTTCAGGACAGCATGT,

AAVS1-RP:CCTCTTGGGAAGTGTAAGGAAGCTG；

HBB-FP:AACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAG,

HBB-RP:CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAGC)，

加热变性退火复性处理，最后加入0.3μL的T7E1核酸内切酶，37℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。

实验结果：图3为本发明制备的材料P4在293T细胞上递送CRISPR-Cas9蛋白编辑AAVS1基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率(a)，编辑HBB基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率(b)以及P4和商业化试剂LipofectamineCRISPRMAX在AAVS1和HBB基因上引起的平均indel突变率分析(c)。结果表明本发明制备的材料P4可以高效的递送CRISPR-Cas9蛋白至293T细胞内编辑AAVS1和HBB基因，远优于商业化试剂Lipofectamine CRISPRMAX。

实施例6：含苯硼酸修饰的树形高分子材料P4向HCT-116以及HT-29细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR-Cas9)编辑AAVS1和HBB基因。

具体操作方法如下：首先通过体外转录的方法制备靶向AAVS1和HBB的sgRNA(sgAAVS1和sgHBB)(AAVS1的靶点为GGCTCCCTCCCAGGATCCTCTC；HBB的靶点为GGGTAACGGCAGACTTCTCCTC)，并通过试管内切割目的基因PCR片段确定sgAAVS1和sgHBB的活性。将HCT-116和HT-29细胞接种到6孔板中过夜，待HCT-116和HT-29细胞密度达到80％以上时，开始蛋白质递送实验。首先将CRISPR-Cas9蛋白与sgAAVS1或者sgHBB在37℃孵育10分钟后形成CRISPR-Cas9/sgEGFP复合物，再将CRISPR-Cas9/sgEGFP复合物与P4充分混合后，加入100μL无血清DMEM培养基，震荡混匀。CRISPR-Cas9的剂量为每孔4μg，sgAAVS1和sgHBB的剂量为每孔2μg，P4的剂量为每孔8μg。待室温孵育30分钟后，然后向混合溶液加入900μL无血清DMEM培养基。移除细胞培养基，使用PBS清洗两次后，加入含有P4/Cas9蛋白复合物的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。移除培养基，加入1mL的含有10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时。使用商业化试剂盒提取基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段(AAVS1-FP:CTATGTCCACTTCAGGACAGCATGT,AAVS1-RP:CCTCTTGGGAAGTGTAAGGAAGCTG；HBB-FP:AACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAG,HBB-RP:CAGGCCATCACTAAAGGCACCGAGC)，加热变性退火复性处理，最后加入0.3μL的T7E1核酸内切酶，37℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。

实验结果：图4为本发明制备的材料P4在HCT-116和HT-29细胞上递送CRISPR-Cas9蛋白编辑AAVS1基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率(a)和编辑HBB基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率(b)。结果表明本发明制备的材料P4可以高效的递送CRISPR-Cas9蛋白至HCT-116和HT-29细胞内编辑AAVS1和HBB基因，显著优于商业化试剂Lipofectamine CRISPRMAX。

实施例7：基于聚酰胺-胺树形高分子和含苯硼酸功能基团合成基因编辑核蛋白胞内递送载体P7-P14。

(1)将4-溴甲基苯硼酸与第5代聚酰-胺胺树形高分子按照不同的摩尔比(投料摩尔比分别为64:1,96:1,128:1)加入二甲基亚砜溶液中，将该反应在70℃下搅拌反应24小时，转移至透析袋后分别在二甲基亚砜和去离子水中充分透析除去溶剂及未反应的化合物，然后将产物冷冻干燥，即可得到3种不同接枝率的苯硼酸修饰的树形高分子(如式(9)所示)。根据¹H NMR核磁谱表征苯硼酸在聚酰胺-胺树形高分子表面的连接效率，根据树形高分子和苯硼酸的积分面积计算平均每一个树形高分子表面连接的苯硼酸的数量。根据计算结果，苯硼酸的平均连接条数X分别为：44、72和84，产物分别命名为P7、P8和P9。

(2)将4-甲酰基苯硼酸与第5代聚酰胺-胺树形高分子按照摩尔比96:1加入到无水甲醇溶剂中，再加入一定量冰醋酸，将该反应在0-50℃下搅拌反应12小时，加入一定量的氰基硼氢化钠，继续反应4小时，转移至透析袋后分别在甲醇溶液和去离子水中充分透析除去溶剂及未反应的化合物，然后将产物冷冻干燥，即可得到苯硼酸修饰的树形高分子。根据¹HNMR核磁谱表征苯硼酸在聚酰胺-胺树形高分子表面的连接效率，根据树形高分子和苯硼酸的积分面积计算平均每一个树形高分子表面连接的苯硼酸的数量。根据计算结果，苯硼酸的平均连接条数X为58，命名为P10(如式(9)所示)。

(3)根据P10同样的合成与纯化方法，分别使用4-(5,5-二甲基-1,3,2-二氧杂己硼烷-2-基)苯甲醛(投料摩尔比96：1)、2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸(投料摩尔比96：1)、2-氟-4-甲酰基苯硼酸(投料摩尔比96：1)、4-甲酰基-2-甲氧基苯基硼酸(摩尔比96：1)与第5代聚酰胺-胺树形高分子反应，制备含苯硼酸衍生物高分子载体，经过¹H NMR计算得到的平均连接条数分别为59，53，61和55，产物分别命名为P11，P12，P13和P14，其化学结构分别如式(9)，式(12)，式(13)和式(14)所示。

上述合成的含苯硼酸修饰的高分子材料P7-P11的化学结构如式(9)所示：

式(9)中，R₁为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，X分别为：44,72，84，58和59，相应的产物分明命名为P7、P8、P9、P10和P11。

含苯硼酸修饰的高分子材料P12的化学结构如式(12)所示：

式(12)中，R₁为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸的平均连接条数为53，相应的产物命名为P12。

含苯硼酸修饰的高分子材料P13的化学结构如式(13)所示：

式(13)中，R₁为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，2-氟-4-甲酰基苯硼酸的平均连接条数为61，相应的产物命名为P13。

含苯硼酸修饰的高分子材料P14的化学结构如式(14)所示：

式(14)

式(14)中，R₁为第5代聚酰胺-胺树形高分子，M为乙二胺，n＝5,m＝4,理论分子量为28826，聚合物表面有128个伯胺基团，4-甲酰基-2-甲氧基苯基硼酸的平均连接条数为55，相应的产物命名为P14。

实施例8：含苯硼酸修饰的高分子材料P4与P7向SW-480细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR-Cas9)编辑KRAS基因。

具体操作方法如下：首先通过体外转录的方法制备多个靶向突变KRAS基因的sgRNA(sgKRAS1,sgKRA2,sgKRRS3)(KRAS1的靶点为GTTGGAGCTGATGGCGT；KRAS2的靶点为GTTGGAGCTGTTGGCGT；KRAS3的靶点为GTTGGAGCTGGTGACGT)，并通过试管内切割目的基因PCR片段确定sgKRAS的活性。将SW-480细胞接种到6孔板中过夜，待SW-480细胞密度达到80％以上时，开始蛋白质递送实验。首先将CRISPR-Cas9蛋白与sgKRAS在37℃孵育10分钟后形成CRISPR-Cas9/sgKRAS复合物，再将CRISPR-Cas9/sgKRAS复合物与P4,P7充分混合后，加入100μL无血清DMEM培养基，震荡混匀。CRISPR-Cas9的剂量为每孔4μg，sgKRAS的剂量为每孔2μg，P4和P7的剂量为每孔8μg。待室温孵育30分钟后，然后向混合溶液加入900μL无血清DMEM培养基。移除细胞培养基，使用PBS清洗两次后，加入含有P4/Cas9和P7/Cas9蛋白复合物的培养基溶液，37℃培养箱孵育6小时。移除培养基，加入1mL的含有10％血清的DMEM培养基，继续培养48小时。使用商业化试剂盒提取基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段(KRAS-FP:TGCAGTCAACTGGAATTTTCAT,KRAS-RP:GTTGGATCATATTCGTCCACAA)，加热变性退火复性处理，最后加入0.3μL的T7E1核酸内切酶，37℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。

实验结果：图5为本发明制备的含苯硼酸修饰的高分子材料P4和P7在SW-480细胞内递送CRISPR-Cas9蛋白编辑突变KRAS基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率的结果。结果表明本发明制备的苯硼酸及其衍生物修饰后的材料P4和P7均可以高效的递送CRISPR-Cas9蛋白至SW-480细胞内编辑突变的KRAS基因，且P7可以获得较高的基因编辑效率。

以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了解本发明内容并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学、浙江大学

<120> 含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的

应用

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggctccctcc caggatcctc tc 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctatgtccac ttcaggacag catgt 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctcttggga agtgtaagga agctg 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtgaaccgca tcgagctgaa 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtgagca agggcgag 18

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttacttgtac agctcgtcca tgc 23

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggctccctcc caggatcctc tc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggtaacggc agacttctcc tc 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctatgtccac ttcaggacag catgt 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctcttggga agtgtaagga agctg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aactcctaag ccagtgccag aagag 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caggccatca ctaaaggcac cgagc 25

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggctccctcc caggatcctc tc 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gggtaacggc agacttctcc tc 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctatgtccac ttcaggacag catgt 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cctcttggga agtgtaagga agctg 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aactcctaag ccagtgccag aagag 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

caggccatca ctaaaggcac cgagc 25

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gttggagctg atggcgt 17

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gttggagctg ttggcgt 17

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gttggagctg gtgacgt 17

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgcagtcaac tggaattttc at 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gttggatcat attcgtccac aa 22