阅读说明：本技术 一种高效提取玛咖多糖的方法 (Method for efficiently extracting maca polysaccharide ) 是由 李爱民 吴晓磊 李永强 李颖 邢岩 于 2020-06-29 设计创作，主要内容包括：一种高效提取玛咖多糖的方法,该方法将玛咖粉碎过筛,经超声波辅助热水浸提后,过滤得到的上清液,经过酶解去淀粉,Sevage法去除蛋白,冻干后得到玛咖多糖。该方法操作简单、提取温度低时间短、提取率高、纯度高,获得的三个多糖成分具有较好的抗氧化性和降血脂功效。(A method for efficiently extracting maca polysaccharide comprises the steps of crushing and sieving maca, carrying out ultrasonic-assisted hot water extraction, filtering to obtain supernatant, carrying out enzymolysis to remove starch, carrying out Sevage method to remove protein, and carrying out freeze-drying to obtain the maca polysaccharide. The method has the advantages of simple operation, low extraction temperature, short extraction time, high extraction rate, and high purity, and the obtained three polysaccharide components have good oxidation resistance and blood lipid reducing effect.)

一种高效提取玛咖多糖的方法

技术领域

本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种高效提取玛咖多糖的方法。

背景技术

玛咖(学名：Lepidium meyenii Walp，又称maca)是原产于秘鲁安第斯山脉的一种十字花科植物，叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，营养成份丰富，有“南美人参”之誉。玛咖的下胚轴可能呈金色或者淡黄色、红色、紫色、蓝色、黑色或者绿色。我国于2003年引种成功，如今在我国云南和新疆等地已形成了一定规模的种植产业，***于2011年批准玛咖作为新资源食品，相关的产品开发设计功能食品和化妆品等方面。已有文献报道，玛咖酰胺、芥子油苷和玛咖多糖有抗疲劳、抗肿瘤、调节免疫能力、调节内分泌等诸多功效。玛咖作为新资源食品已广泛收到国内外保健行业的关注。

多糖是由糖苷键结合的糖链，至少由超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖作为生物大分子之一，目前的研究也越来越深入，有大量文献报道，许多天然多糖都拥有各种生物活性功能，如抗氧化活性、降血糖血脂功效、抑制癌细胞生长等。对多糖功能的研究和产品的开发也越来越多，已然成为了食品科学的前沿热点。

发明内容

本部分的目的在于提供一种高效提取玛咖多糖的方法。该方法以玛咖为原料，分离出纯度较高的三个多糖成分，该成分具有较好的抗氧化性和降血脂功效。

为实现上述目的，本发明包括如下技术方案：

一种高效提取玛咖多糖的方法，该方法包括如下步骤：

I.将玛咖根茎粉碎过筛，采用超声波辅助热水浸提的方法提取玛咖粉中的水溶性物质；

II.将步骤I获得的混合物过滤得到玛咖水提液，先后采用淀粉酶和糖化酶进行酶解，以去除淀粉，然后使酶灭活，离心取上清液；

III.将乙醇加入步骤II获得的上清液中，低温放置，使多糖沉淀；

IV.用水将步骤III获得的沉淀物用水复溶，复溶液采用Sevage法除蛋白，冻干后得到玛咖粗多糖。

如上所述的方法，优选地，所述步骤I的具体操作为：提取温度为40-60℃，提取时间为30-60min，超声功率为150-300W，料液比(重量/体积)为1∶20-40g/mL。

如上所述的方法，优选地，所述步骤II的具体操作为：在玛咖水提液中加入淀粉酶，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶(100～2000)，30～80℃下反应2～5h；再加入糖化酶，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶(50～1000)，30～80℃下反应1～4h，之后90～100℃加热5～30min使酶灭活，离心取上清液。

如上所述的方法，优选地，所述步骤II的具体操作为：在玛咖水提液中加入淀粉酶，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶1000；60℃下反应3h后再加入糖化酶，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶500，60℃下反应2h，之后100℃加热10min使酶灭活，离心取上清液。

如上所述的方法，优选地，所述步骤II的淀粉酶为α淀粉酶。

如上所述的方法，优选地，所述步骤III中，多糖溶液和乙醇的体积比为1∶(2～4)，在4～10℃放置10～14h，使多糖沉淀分离。

如上所述的方法，优选地，所述步骤IV的具体操作为：配置Sevage试剂，其中正丁醇与氯仿的体积比为1∶(2～5)；将Sevage试剂和多糖溶液按体积分数1∶(1～4)混合震荡，离心分层，保留上层溶液，之后再次加入Sevage试剂反复操作，直至上层溶液中没有蛋白检出。

如上所述的方法，优选地，所述方法还包括：

步骤V：将所述步骤IV获得的玛咖粗多糖用阴离子交换柱分离，获得三个多糖成分，分别为MPS1、MPS2和MPS3。

如上所述的方法，优选地，所述阴离子交换柱分离条件为：

离子交换柱采用的填料为聚甲基丙烯酸树脂，采用的溶剂依次为ddH₂O、0.1MNaCl和0.2M NaCl；ddH₂O洗脱得到MPS1，0.1M NaCl洗脱得到MPS2，0.2M NaCl洗脱得到MPS3。

如上所述的方法，优选地，所述MPS1的单糖组成及质量比为***糖∶半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖＝1.9∶1.4∶3.8∶1；MPS2的单糖组成及质量比为***糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1.8∶1.3∶1；MPS3的单糖组成及质量比为鼠李糖∶***糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶15.6∶24.3∶5.3。

本发明的有益效果在于：该方法以玛咖为原料分离出的多糖主要为三个多糖成分，该方法操作简单、提取温度低时间短、提取率高、纯度较高，获得的三个多糖成分具有较好的抗氧化性和降血脂功效。

附图说明

图1为采用阴离子交换柱用氯化钠水溶液梯度洗脱粗多糖的过程图。

图2为三种多糖成分吸光度值检测结果。

图3为DPPH自由基清除实验结果。

图4为羟基自由基清除实验结果。

图5为三种玛咖多糖的红外图谱。

图6a为MPS1的单糖组成；

图6b为MPS2的单糖组成；

图6c为MPS3的单糖组成。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1提取玛咖多糖(一)

1.提取过程

准确称取1g玛咖根粉末，按料液比为1∶32(g/mL)加入水中，提取时间42min，超声功率220W，提取温度50℃，提取结束之后过滤，加入α淀粉酶(诺维信公司)，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶1000，在60℃反应3h后再加入糖化酶(诺维信公司)，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶500，60℃下反应2h，之后100℃加热10min使酶灭活，离心取上清液。将上清与乙醇混合，使乙醇终浓度达到75％，在4℃下静置12h，使多糖沉淀；用水将沉淀物复溶，按正丁醇与氯仿的体积比为1∶4配置Sevage试剂，将Sevage试剂与多糖溶液混合震荡，试剂与多糖溶液体积比为1∶2，保留上层溶液，使用Sevage试剂反复多次萃取蛋白，直至上层溶液不再检测出蛋白，将去除蛋白的上层溶液冷冻干燥，获得玛咖粗多糖，玛咖多粗糖的总提取率为11.0wt％。

2.产品分离

采用阴离子交换柱(DEAE-650M，TOSOH)，氯化钠水溶液梯度洗脱，分离粗多糖过程如图1所示，每管洗脱液8ml，水洗脱获得MPS1、0.1MNaCl洗脱获得MPS2、0.2MNaCl洗脱获得MPS3，三种成分重量百分比分别为57.7％、18.3％、24.0％，其中MPS1所占比例最多，为中性多糖。

3.产品分析

(1)产品纯度

分别对三种多糖成分进行吸光度值检测，结果如图2所示，可以看出三种多糖成分在波长280nm处没有明显的吸收峰，可以判断多糖中没有蛋白质的杂质。

(2)定性检测

用离子色谱对三种多糖成分进行检测，结果如图6所示。图6a为MPS1的单糖组成，测得MPS1的单糖组成比例为***糖∶半乳糖∶葡萄糖∶甘露糖＝1.9∶1.4∶3.8∶1。图6b为MPS2的单糖组成，MPS2的单糖组成比例为***糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1.8∶1.3∶1。图6c为MPS3的单糖组成，MPS3的单糖组成比例为鼠李糖∶***糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1∶15.6∶24.3∶5.3。

(3)红外光谱检测

如图5所示，从上到下3条线分别表示MPS1、MPS2和MPS3的红外图谱，有大部分峰是相同的，其中，在3360cm^-1左右出现的峰是-OH基团，2930cm^-1出现的峰表示的是C-H链接，1600cm^-1的峰表示有C＝O链接键，1400cm^-1表示C＝C链接键，MPS1在1053cm^-1的峰为吡喃环，MPS2在559cm^-1左右出现的吸收峰表示了MPS2有α螺旋结构。

实施例2提取玛咖多糖(二)

1.准确称取1g玛咖根粉末，按料液比为1∶30(g/mL)加入水中，提取温度40℃，超声功率300W，提取时间45min，提取结束之后过滤，加入α淀粉酶(诺维信公司)，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶500，在50℃反应5h后再加入糖化酶(诺维信公司)，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶1000，50℃下反应3h，之后100℃加热20min使酶灭活，离心取上清液。将上清与乙醇混合，使乙醇终浓度达到80％，在5℃下静置14h，使多糖沉淀；用水将沉淀物复溶，按正丁醇与氯仿的体积比为1∶5配置Sevage试剂，将Sevage试剂与多糖溶液混合震荡，试剂与多糖溶液体积比为1∶4，保留上层溶液，使用Sevage试剂反复多次萃取蛋白，直至上层溶液不再检测出蛋白，将去除蛋白的上层溶液冷冻干燥，最终玛咖多糖的提取率为10.5％。

2.产品分离

采用与实施例1相同的阴离子交换柱和分离条件进行玛咖粗多糖的分离，三种成分重量百分比分别为51.9％、20.0％、28.1％。

3.产品分析

三种成分的纯度和定性检测检测结果与实施例1相似。

实施例3提取玛咖多糖(三)

准确称取1g玛咖根粉末，按料液比1∶30(g/mL)加入水中，提取温度50℃，超声功率200W，提取时间45min，提取结束之后过滤，加入α淀粉酶(诺维信公司)，淀粉酶与原料玛咖粉的质量比为1∶800，在70℃反应2h后再加入糖化酶(诺维信公司)，糖化酶与原料玛咖粉的质量比为1∶800，70℃下反应3h，之后100℃加热30min使酶灭活，离心取上清液。将上清与乙醇混合，使乙醇终浓度达到70％，在5℃下静置13h，使多糖沉淀；用水将沉淀物复溶，按正丁醇与氯仿的体积比为1∶3配置Sevage试剂，将Sevage试剂与多糖溶液混合震荡，试剂与多糖溶液体积比为1∶3，保留上层溶液，使用Sevage试剂反复多次萃取蛋白，直至上层溶液不再检测出蛋白，将去除蛋白的上层溶液冷冻干燥，最终玛咖多糖的提取率为10％。

2.产品分离

采用与实施例1相同的阴离子交换柱和分离条件进行玛咖粗多糖的分离，三种成分重量百分比分别为52.2％、19.7％、28.1％。

3.产品分析

三种成分的纯度和定性检测检测结果与实施例1相似。

实验例1玛咖多糖的抗氧化性实验

本实验主要涉及对两种自由基清除的实验，分别是DPPH自由基和羟基自由基。

一、DPPH自由基清除实验：

取0.5mL不同浓度(1、2、4、6、8、10mg/mL)的多糖样品与0.5mL DPPH(0.04mg/mL，溶于无水甲醇)混合，充分振荡并室温静置40min，在517nm处测定吸光值。

DPPH清除率＝(1-(A₃-A₂)/A₁)×100％

式中A₁表示用无水甲醇代替样品，A₂表示用无水甲醇代替DPPH溶液，A₃表示DPPH溶液和样品混合反应。

玛咖多糖组成之一MPS1对DPPH自由基清除效果最佳，在5mg/mL的浓度下清除率达到了81.8％，如图3所示。

二、羟基自由基清除实验：

取0.5ml邻二氮菲溶液与1ml PBS(pH 7.4)混匀，加入0.5ml待测样品(1、2、4、6、8、10mg/mL)和0.5ml硫酸亚铁，混匀后加0.5ml过氧化氢，最后ddH₂O定容至10ml，在37℃水浴1h后再536nm处测定吸光值。

羟自由基去除率＝[(A₃-A₁)/(A₂-A₁)]×100％

式中A₁表示不添加样品；A₂表示不添加过氧化氢；A₃表示添加样品。

玛咖多糖组成之一MPS2对羟基自由基清除效果最佳，在8mg/mL的浓度下清除率达到了100％，如图4所示。

从图3、图4可以看出MPS1对DPPH自由基和羟基自由基的清除效果较佳，分别能达到81.8％(5mg/mL)和89.5％(10mg/mL)，而MPS2对羟基自由基的清除效果略高于MPS1，在8mg/mL的浓度下清除率达到了100％。

实验例2玛咖多糖的降血脂作用

取2mL不同浓度的多糖，放入试管中，加0.5mL 0.01M的HCl，37℃恒温振荡1h。以0.1mol/L NaOH调节pH至6.3，加入2ml 10mg/ml的胰蛋白酶，37℃振荡1h。每个样品加入2mL0.4mmol/L甘氨胆酸钠或0.5mmol/L牛磺胆酸钠，37℃振荡1h。4000r/min离心20min，取上清，加6ml70％的硫酸70℃反应20min，取出冰浴5min，在387nm处测定吸光值。

玛咖多糖的三种组成MPS1、MPS2、MPS3的对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合能力如表1所示。

表1玛咖多糖三种组分对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合能力

从表1可以看出，三种多糖对牛磺胆酸钠的结合能力明显高于甘氨胆酸钠，其中MPS3的结合能力最佳，达到了2.4590±0.5771(μmol/100mg)，通过结合胆酸钠可以减少胆汁酸的肝肠循环，促进肝脏降解更多的胆汁酸，使得血液中的胆固醇流入肝脏，起到了降低血脂的作用。