阅读说明：本技术 一种胞磷胆碱钠的合成方法 (Synthesis method of citicoline sodium ) 是由 何魁芳 胡东晓 马克·博科拉 蔡宝琴 张城孝 胡虎 罗霄 彭沁利 崔琴燕 刘思彤 于 2020-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种胞磷胆碱钠的合成方法,包括以下步骤：向反应容器中加入5’-胞苷酸,氯化磷酸胆碱钙盐,ATP,氯化镁水溶液,Tris-HCl缓冲液,混合均匀；接着,调节pH值至6.0～8.0,并加入CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶,在25～50℃下搅拌反应4～10小时,高速离心后,取上清液,即得所述胞磷胆碱钠；与传统的胞磷胆碱钠合成工艺相比,本发明提供的合成路线对环境友好,产率稳定,有利于节省能耗和保护环境,因此适用于大规模工业化生产。(The invention discloses a method for synthesizing citicoline sodium, which comprises the following steps: adding 5' -cytidylic acid, choline calcium chlorophosphate, ATP, magnesium chloride aqueous solution and Tris-HCl buffer solution into a reaction container, and uniformly mixing; then, adjusting the pH value to 6.0-8.0, adding CMP phosphokinase, nucleoside diphosphate kinase and phosphorylcholine-cytidine acyl transferase, stirring and reacting for 4-10 hours at the temperature of 25-50 ℃, centrifuging at a high speed, and taking supernatant to obtain the citicoline sodium; compared with the traditional citicoline sodium synthesis process, the synthesis route provided by the invention is environment-friendly, has stable yield, is beneficial to saving energy consumption and protecting the environment, and is suitable for large-scale industrial production.)

一种胞磷胆碱钠的合成方法

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及一种胞磷胆碱钠的合成方法。

背景技术

胞磷胆碱钠又称胞二磷胆碱钠，是一种脑代谢激活剂，其为核苷衍生物，是磷酯酰胆碱的前体物质，也是卵磷脂合成所必需的辅酶。研究表明，胞磷胆碱钠具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力的作用，临床应用较广。

因此，胞磷胆碱钠的制备方法是研究人员比较关心的研究课题。

现有技术中，制备胞磷胆碱钠的方法包括：

①化学合成法：利用CMP(5'-胞苷酸)和磷酸胆碱作为反应物，对甲苯磺酰氯为缩合剂，在N-二甲基甲酰胺(DMF)存在下缩合成胞磷胆碱钠，然而，化学合成存在反应转化率低，副产物多，生产成本高，环境污染严重等问题。

②微生物发酵法：用酵母菌或产氨短杆菌等微生物利用葡萄糖，并添加CMP、CP等前提物发酵生成胞磷胆碱钠，但是微生物发酵法存在产物浓度低，产率不稳定等问题。

③酶促合成法：抽提细胞液用胞苷三磷酸(CTP)和磷酸胆碱生物合成胞磷胆碱钠，但是，现有的酶和细胞液合成需要使用底物CTP，从而造成合成成本较高。

因此，亟需提供一种适于大规模工业化生产的胞磷胆碱钠的制备方法，以解决酶来源受限制和合成成本过高的技术问题。

发明内容

针对现有技术中存在的种种技术缺陷，本发明旨在提供胞磷胆碱钠的新制备方法，其以大肠杆菌表达的游离酶为生物催化剂，以5'-胞苷酸、磷酸胆碱、ATP为反应原料进行生物转化，成功制得了目标产物；同时，本发明提供的技术方案还解决了酶来源受限制和合成成本过高的技术问题。

同时，本发明提供了一条新的胞磷胆碱钠的合成路线，如下所示：

具体地，一种胞磷胆碱钠的合成方法，其包括以下步骤：

向反应容器中加入5'-胞苷酸，氯化磷酸胆碱钙盐，ATP，氯化镁水溶液，Tris-HCl缓冲液，混合均匀；接着，调节pH值至6.0～8.0，并加入CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶，在25～50℃下搅拌反应4～10小时，高速离心后，取上清液，即得所述胞磷胆碱钠；

其中，所述CMP磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；详见下表1：

表1氨基酸序列表

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述CMP磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的浓度分别为1～50g/L。

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述5'-胞苷酸的浓度为5～150mmol/L。

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述氯化磷酸胆碱钙盐的浓度为15～200mmol/L。

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，在反应体系中，所述ATP的浓度为6～200mmol/L。

应当说明的是，上述优选实施方式中各物质的浓度，例如，5'-胞苷酸的浓度、氯化磷酸胆碱钙盐的浓度、ATP的浓度等均是相对于催化体系总体积(例如反应罐的有效容积)而言的，换言之，上述浓度描述的是它们分别相对于催化体系总体积的浓度。

优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法中，所述CMP磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的制备方法分别包括：

S1：将所述CMP磷酸激酶或所述核苷二磷酸激酶或所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶对应的基因克隆到pACYC-DUET1载体上，并转化到BL21(DE3)大肠杆菌的宿主细胞内；

S2：将克隆得到的酶的工程菌的种子接种到培养体系中，培养18-24小时，培养结束后离心收集菌体；

其中，3种不同的工程菌的种子液加入的体积为培养基的体积的5％-10％；

S3：取上述菌体悬浮在50mM Tris-HCl缓冲液中，破碎后，获得破碎液，将上述破碎液进行高速离心，即得到3种不同酶的酶液上清；其中，采用超声破碎仪或匀浆仪实施破碎。

进一步优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法的步骤S3中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.5。

进一步优选地，在上述胞磷胆碱钠的合成方法的步骤S3中，所述菌体质量与所述Tris-HCl缓冲液的悬浮比例为1:10～1:20g/mL。并且，值得说明的是，此处所述菌体质量指的是湿菌体质量。

综上所述，本发明所提供的技术方案与现有技术相比至少具备以下有益效果：

采用分子克隆CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶、磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的大肠杆菌工程菌制备3种不同的酶，酶源稳定，从而避免目前国内普遍采用的啤酒酵母的反应体系所带来的车间环境污染及大量废酵母渣需处理的缺点；采用CMP作为合成原料之一相比现有技术所用CTP作为合成原料之一具有明显的成本优势。

总之，与传统的胞磷胆碱钠合成工艺相比，本发明提供的合成路线对环境友好，产率稳定，有利于节省能耗和保护环境，因此适用于大规模工业化生产。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

根据优选实施例所述的胞磷胆碱钠的合成方法，主要包括以下步骤：利用分子克隆CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶、磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的大肠杆菌工程菌并制备以上的3种酶，并提供3种酶的酶液上清；以氯化磷酸胆碱钙盐、ATP、CMP为原料，由以上三种酶共同催化生成胞磷胆碱钠，其中，所使用的CMP磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所使用的核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所使用的磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一个优选实施例中，所述胞磷胆碱钠的合成方法包括以下步骤：

向反应容器中加入5'-胞苷酸，氯化磷酸胆碱钙盐，ATP，氯化镁水溶液，Tris-HCl缓冲液，混合均匀；接着，调节pH值至6.0～8.0，并加入CMP磷酸激酶、核苷二磷酸激酶和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶，在25～50℃下搅拌反应4～10小时，高速离心后，取上清液，即得所述胞磷胆碱钠；

其中，所述CMP磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述核苷二磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；

其中，所述CMP磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的制备方法分别包括：

S1：将所述CMP磷酸激酶或所述核苷二磷酸激酶或所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶对应的基因克隆到pACYC-DUET1载体上，并转化到BL21(DE3)大肠杆菌的宿主细胞内；

S2：将克隆得到的酶的工程菌的种子接种到培养体系中，培养18-24小时，培养结束后离心收集菌体；

S3：取上述菌体悬浮在50mM Tris-HCl缓冲液中，破碎后，获得破碎液，将上述破碎液进行高速离心，即得到酶液上清。

在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述CMP磷酸激酶、所述核苷二磷酸激酶和所述磷酸胆碱-胞苷酰转移酶的浓度分别为1～50g/L。

在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述5'-胞苷酸的浓度为5～150mmol/L。

在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述氯化磷酸胆碱钙盐的浓度为15～200mmol/L。

在一个进一步优选的实施例中，在反应体系中，所述ATP的浓度为6～200mmol/L。

在一个更进一步优选的实施例中，在步骤S3中，所述Tris-HCl缓冲液的pH值为7.5。

在一个更进一步优选的实施例中，在步骤S3中，所述菌体质量与所述Tris-HCl缓冲液的悬浮比例为1:10～1:20g/mL。

实施例

依次按照以下具体步骤制备胞磷胆碱钠：

I分别构建3类菌种：

通过基因检索的方式找到3个针对特定底物有活性的基因(这3类酶的基因)，通过基因公司合成对应的碱基序列并且克隆到pACYC-Duet-1载体上。我们将收到的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)(实验室保藏宿主)，在氯霉素(Cam⁺)-LB的平板上筛选取阳性菌落。

以单菌落为模板用引物1和引物2进行PCR扩增，扩增条件包括：起始变性95℃5min，然后执行如下的反应条件：95℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环，最后72℃延伸3min，得到与预期大小相符PCR产物；PCR产物测序由上海生工技术有限公司进行。测序结果表明获得的基因序列与设计的完全一致。其中，引物1碱基序列(SEQ ID NO.4)：5‘-ACCGCGAAAGGTTTTGCGCCAT-3’，引物2碱基序列(SEQ ID NO.5)：5‘-CAGGGTCGTTAAATAGCCGC-3’。

II3种工程菌培养：

从上一步氯霉素(Cam⁺)-LB平板上筛选得到的单菌落接种到5ml含有30ug/ml的氯霉素(Cam⁺)的LB液体培养基中，37℃培养14小时，然后按1：100转接到LB培养基中，37℃培养2-3小时，加入诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mM，37℃诱导16小时。离心收集菌体。

III制备3种不同酶的酶液上清：

称取步骤2中的3种菌体各2g，使用悬50mM Tris-HCl缓冲液释至100g/L，置于冰水浴中，使用超声细胞破碎仪，设置超声波功率30％，工作4秒停6秒，循环30min，得到20ml破菌液。将其于4℃、8000rpm离心10min，收集离心上清液；即分别制得CMP磷酸激酶酶液上清、核苷二磷酸激酶酶液上清和磷酸胆碱-胞苷酰转移酶酶液上清。

IV胞磷胆碱钠的合成：

在5ml反应体系中实施酶催化合成，反应液含有：20mM 5'-胞苷酸(CMP)，25mM氯化磷酸胆碱钙盐，45mM ATP，10mM氯化镁，100mM Tris-HCl缓冲液，pH值调节至7.5；加入步骤III中的CMP磷酸激酶酶液上清3g/L(加入后相对反应体系总体积的浓度，下同)，核苷二磷酸激酶酶液上清3g/L，磷酸胆碱-胞苷酰转移酶酶液上清10g/L，30℃反应24小时。以CMP和氯化磷酸胆碱钙盐计算收率分别为93.2％和75.8％。

V反应样品分析方法：

分析设备：HPLC，液相分析柱:LP-C18，流动相：0.6％磷酸(使用二乙胺调节pH至6.60)，流速：1.5mL/min，柱温：30℃，波长：272nm，各物质的出峰时间：CMP-5.1min，CDP-7.8min，CTP-12.6min，CTP-C(胞磷胆碱钠)-4.5min。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 宁波酶赛生物工程有限公司

<120> 一种胞磷胆碱钠的合成方法

<130> ECN1940562A

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Gly Phe Gln Ile Ala Ile Asp Gly Pro Ala Ala Ser Gly Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ile Ala Lys Leu Leu Ala Glu Arg Leu Gly Phe Glu His Leu Asn

20 25 30

Thr Gly Ala Thr Tyr Arg Ala Val Ala Val Tyr Leu Lys Glu Lys Gly

35 40 45

Leu Asn Pro Ser Ser Pro Arg Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Lys Asp

50 55 60

Val Lys Val Asp Tyr Arg Asp Gly Arg Val Phe Ile Asn Gly Lys Asp

65 70 75 80

Tyr Thr Glu Lys Ile Gln Ser Pro Glu Ala Gly Ile Leu Ala Ser Asp

85 90 95

Phe Ala Lys Leu Asp Leu Val Arg Glu His Leu Val Arg Ile Gln Arg

100 105 110

Glu Ile Cys Asp Asp Lys Asn Ile Val Val Glu Gly Arg Asp Ile Gly

115 120 125

Thr Val Val Leu Pro Asp Ala Gln Leu Lys Ile Phe Leu Thr Ala Ser

130 135 140

Leu Glu Ala Arg Ile Glu Arg Lys Leu Arg Glu Tyr Gln Lys Lys Gly

145 150 155 160

Leu Asn Val Ser Arg Glu Glu Val Glu Arg Glu Leu Ile Ser Arg Asp

165 170 175

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180 185 190

Ala Val Val Ile Asp Thr Thr Ser Met Ser Val Asn Glu Val Leu Gln

195 200 205

Lys Ile Leu Lys Leu Val Glu Glu Arg Met Lys Ala

210 215 220

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ile Ile Lys Pro Asp Ala Val Ser

1 5 10 15

Lys Asn Val Ile Gly Glu Ile Leu Thr Arg Phe Glu Lys Ala Gly Leu

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Arg Val Val Ala Ala Lys Met Val Gln Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly

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Gly Phe Tyr Ala Glu His Lys Glu Arg Pro Phe Phe Lys Asp Leu Val

50 55 60

Ser Phe Met Thr Ser Gly Pro Val Val Val Gln Val Leu Glu Gly Glu

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Asp Ala Ile Ala Lys Asn Arg Glu Leu Met Gly Ala Thr Asp Pro Lys

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100 105 110

Glu Asn Ala Val His Gly Ser Asp Ser Glu Ala Ser Ala Ala Arg Glu

115 120 125

Ile Ala Tyr Phe Phe Ala Ala Thr Glu Val Cys Glu Arg Ile Arg

130 135 140

<210> 3

<211> 402

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Ala Lys Leu Ser Arg Thr Thr Ser Leu Lys Lys Arg Leu Ser Asn

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Ser Ser Phe Thr Lys Leu Phe Lys Ala Lys Arg Lys Arg Glu Asp Asp

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Glu Asp Ser Thr Thr Asp Ser Ala Asp His Glu Glu Thr Pro Gly Lys

35 40 45

Glu Asn Arg Glu Ile Ala Thr Pro Ser Ala Lys Arg His Arg Pro Ile

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Asn Ile Pro Pro Lys Asp Arg Pro Ile Arg Ile Tyr Ala Asp Gly Ile

100 105 110

Phe Asp Leu Phe His Leu Gly His Met Lys Gln Leu Glu Gln Cys Lys

115 120 125

Lys Ala Phe Pro Asn Val Glu Leu Val Cys Gly Ile Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Val Thr His Lys Leu Lys Gly Leu Thr Val Leu Thr Asp Lys Gln Arg

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Cys Glu Thr Leu Met His Cys Lys Trp Val Asp Glu Val Val Pro Asn

165 170 175

Ala Pro Trp Cys Val Thr Pro Glu Phe Leu Ala Glu His Lys Ile Asp

180 185 190

Tyr Val Ala His Asp Asp Ile Pro Tyr Val Ser Ser Asp Ser Asp Asp

195 200 205

Ile Tyr Lys Pro Ile Lys Glu Leu Gly Lys Phe Leu Thr Thr Gln Arg

210 215 220

Thr Asp Gly Ile Ser Thr Ser Asp Ile Ile Thr Lys Ile Ile Arg Asp

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Tyr Asp Lys Tyr Leu Met Arg Asn Phe Ala Arg Gly Ala Thr Arg Gln

245 250 255

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275 280 285

Asn Asn Ala Ser Arg Asp Leu Tyr Phe Glu Val Arg Glu Ile Leu Leu

290 295 300

Arg Lys Thr Leu Gly Lys Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Leu Gly Asp Lys

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His Ile Pro Arg Ser Ile Ala Leu Gly Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asp

325 330 335

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340 345 350

Leu Leu Ile Arg Glu Pro Ser Pro Ala Thr Glu Phe Ala Ser Lys Tyr

355 360 365

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Ser His

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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