人羊膜上皮干细胞在制备治疗急性肾损伤药物中的用途
阅读说明：本技术 人羊膜上皮干细胞在制备治疗急性肾损伤药物中的用途 (Application of human amniotic epithelial stem cells in preparation of medicine for treating acute kidney injury ) 是由 杨莉 任奕飞 陈颖 李双玲 徐大民 郑茜子 吕继成 刘琴 于 2020-04-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及人羊膜上皮干细胞在治疗急性肾损伤中的用途。本发明公开了使用有效剂量的人羊膜上皮干细胞或含有人羊膜上皮干细胞的细胞制剂单独或者与其它药物联合使用进行治疗和/或改善急性肾损伤的方法,动物实验采用静脉注射的方法将人羊膜上皮干细胞给予小鼠模型,每次给予的剂量范围为10～(6)-10～(7)个细胞,能有效减轻急性肾损伤。(The invention relates to application of human amniotic epithelial stem cells in treating acute kidney injury. The invention discloses a method for treating and/or improving acute kidney injury by using effective dose of human amniotic epithelial stem cells or cell preparation containing the human amniotic epithelial stem cells alone or in combination with other medicaments, and animal experiments adopt an intravenous injection method to administer the human amniotic epithelial stem cells to a mouse model, wherein the dose range of each administration is 10 6 ‑10 7 The single cell can effectively relieve acute kidney injury.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及人羊膜上皮干细胞的用途。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)已经成为全球关注的医疗问题之一，有研究报道全球每年罹患AKI的患者约有1300万人之多。AKI发病率高、并发症多、死亡率高，并且医疗消耗巨大，因此针对AKI的发病机制与临床诊疗研究已经成为近年来新的医学热点之一。
在重症监护病房(intensive care unit,ICU)的危重症患者中，AKI的问题更加严重。在我国，50％的AKI死亡患者来自于ICU病房。引起ICU患者AKI死亡的原因，除了尿毒症、高血钾等并发症外，常见的还有出血、感染和其他器官功能的衰竭等。而目前临床对于AKI患者的治疗，并没有特定的目标导向(specific target-oriented therapy)药物，除了原发病因的治疗外，主要靠支持手段，如液体治疗、血管活性药物、不使用肾脏毒性药物、血液净化等。此外，存活的AKI患者如果肾脏功能没有完全恢复，进展到终末期肾病(end-stagekidney disease，ESKD)，亦只能依赖肾脏替代治疗，如血液净化和肾移植手术，这些治疗又受到医疗费用、医疗资源配置和肾脏供体数量的明显限制。因此如何救治危重症AKI患者、改善其短期与长期预后，是目前ICU内亟待解决的焦点问题之一。
ICU中，缺血再灌注损伤引起的AKI(ischemia/reperfusion induced AKI,I/R-AKI)是最具代表性的AKI类型。2015年发表的关于ICU内AKI的国际多中心流行病学研究(97个ICU，1802例病人,33个国家)显示，排名前5位的ICU-AKI原因包括脓毒症、低血容量、药物相关、心源性休克、肝肾综合征，这些病因均与肾脏缺血再灌注损伤相关。近年来，对于I/R-AKI发生的病理生理机制有了较为深入的认识，严重缺血缺氧导致肾小管上皮细胞以及血管内皮细胞损伤与坏死，同时损伤的肾小管上皮细胞和血管内皮细胞释放炎性介质，趋化并激活免疫炎症细胞引起局部炎症反应，肾脏固有细胞与免疫炎症细胞之间发生复杂的交互作用，导致局部组织损伤的放大并触发全身炎性反应，并引起远程重要器官受累。涉及的重要细胞和分子机制包括：①I/R时，损伤的肾小管细胞释放内源性危险信号如DAMPs(damage-associated molecular patterns)以及PAMPs(pathogen-associated molecularpatterns)等分子，引起补体激活、免疫炎症细胞趋化、炎性细胞因子的产生等系列反应，激活天然/获得性免疫反应系统。与此同时，损伤的肾小管上皮细胞上调主要组织相容性复合体II类分子(major histocompatibility complex-II,MHC-II)的表达，与T细胞共刺激分子、Toll-样受体等相作用，进一步激活T淋巴细胞和巨噬细胞，引起持续性肾脏炎症反应，加重组织损伤。②损伤激活的血管内皮细胞表达趋化因子和粘附分子增加、促进中性粒细胞和单核细胞迁移，导致氧化应激反应和补体激活，进一步引起血管通透性增加、血小板聚集、微循环炎性反应和异常的活性氧物质(ROS,reactive oxgen species)产生增加，加重组织损伤。③血液中的中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞等在肾小管上皮细胞、血管内皮细胞分泌的趋化因子作用下，粘附迁移至肾损伤局部，其中中性粒细胞直接发挥炎性反应作用，单核细胞分化成为巨噬细胞，M1型巨噬细胞对于吞噬和消化细胞碎片、病原体起主要作用，与Th1淋巴细胞起协同作用；M2巨噬细胞参与Th2淋巴细胞引起的体液免疫反应，并同时具有组织修复作用。④补体系统在AKI中亦具有重要致病作用。其中，补体C3在I/R后数小时内即在肾脏局部合成增加，通过级联反应，形成膜攻击复合物C5b-9直接造成肾脏固有细胞损伤。⑤固有细胞损伤以及局部炎症细胞激活导致促炎因子的大量产生与释放，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1)，进一步激活包括单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞等在内的天然/适应性免疫反应，并且随ROS介导的丝裂原活化蛋白激酶(MARK)和核因子激活的B细胞κ-轻链(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)信号通路的增强，瀑布式放大了局部炎性反应，诱导了更为广泛的炎性介质的释放，如IL-6、TNF-a、IL-1β、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、IL-17等，并触发了全身系统性炎性反应，对远隔器官功能造成影响，这也是AKI高死亡率的原因之一。因此，AKI免疫炎症调控机制研究的日益深入，为开发新的AKI治疗手段提供了理论根据和方向。
针对AKI诱发的显著的炎性反应，近年主要的研究进展是干细胞治疗，即通过干细胞的抗炎、抗氧化、抗凋亡作用发挥肾脏保护作用。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体，分为胚胎干细胞和成体干细胞，其治疗I/R-AKI的可能机制如下：①抗炎作用。通过对各类免疫炎症细胞的调控以及对NF-κB转录活性的抑制发挥抗炎症效应。②抗氧化作用。干细胞可以增强抗氧化酶活性(如超氧化物歧化酶SOD、过氧氢化酶CAT、谷胱甘肽S-转移酶GST、谷胱甘肽过氧化物酶等)、增强ROS清除酶活性，并减少ROS和8-羟基脱氧鸟苷(8-OhdG，8-hydroxy-2-deoxyguanosine)产生，从而减轻氧化应激损伤。③抗凋亡作用。干细胞可增加抗凋亡基因如Bcl-2(B淋巴细胞瘤-2，B-cell lymphoma-2)的表达，下调致凋亡基因如Bax(Bcl-2相关蛋白X,Bcl2-associated X)的表达，发挥抗细胞凋亡作用。
大量体外及体内研究显示了干细胞对于AKI具有肾脏保护作用。多种不同来源的干细胞，可以通过调节免疫反应、平衡促炎及抑炎系统、促血管生成、修复损伤、清除病原体、分泌生长因子等，促进肾小管上皮细胞再生，发挥肾脏保护作用。在现有的AKI治疗研究中，应用以下几种不同来源的干细胞，存在问题如下：①骨髓、脐带血、脂肪等来源的间充质干细胞(MSCs)，由于在实验动物体内滞留时间短，并且部分研究中发现有诱发宿主免疫排斥反应，并且MSCs细胞在动物体内存在发育不良、纤维化、钙化、异常分化、形成畸胎瘤或其他恶性增殖性肿瘤等不良反应的风险，因此临床试验相关数据较少。②骨髓、外周血、脐带血来源的内皮祖细胞：在动物模型中进行细胞移植后的数小时内便观测到细胞大量死亡，且具有促肿瘤血管形成及致血管纤维化的风险，未见临床试验报告。②诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)，尚需要长期观察以确证其在体内是否具有致瘤性。
基于目前研究现状，为促进干细胞治疗AKI的临床应用，亟需寻找一种基因表达稳定性高、安全有效、不涉及伦理学问题的干细胞。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对急性肾损伤治疗难题，提供新的治疗药物或方法。
一方面，本发明提供了一种利用人羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelialstem cells，hAESCs)在制备用于治疗急性肾损伤的药物中的应用。
上述人羊膜上皮干细胞CD324表达阳性，而CD45、CD34表达阴性。
上述人羊膜上皮干细胞无端粒酶活性。
上述人羊膜上皮干细胞是多潜能的或多能的。
上述人羊膜上皮干细胞经过培养扩增得到的第P1-P3代人羊膜上皮细胞。
上述人羊膜上皮干细胞为经过传代培养得到的P1代人羊膜上皮干细胞。
上述人羊膜上皮干细胞制备步骤如下：
(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；
(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮干细胞；
(3)将步骤(2)中人羊膜上皮干细胞扩增培养至P1代。
上述人羊膜上皮干细胞混悬于生理盐水中，制备得到人羊膜上皮干细胞注射液。
上述药物包括人羊膜上皮干细胞及药学上可接受的载体或稀释剂。上述载体为人工支架，所述人工支架为明胶海绵、脱钙骨、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或它们的共聚物；所述稀释剂为生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液、全血清或脐带血清。
上述人羊膜上皮干细胞每次剂量为103-109个细胞。优选106-107个细胞。急性肾损伤(AKI)是一种常见的临床疾病，其定义为肾小球滤过率突然下降。尽管急性损伤后肾脏具有显著的再生能力，但AKI发作通常会增加患慢性肾脏疾病的风险以及短期和长期死亡率的风险。据估计，AKI每年在全球造成200万人死亡，是全球健康问题日益引起关注。肾缺血再灌注(IRI)是急性肾损伤和急性肾衰竭的主要原因之一，导致其高发病率和高死亡率。由于存在多种因素的病理生理机制，一旦建立，就没有有效的药理学方法可以阻止其发展或逆转损伤。随着世界范围内AKI发病率的增加，迫切需要开发更有效的AKI治疗策略。在过去的几年中，干细胞疗法已被广泛认为是AKI的潜在治疗策略，但是一直未找到合适的干细胞。
人羊膜上皮干细胞(human amniotic epithelial stem cells，hAESCs)又称人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)，是从胎盘上最靠近胎儿一侧的羊膜上分离而来的细胞。胎盘属于孕妇生产后的废弃物，故此来源的细胞不存在伦理问题。
人羊膜上皮干细胞起源于多能外胚层并在整个孕期均保留多向分化的潜能，是具有类似于胚胎干细胞分化特性和成人干细胞免疫调节特性的一种围产期干细胞，可以表达多种细胞因子、免疫调控因子和神经营养因子，在实验动物体内通过对淋巴细胞和巨噬细胞的多种信号通路调控发挥免疫调节和抗炎症作用。研究表明，hAESCs可根据其所在的周围环境不同，分泌不同的因子调节巨噬细胞迁移能力，并通过旁分泌效应(细胞因子与外泌体)诱导巨噬细胞从促炎性M1巨噬细胞亚型转变为抑炎促修复性M2巨噬细胞亚型。此外，人羊膜上皮细胞可诱导T淋巴细胞极化为调节性T细胞(Treg,T regulatory cell,Treg)，如CD4+、CD25+、叉状头转录因子P3+(forkhead box P3，FoxP3+)T淋巴细胞，并下调辅助性T细胞1/17(Th1/Th17，helper T cell1/17)的分化，从而发挥抑制炎症反应(Human amnioticepithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophageactivation and reduces established hepatic fibrosis.Manuelpillai U,et al.PLoSOne 2011,7(6):e38631)。在小鼠博来霉素诱导肺损伤模型中，注射人羊膜上皮细胞可显著减轻肺部炎症巨噬细胞浸润、组织损伤(Human amnion epithelial cells preventbleomycin-induced lung injury and preserve lung function.Murphy S,et al.CellTransplant 2011,20(6):909-923)。此外，大量研究表明，hAECs具有无致瘤性和无免疫原性的特点。综上所述，hAESCs是再生医学和细胞治疗临床应用中目前比较适合的种子细胞，应用于I/R-AKI的治疗具备较好的发展前景。
因此，本发明首次将人羊膜上皮干细胞hAESCs应用于急性肾损伤的治疗中，并且具有良好的效果，为当前该类疾病的治疗提供了一种方案。
本发明所述的羊膜上皮干细胞来源于人类。可从离体的人胎盘分离羊膜，采用生理缓冲液冲洗除去血细胞，机械剔除残留绒毛膜和血管。分离指的是从组织样品中移出细胞且与另外的组织分开。使用任何常规技术或方法从完整人羊膜上皮层组织分离出单细胞，这些技术或方法包括机械力(切碎力或剪切力)，用一种或组合的蛋白酶例如胶原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、释放酶(liberase)和胃蛋白酶进行酶消化或机械和酶方法的组合。
在发明的一个优选实施方案中，提供了一种从羊膜组织中分离羊膜上皮干细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)从胎盘组织通过机械分离得到羊膜；
(2)清洗后的羊膜用消化酶进行消化，将消化后的液体进行离心，即可获得人羊膜上皮干细胞。
在本发明一个优选的实施方案中，人羊膜的获取应经产妇授权同意后，取健康产妇剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。
在本发明另一个优选的实施方案中，可对步骤2中获得人羊膜上皮干细胞继续培养，优选的培养条件为：以6～9×104/cm2的密度将细胞接种于培养皿中，放置于二氧化碳培养箱中培养，待人羊膜上皮干细胞贴壁后换培养液，待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存。
本领域技术人员可用已知的其它方法将活性细胞群体浓缩。这些加工后洗涤/浓缩步骤可单独或同时施行。除了上述方法以外，还可在细胞洗涤后或培养后，进一步纯化或富集活性细胞群体，减少杂细胞和死细胞。分离悬浮液中的细胞可通过以下技术来实现：浮力密度沉降离心、有差别的与固相的粘着和从固相上洗脱、免疫磁性珠、荧光激光细胞分选(FACS)或其它技术。这些不同技术以及进行这些技术的装置的实例可参见现有技术和上市商品。
对本发明使用的基础培养基的类型没有限制，只要可用于细胞培养的培养基即可。优选的培养基包括DMEM培养基和NPBM培养基。对上面提到的基础培养基中可能含有的其他组份类型没有限制，优选的成分包括F-12、FCS和神经存活因子等。
在本发明的另一个优选实施方案中，向上面提到的基础培养基中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)或EGF(表皮生长因子)。在这种情况下，可以加入一种或者两者都加入。上面提到的bFGF或EGF的举例浓度是1ng/ml至100ng/ml，优选的浓度为10ng/ml。对添加的时间和方法没有限制。优选地，在将上面提到的人羊膜上皮干细胞在基础培养基中培养时每天加入试剂。
本发明所述的人羊膜上皮干细胞制剂包括活性成分人羊膜上皮干细胞和药学可接受的载体。
考虑到要治疗的疾病的类型，本领域的技术人员可以适当选择人羊膜上皮干细胞的合适状态：未经任何处理的收集的细胞(粗提部分)；部分纯化的细胞；纯化的细胞然后经培养扩增。
本发明所述的药学可接受的载体是指适合用于人和/或动物，无过度的不良副作用(如毒性、刺激性和过敏反应)的具有合适的有益/风险率的物质，例如药学可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂，有利于细胞存活，能递送所配制的细胞到人或动物。载体依合适地计划的给药方式而选择。本发明的载体包括但不限于各种生理缓冲液，如生理盐水、磷酸缓冲液、人工脑脊液；或是全血清、脐带血清；还可包括各种人工支架，包括但不限于明胶海绵、脱钙骨、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)及它们的共聚物。
可以采用任意适合的方法将人羊膜上皮干细胞给予患者，例如静脉注射或者肾脏局部等。通常这些细胞是包含在药学上可接受的液体培养基中。细胞给予可以重复或连续进行(例如，通过连续灌输注入脑脊液中)。一般而言，多重给药方式通常要间隔至少7-10天分别使用。另外一种方法为将细胞种植在生物可吸收材料如明胶海绵里，采用手术将种有细胞的生物可吸收材料植入所需的部位。上述两种方法可结合应用，可取得更好的疗效。
人羊膜上皮干细胞的适合用量将根据患者的年龄、性别、体重、健康状况以及其它因素而改变。通常，每次给予的剂量范围为大约103-109细胞，典型的是大约106-107细胞。
本发明将人羊膜上皮干细胞用于急性肾损伤的治疗，充分发挥了人羊膜上皮干细胞的优点，其中人羊膜上皮干细胞主要具有以下几个方面的优势：
(1)能长期保持多潜能性并具有胚胎干细胞所特有的向三个胚层组织分化的潜能；
(2)细胞表面几乎不表达MHCII型分子，因此不会引起炎症、过敏和免疫反应，移植配型要求也相应降低；
(3)具有调节体内和体外免疫反应的能力，在体外培养时能分泌多种免疫调节因子、抗血管生成蛋白或抗炎因子相关蛋白；
(4)具有低免疫原性，可以看作是免疫赦免细胞，无抗原呈递的功能，移植后可减少免疫细胞来源，避免免疫排斥反应的发生；
(5)不表达端粒酶逆转录酶，没有致瘤性(包括良性瘤、肉瘤和癌)；
(6)具有较强的增殖能力，并能在前代次(约10代内)保持旺盛的增殖能力；
(7)来源广泛，取材容易，没有应用限制，不存在伦理问题。
附图说明
图1重度缺血再灌急性肾损伤小鼠7天生存曲线；
图2缺血再灌手术后对照组和hAEC治疗组肾损伤情况对比；
A手术后对照组和治疗组小鼠日间体重变化差值(**,p<0.01)；
B手术后对照组和治疗组血肌酐浓度差异(**，p<0.01)；
C手术后对照组和治疗组肾脏病理急性评分(*，p<0.05)。
图3手术后对照组和hAEC治疗组凋亡细胞检测(*，p<0.05；**，p<0.01)；。
图4对照组和治疗组增值细胞检测(*，p<0.05；**，p<0.01)；
图5对照组和治疗组肾脏微血管变化情况(*，p<0.05)；
图6对照组和治疗组炎症细胞浸润情况；
图7肾脏纤维化程度分析。
A缺血再灌术后第7天马松和α-SMA染色鉴定肾脏间质纤维化水平。
B马松染色结果的统计分析。Cα-SMA染色结果统计分析。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1原代人羊膜上皮干细胞分离及培养
1人羊膜的来源
为了避免产道微生物污染，选用了剖腹产胎儿胎盘。由于足月后分娩信号刺激，羊膜会发生凋亡，因此宜用早产胎儿胎盘(38周以前)。经产妇授权同意后，取健康产妇(HIV、梅毒、甲肝、乙肝、丙肝等血清学反应均显示为阴性)剖腹产后的胎盘组织，十字刀切割胎盘，通过机械分离得到整张羊膜。
2 hAESCs的分离(全程要求无菌操作)
获取39周以前剖腹产婴儿胎盘，从胎盘内面剥离羊膜，将之浸入含有F12/DMEM(含1X青霉素-链霉素和两性霉素)基础培养基的离心管中。4℃冷链运送至实验室细胞间。
将羊膜取出，并将每张羊膜置于40ml CMF-HBSS(含1X青霉素-链霉素和两性霉素)中清洗去粘液，并用镊子刮去贴近绒毛膜层的间充质层及粘液，重复3次，每次洗涤均换新容器和新HBSS液。
将洗净的羊膜转入新容器，加10ml 0.05％胰酶/EDTA，颠倒30s，弃液。
将羊膜转入新容器，加20ml 0.05％胰酶/EDTA，37℃水浴孵育10min弃液。
羊膜转入新容器，25ml胰酶/EDTA 37℃水浴孵育40min，保存消化液。
初次消化后羊膜转入新容器，25ml胰酶/EDTA 37℃水浴孵育40min，保存消化液。
加入等体积消化终止液(F12/DMEM含5％FBS，1x L-谷氨酸，1x丙酮酸)，400g离心10min。弃液，用羊膜完全培养基：F12/DMEM含5％KSR(KnockOut Serum Replacement)，1xL-谷氨酰胺，1x丙酮酸,1X ps(Penicillin-Streptomycin),重悬沉淀。
加入等体积消化终止液，400g离心10min。弃液，完全培养基重悬沉淀。
过100μm筛，计数，以105cells/cm2接种至培养皿或置于冻存液(90％FBS,10％DMSO)中液氮冻存备用。
3 hAESCs的接种培养及冻存
细胞培养：接种1×107个细胞后，待hAESCs贴壁后换培养液，之后三天换一次培养液。
待细胞长满平板后将细胞消化下来进行冻存：15cm培养皿加5ml胰酶，10min后镜下观察，细胞变圆且平面晃动平皿时细胞全变为悬浮状态时加等量消化终止液终止消化。用微量移液器按同一方向将培养皿上的细胞吹下，移入15ml离心管，300g离心3min后收集细胞然后进行细胞计数。在冻存管内加入冻存液，标明冻存日期、批次及细胞数量之后将细胞放入冻存管，然后立刻将冻存管放入冻存盒中并将冻存盒放进-80℃冰箱，12h后取出冻存盒，将细胞移入液氮罐中保存。经检测，细胞纯度高，上皮细胞标记物CD324阳性率＞95％；无血细胞污染，血细胞标志物CD34、CD45均＜2％。
实施例2小鼠急性肾损伤模型建立
1术前准备：术前7天留基础血尿。术前6h禁食。
2双侧缺血再灌注急性肾损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)模型：
1)打开控温系统(36.9-37.1℃)；75％酒精浸泡手术器械；准备手术辅料，设定计时器。
2)小鼠测体重，随机分组。
3)麻醉：2％戊巴比妥钠，30-40mg/kg，腹腔内注射。
4)手术：小鼠背部皮肤备皮，碘伏消毒，俯卧位固定于加热垫上，直肠测温。脊柱旁纵切口，逐层切开皮肤、肌层，棉签钝性挑出肾脏，清晰显示肾蒂；动脉夹夹闭肾蒂并打开计时器，回复肾脏至腹腔内，暂时封闭皮肤；保持小鼠体温恒温(36.9-37.1℃)，等待30-33分钟，取出动脉夹，观察肾脏回血正常后，肾脏复位，缝合伤口。
5)术后：保持体温，待小鼠自然苏醒。
3干细胞注射：固定小鼠；将小鼠尾部浸泡于35-40℃温水中3-5分钟，等待尾静脉扩张充盈；1ml注射器吸入干细胞悬液0.1ml，将空气推出；针面向上，进入约5mm后可回抽下注射器，见血后缓慢推入。
4术后：每日观察两次，测体重，记录一般情况。术后第1-3天，每日腹腔注射1ml生理盐水。术后第1、2、3、7天，按实验计划留取血标本、尿标本、肾组织样本。
实施例3小鼠模型实验分组与处理
1分组：小鼠随机分为假手术组、对照组(手术后即刻注射人羊膜上皮干细胞保存液)和治疗组(手术后即刻注射人羊膜上皮干细胞)。每组18～20只小鼠。
2处理：假手术组行手术切口，棉签钝性挑出肾脏后即放置回腹腔，不经缺血再灌注操作，缝合皮肤。对照组和hAECs治疗组均完成双侧肾脏缺血再灌注手术，其中对照组术后即刻尾静脉注射hAECs细胞保存液100μl，hAECs治疗组术后即刻尾静脉注射重悬于100μl细胞保存液中的1x106个细胞。其余步骤三组处理均一致。
实施例4人羊膜上皮干细胞提高缺血再灌注急性肾损伤小鼠生存率，改善肾脏功能
1生存率观察：采用重度缺血再灌注急性肾损伤小鼠模型(37℃双侧缺血33分钟)。如图1所示，未接受治疗的小鼠7天死亡率为80％，缺血再灌注术后立刻注射人羊膜上皮干细胞可以使IRI小鼠的七天死亡率降低到47.4％(p<0.05)。
2肾损伤情况观察：采用轻度缺血再灌注急性肾损伤小鼠模型(37℃双侧缺血30分钟)。如图2A-C显示，与对照组相比较，hAECs治疗组小鼠术后日间体重下降幅度(体重差值)明显减少(D1，对照组V.S治疗组，p<0.01)，代表肾脏功能损伤程度的血肌酐水平上升幅度显著降低(D1，D2，p<0.01)，肾脏组织病理损伤评分亦明显减轻(p<0.05)。
实施例5人羊膜上皮细胞减轻肾脏损伤、促进肾脏修复
1肾小管上皮细胞在急性肾损伤后会发生坏死与凋亡。我们用TUNEL荧光染色法对肾脏石蜡切片进行了凋亡检测。结果发现(参见图3)，在术后D1和D2，hAECs治疗组小鼠肾小管上皮细胞凋亡数量明显少于对照组(D1，p<0.05；D2，p<0.01)，提示hAECs可以减轻肾小管细胞凋亡。
2急性肾损伤时，健存的肾小管上皮细胞发生增殖，修复损伤的肾组织。我们采用Ki67+免疫组化染色观察肾脏细胞增殖情况。如图4所示，与注射细胞保存液的对照组相比较，hAECs治疗组在术后D1\D2\D7均可以显著增加肾脏中增殖细胞数量。
3因为缺血再灌注导致的AKI对肾小管间质的微血管破坏严重，于是我们通过CD31免疫组化染色的方法观察肾脏微血管变化情况。结果发现(图5)，在肾脏皮质区，术后D3\D7天，与对照组相比，注射hAECs的治疗组的微血管区域面积显著增加(p<0.05)。
实施例6人羊膜上皮干细胞调控肾脏炎症反应
我们通过流式细胞分析法对肾组织浸润的炎症细胞(中性粒细胞，T细胞，B细胞和巨噬细胞)进行了分析(图6)。结果发现：手术后7天内，假手术组炎症细胞浸润程度均明显低于缺血再灌注手术组。在手术组的比较中，治疗组Gr-1+中性粒细胞在术后D2/D3天浸润数量明显低于对照组(p<0.05)，而第7天时中性粒细胞浸润增多，显著超过对照组(p<0.05)；hAEC治疗组的CD3+T细胞和CD19+B细胞在术后第1、2、3天均低于对照组，但在术后第7天B细胞浸润显著升高并且高于对照组(p<0.05)，T细胞浸润仍明显低于对照组(p<0.05)；术后D3和D7，治疗组的F4/80+巨噬细胞浸润情况显著增多，在D3出现最高值(p<0.01)，尽管D7 hAEC治疗组浸润细胞量减少，但仍高于注射细胞保存液的对照组(P<0.05)。我们进一步对巨噬细胞进行了亚型检测，结果发现hAEC治疗组的CD206++F4/80+巨噬细胞(M2型)从术后第二天开始升高，比例和数量均显著高于对照组(D2，D3和D7，p<0.01)，所以我们认为，注射hAECs的治疗组术后增多的巨噬细胞主要以修复型M2为主。
实施例7人羊膜上皮干细胞减轻肾脏纤维化
通过对小鼠肾脏石蜡切片马松染色以及抗α-SMA免疫组化染色，我们评估了小鼠肾脏纤维化的发生情况。术后第7天，hAECs治疗组在肾脏皮髓交界处的间质纤维化水平明显少于对照组(p<0.05)，提示hAECs治疗可以减轻IRI小鼠术后纤维化程度(图7)。
讨论
本团队前期动物实验研究旨在明确I/R-AKI小鼠模型中，hAESCs一次性输注(1x106 cells/只)是否可以降低小鼠死亡率、改善肾功能，并探讨作用机制。观察指标包括：①临床指标：小鼠生存率、体重、血肌酐。②肾脏病理：肾脏组织行石蜡切片和冰冻切片，PAS和HE染色，显微镜下观察肾小管细胞刷状缘缺失，肾小管管型，肾小管萎缩和肾间质炎症细胞浸润等指标并评分。③肾组织损伤与修复相关指标：肾脏凋亡、再生、纤维化和炎症细胞浸润等。
动物实验结果发现：
(1)hAESCs可以提高I/R-AKI小鼠生存率，改善肾脏功能。1)生存率观察：在重度I/R-AKI小鼠模型，未接受治疗的小鼠7天死亡率为80％，I/R术后立刻注射hAESCs可以使小鼠7天死亡率降低到47.4％(p<0.05)。2)肾损伤情况观察：采用轻度I/R-AKI小鼠模型，与对照组相比较，hAESCs治疗组小鼠术后体重下降幅度减轻(p<0.01)、血肌酐上升幅度显著降低(p<0.01)、肾脏组织病理损伤评分亦明显减轻(p<0.05)。
(2)hAESCs减轻肾脏细胞凋亡、促进组织修复。1)采用TUNEL荧光染色法对肾脏石蜡切片进行凋亡检测。结果发现，hAESCs治疗组小鼠肾小管上皮细胞凋亡数量明显少于对照组(p<0.01)。2)采用抗-Ki67免疫组化染色观察肾脏细胞增殖情况。与对照组相比较，hAESCs治疗组小鼠肾小管上皮细胞的增殖百分比显著升高(p<0.01)。3)通过抗-CD31免疫组化染色观察肾脏微血管变化。结果发现，与对照组相比，注射hAESCs的小鼠肾脏微血管区域面积显著增加(p<0.05)。
(3)hAESCs调控肾脏炎症反应。通过流式细胞分析法对肾组织浸润的炎症细胞(自然杀伤细胞，中性粒细胞，T细胞，B细胞和巨噬细胞)进行分析。结果发现：与对照组相比较，hAESCs治疗组小鼠在手术后1，2，3天，肾脏组织中浸润的Gr-1+中性粒细胞、CD3+T细胞和CD19+B细胞数量均显著降低(p<0.05)，但是F4/80+巨噬细胞浸润显著增多(p<0.01)。进一步对巨噬细胞进行亚型检测，发现hAESCs治疗组的CD206++F4/80+巨噬细胞(M2型)数量显著高于对照组(p<0.01)，提示hAESCs治疗可以调控肾组织M2巨噬细胞亚型分化，发挥抗炎促修复作用。
(4)hAESCs减轻肾脏纤维化。通过对小鼠肾脏石蜡切片马松染色以及抗α-SMA免疫组化染色，评估肾脏纤维化情况。术后第7天，hAESCs治疗组小鼠肾间质纤维化水平明显少于对照组(p<0.05)。如上所述，本研究团队前期的动物实验结果证明I/R-AKI中hAESCs治疗的有效性。
人羊膜上皮干细胞本身不表达端粒酶，细胞周期研究显示，大多数细胞处于G0/G1，只有少数细胞处于活跃的复制期，其增殖能力和扩增代数有限。而且研究发现，当P4-5代细胞的上皮形态变为间充质样细胞，上皮细胞标记CK7、CD49f、EpCAM和E-钙粘蛋白的下调，间质细胞标记CD44、CD105、CD146和波形蛋白上调。6代以后的少数细胞形态发生变化，细胞呈梭形，细胞增殖减慢，传至第8代细胞胞浆内出现空泡和黑色颗粒，逐渐停滞生长，出现凋亡。(Pratama G,Vaghjiani V,Tee JY,Liu YH,Chan J,et al.(2011)Changes inCulture Expanded Human Amniotic Epithelial Cells:Implications for PotentialTherapeutic Applications.PLoS ONE 6(11):e26136.)。因此，本发明可以使用P1-3代，再综合考虑培养时间和经济成本，优选P1代细胞。
以上实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域相关技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下，所有类似的替换和改动都应包括在本发明保护范围内。
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