一种细胞色素P450酶及其编码基因CsCYP1与应用
阅读说明：本技术 一种细胞色素P450酶及其编码基因CsCYP1与应用 (Cytochrome P450 enzyme and coding gene CsCYP1 and application thereof ) 是由 张欣欣 孙雪丽 易干军 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明首次在柑橘中克隆了一种细胞色素P450酶CsCYP1基因,该细胞色素P450酶能够分别利用香叶基芳樟醇和橙花叔醇为底物,催化TMTT和DMNT的合成,由于TMTT和DMNT这两种物质能够在植物受植食性昆虫侵害后诱导产生,具有趋避害虫和诱导邻近植物防御反应的功能,也可以吸引相应的害虫天敌前来从而达到控制害虫的作用,说明本发明的细胞色素P450酶CsCYP1可以利用底物催化合成TMTT和DMNT,并可利用其趋避害虫或吸引害虫天敌的特性,在柑橘的抗虫防御反应中发挥重要作用。(The cytochrome P450 enzyme CsCYP1 gene is cloned in citrus for the first time, the cytochrome P450 enzyme can respectively utilize geranyl linalool and nerolidol as substrates to catalyze the synthesis of TMTT and DMNT, and because the two substances of TMTT and DMNT can be induced and generated after a plant is invaded by phytophagous insects, the cytochrome P450 enzyme CsCYP1 can catalyze and synthesize TMTT and DMNT by utilizing the substrates, has the functions of repelling pests and inducing the defense reaction of adjacent plants, and can attract the natural enemies of corresponding pests to control the pests.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞色素P450酶及其编码基因CsCYP1与应用。
背景技术
细胞色素P450(cytochrome P450，以下简称P450)是广泛存在于动植物及细菌、真菌等细胞内的，与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器膜结合的一类具有混合功能的血红素氧化酶系，是一个古老的基因超家族，也是近年来国际学术界的研究焦点之一。P450最早是以CO结合蛋白质而被发现的，因其还原型与CO结合后在450nm波长处有最大吸收而得名。P450可以催化多种反应，甚至对具有相似化学结构的底物也表现出多种反应类型。P450在这些氧化代谢中普遍需要分子氧和NADPH，其共同特点是在作用物分子中加入一个氧原子，因此被称为单加氧酶系或羟化酶或复合功能氧化酶(mixedfunction oxidase，简称MFO)。来源于植物的P450也具有这些氧化酶活性。它所催化的反应类型广泛而复杂，主要有：烯基的环氧化反应，烷基的羟化作用，氮、硫、氧位的脱烷基作用，烃基的氧化作用，过氧化作用，脱硫作用，氧化性的碳碳键断裂，氧化性脱氨、脱卤和脱氢等10多种。
许多植物在被害虫侵袭后能够产生一些挥发性化学物质，而这些化学物质可以趋避害虫或吸引害虫天敌以达到间接防治害虫的目的。其中，(E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳四烯(TMTT)和(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯(DMNT)在高等植物中广泛存在。这两种物质能够在植物受植食性昆虫侵害后诱导产生，具有趋避害虫和诱导邻近植物防御反应的功能，也可以吸引相应的害虫天敌前来从而达到控制害虫的作用。目前，在果树柑橘中尚未有关于能够催化合成TMTT和DMNT这两种物质的细胞色素P450基因的克隆和催化产物鉴定的相关报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明从柑橘中克隆得到一种细胞色素P450酶CsCYP1基因，该P450酶可以利用香叶基芳樟醇和橙花叔醇底物催化合成TMTT和DMNT，从而达到防控害虫的目的。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种细胞色素P450酶，所述P450酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，属于CYP82G家族。
本发明还提供了上述的细胞色素P450酶的编码基因CsCYP1，所述CsCYP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括上述的基因CsCYP1。
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包括上述的基因CsCYP1。
具体地，将上述的CsCYP1基因插入酵母真核表达载体(pYES2)的多克隆位点得到重组表达载体，然后将得到的重组表达载体转化至酵母INVSc1得到重组菌。
本发明还提供了上述的细胞色素P450酶或基因CsCYP1或重组表达载体或重组菌在合成TMTT和/或DMNT中的应用。
本发明还提供了上述的细胞色素P450酶或基因CsCYP1或重组表达载体或重组菌在柑橘害虫防控中的应用。
本发明在柑橘中克隆到一个编码细胞色素P450酶的基因CsCYP1，通过在真核生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的异源表达，对其催化底物香叶基芳樟醇和橙花叔醇合成TMTT和DMNT的功能进行了鉴定。结果表明，在酵母异源表达的细胞色素P450酶CsCYP1可以分别利用香叶基芳樟醇和橙花叔醇作为底物，催化TMTT和DMNT的合成。提示细胞色素P450酶CsCYP1可以催化底物合成TMTT和DMNT，并利用TMTT和DMNT趋避害虫或吸引植食性害虫天敌的特性从而达到防控害虫的目的。
优选地，通过转基因技术在柑橘植株内过表达上述的基因CsCYP1，催化合成TMTT和/或DMNT，利用TMTT和/或DMNT趋避害虫或吸引植食性害虫天敌的特性从而达到防控害虫的目的。
优选地，使上述的细胞色素P450酶体外表达并催化TMTT和DMNT的合成，然后通过往柑橘植株喷施TMTT和/或DMNT，利用TMTT和/或DMNT趋避害虫或吸引植食性害虫天敌的特性从而达到防控害虫的目的。
本发明还提供了一种体外合成TMTT和/或DMNT的方法，具体为：通过酵母真核表达系统体外表达上述的细胞色素P450酶，然后利用香叶基芳樟醇和/或橙花叔醇作为底物，催化TMTT和/或DMNT的合成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次在柑橘中克隆了一种细胞色素P450酶CsCYP1基因，该细胞色素P450酶能够分别利用香叶基芳樟醇和橙花叔醇底物，催化TMTT和DMNT的合成，由于TMTT和DMNT这两种物质能够在植物受植食性昆虫侵害后诱导产生，具有趋避害虫和诱导邻近植物防御反应的功能，也可以吸引相应的害虫天敌前来从而达到控制害虫的作用，说明本发明的细胞色素P450酶CsCYP1可以催化底物合成TMTT和DMNT，并可利用TMTT和DMNT趋避害虫或吸引植食性害虫天敌的特性，在柑橘的抗虫防御反应中发挥重要作用。
附图说明
图1为在酵母异源表达的细胞色素P450酶CsCYP1催化香叶基芳樟醇合成TMTT的GC-MS检测结果(a为转化pYES2-CsCYP1的酵母菌；b为转化空载体pYES2的酵母菌作为阴性对照；c为TMTT标准品作为阳性对照)；
图2为在酵母异源表达的细胞色素P450酶CsCYP1催化橙花叔醇合成DMNT的GC-MS检测结果(a为转化pYES2-CsCYP1的酵母菌；b为转化空载体pYES2的酵母菌作为阴性对照；c为DMNT标准品作为阳性对照)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1柑橘细胞色素P450酶及其编码基因CsCYP1的获取
利用RNA提取试剂盒(Biotake)提取柑橘甜橙(Citrus sinensis(L.)Osbeck)叶片的RNA，然后以RNA为模板，利用反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)进行反转录得到cDNA，并以cDNA为模板，利用引物对CsCYP1-F和CsCYP1-R进行PCR扩增，反应体系为：50μL体系，其中高保真Taq酶2×PhantaMax Master Mix(Dye Plus)25μL，CsCYP1-F和CsCYP1-R各2μL，cDNA模板1μL，水20μL。PCR反应程序为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 15s，退火50℃ 15s，延伸72℃ 1min 40s，循环35次，充分延伸72℃ 5min。最后根据PCR产物克隆得到CsCYP1基因的全长编码区序列(基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》)：
对PCR产物中的目的片段(CsCYP1基因的编码区序列)进行回收，回收产物与pMD18-T载体(Takara)16℃连接2h，然后导入大肠杆菌感受态DH5α(Sangon Biotech)中，于固体LB培养基(含50μg/mL氨苄霉素)上筛选培养，37℃过夜培养后挑取单克隆，对挑取的单克隆子用液体LB培养基(含50μg/mL氨苄霉素)扩大培养12h后提取质粒，利用引物对CsCYP1-F和CsCYP1-R进行PCR验证阳性克隆后，得到质粒pMD18-T-CsCYP1，对该质粒进行测序后得出CsCYP1基因的全长编码区序列。CsCYP1基因的编码区序列全长1578bp，编码525个氨基酸序列的蛋白(即P450酶)。其中CsCYP1基因的氨基酸序列、CsCYP1基因编码区的全长核苷酸序列、CsCYP1-F和CsCYP1-R分别如下所示：
CsCYP1基因的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)为：
MDSTSFSPPIFELLSLLIVYCFWRIIAKSINKREKNTAPEPSGAWPLIGHLPLLNGQEPICKILGALADKYGPIYSLRLGKHPILIVSSWEIVKDCFTTNDRILATRAKIVAGKLMGYDNAIFALAPYGPYWRDIRKIATTELLSSHRLELLKHVRYSEVDTFIKDLYSLCSENAFNPAKVVISKLIEQLTFNISLKLIAGKRFSAKDYEEQGSEAWRINRAIKEATHLFGVFILGDAIPWLEWIDFQGHVGSMKSTAKEIDDVIGNWLKERLQNKLQGEGHNGKGDLIDVLLSKLQEDAVMGGHTRDTVVKATALILILTGSESTYLGIIWTMSLLLNHPKELKKAQEELDVHVGRDRWVNESDMKKLKYLRAIVKETLRIYPPGPVTGIREAMEDCEIGGYHVPKGTRLIVNIWKLHRDPRMWENPCEFRPERFLTTHADVDVNTQHFEYVPFSFGRRSCPGMTSGLQIVQLTLARILQGFDLATVGGTPVDMQIGLGLALPKSNPLEVIIKPRLAEDLFRCI；
CsCYP1基因编码区的序列(SEQ ID NO:2)为：
ATGGATTCTACTTCTTTCAGCCCACCAATTTTTGAGCTCTTATCTCTGCTAATTGTCTATTGTTTTTGGAGAATCATAGCAAAATCTATAAACAAAAGAGAGAAAAATACTGCCCCCGAGCCATCTGGGGCATGGCCACTCATCGGCCATTTGCCTCTGCTAAATGGCCAAGAACCAATTTGCAAAATACTTGGAGCATTGGCCGATAAATATGGGCCCATCTATTCTCTTAGACTTGGCAAGCATCCCATATTGATTGTGAGCAGTTGGGAAATTGTGAAGGATTGCTTCACTACCAATGACAGAATTCTGGCTACTAGGGCAAAAATTGTAGCAGGCAAGTTGATGGGTTATGACAACGCCATTTTTGCACTTGCTCCCTACGGTCCGTACTGGCGTGATATTCGCAAAATAGCCACCACAGAGCTTCTCTCAAGTCACCGGCTTGAATTGCTGAAGCACGTTCGCTACTCAGAAGTTGACACTTTCATCAAAGATTTGTACTCACTTTGCTCAGAAAACGCATTCAATCCTGCGAAGGTGGTGATCAGCAAGTTAATCGAGCAGTTGACTTTCAATATAAGCCTGAAACTGATAGCTGGGAAGCGATTTTCAGCTAAAGATTATGAGGAACAAGGCAGCGAGGCTTGGCGTATCAATAGAGCAATAAAAGAAGCAACGCACCTATTCGGGGTTTTCATCTTGGGAGATGCCATACCATGGCTTGAATGGATTGACTTTCAGGGTCATGTGGGATCTATGAAGAGTACTGCTAAGGAAATTGACGATGTGATCGGCAACTGGCTTAAAGAACGTCTTCAAAATAAATTACAGGGCGAAGGCCATAATGGTAAAGGTGACCTCATAGACGTGTTGCTTTCAAAACTGCAAGAAGATGCTGTGATGGGCGGACATACACGTGATACTGTCGTCAAAGCAACAGCTCTAATTTTAATCCTTACAGGCTCAGAAAGCACGTATCTTGGAATAATTTGGACAATGTCCCTGTTGTTGAACCACCCGAAAGAGCTGAAGAAGGCACAGGAAGAGTTGGACGTCCATGTTGGAAGAGATAGATGGGTAAACGAGTCAGATATGAAGAAACTAAAATACCTTCGAGCCATTGTCAAAGAAACTCTACGGATTTACCCACCGGGTCCTGTAACAGGAATTCGGGAAGCCATGGAAGATTGTGAAATTGGTGGTTATCATGTCCCGAAAGGCACGCGTTTGATCGTGAACATATGGAAGCTGCACAGAGACCCTCGGATGTGGGAAAATCCGTGCGAGTTCAGACCAGAAAGGTTTCTGACAACTCATGCTGATGTTGATGTCAACACTCAACATTTTGAGTATGTTCCGTTCAGCTTCGGAAGAAGATCGTGCCCTGGAATGACATCTGGCTTACAAATTGTTCAATTAACGCTTGCTCGGATTCTTCAGGGGTTTGATTTGGCAACCGTGGGGGGCACACCTGTTGATATGCAGATTGGTTTGGGCCTTGCCTTGCCCAAATCGAACCCTCTTGAAGTTATCATAAAACCTCGCCTCGCTGAGGATCTTTTTCGATGCATTTGA；
CsCYP1-F的序列(SEQ ID NO:3)为：
ATGGATTCTACTTCTTTCAGC；
CsCYP1-R的序列(SEQ ID NO:4)为：
TCAAATGCATCGAAAAAGATC。
实施例2细胞色素P450酶CsCYP1酵母体外表达催化TMTT和DMNT的合成
1、柑橘细胞色素P450酶CsCYP1酵母表达载体的构建
以实施例1中测序正确的质粒pMD18-T-CsCYP1为模板，利用引物对pYES2-CsCYP1-F和pYES2-CsCYP1-R进行PCR扩增，反应体系为：50μL体系，其中高保真Taq酶2×Phanta MaxMaster Mix(Dye Plus)25μL，pYES2-CsCYP1-F和pYES2-CsCYP1-R各2μL，质粒模板1μL，水20μL。PCR反应程序为：预变性95℃ 3min，变性95℃ 15s，退火50℃ 15s，延伸72℃ 1min 40s，循环35次，充分延伸72℃ 5min。然后琼脂糖电泳，利用DNA胶回收试剂盒(Tiangen)回收PCR产物，同时琼脂糖电泳回收用限制性内切酶BamHI(Takara)酶切pYES2载体(Invitrogen)得到的酶切产物，然后利用重组克隆试剂盒Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明书的操作将两部分回收产物进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌感受态DH5α中，于固体LB培养基(含50μg/mL氨苄霉素)上筛选培养。37℃过夜培养后挑取单克隆，对挑取的单克隆子用液体LB培养基(含50μg/mL氨苄霉素)扩大培养12h后，用质粒小量提取试剂盒(Tiangen)提取质粒，利用引物对pYES2-CsCYP1-F和pYES2-CsCYP1-R进行PCR验证阳性克隆后得到测序正确的用于蛋白表达的重组载体pYES2-CsCYP1。其中pYES2-CsCYP1-F和pYES2-CsCYP1-R的序列分别如下所示：
pYES2-CsCYP1-F的序列(SEQ ID NO:5)为：
CTTGGTACCGAGCTCGGATCCACAATGGATTCTACTTCTTTCAGC；
pYES2-CsCYP1-R的序列(SEQ ID NO:6)为：
GCGGCCGTTACTAGTGGATCCTCAAATGCATCGAAAAAGATC。
2、TMTT和DMNT的合成
(1)酶促反应：
将质粒pYES2-CsCYP1转化到酵母感受态INVSc1(Coolaber)中，同时转化pYES2空载作为对照，然后涂布于SD-Uracil固体培养基，在30℃培养箱培养3天。然后分别挑取pYES2-CsCYP1和pYES2酵母转化子的单克隆，在3mL SD-Uracil液体培养基中培养24-48h，而后在50mL SD-Uracil液体培养基中扩大培养，当培养至OD600＝0.6时，3000rpm/min离心5min去上清，用50mL无菌水重悬菌体，3000rpm/min离心5min去上清。用无菌水重复洗涤3次后，菌体用50mL SC-Uracil液体培养基(碳源为30％半乳糖和棉子糖)重悬，然后分别加入20μL 1mM的橙花叔醇【(3S)-(E)-Nerolidol】、20μL 10mM的香叶基芳樟醇【(3RS)-(E,E)-geranyllinalool】，菌液在30℃，180rpm/min条件下培养12h，诱导CsCYP1蛋白表达并催化底物反应。培养12h后，用SPME纤维素头(100μmpolydimethylsiloxane fiber，Supelco)插入到菌液中，吸附收集产物1h，然后进行GC-MS测定。
(2)GC-MS测定：
将SPME纤维素头插入到连接着气相色谱柱(DB-5,60m×0.25mm,film thickness0.25μm,J&W Scientific,Folsom,CA,USA)的进样孔中进行不分流进样，持续5min；温度梯度先从50℃(保持5min)以3℃/min的速度递增至210℃，然后从210℃以10℃/min的速度递增至230℃，最后从230℃以10℃/min的速度递增至280℃。检测器温度设置为250℃。
GC-MS检测结果如图1和图2所示，在酵母异源表达的细胞色素P450酶CsCYP1可以分别利用香叶基芳樟醇和橙花叔醇作为底物，催化TMTT(图1)和DMNT(图2)的合成。
由于TMTT和DMNT这两种物质能够在植物受植食性昆虫侵害后诱导产生，具有诱导邻近植物防御反应和趋避害虫的功能，也可以吸引相应的害虫天敌前来从而达到控制害虫的作用。因此，可以通过酶促反应的方式合成TMTT和DMNT，并通过向柑橘喷施TMTT和DMNT等方式从而避免柑橘受到害虫的危害。也可以将携带CsCYP1基因的植物过表达载体通过转基因技术导入柑橘的愈伤组织或上胚轴中，创制出TMTT和DMNT这两种萜烯同系物高表达的植株，为柑橘害虫的绿色防控提供新的思路和方法。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 广东省农业科学院果树研究所
<120> 一种细胞色素P450酶及其编码基因CsCYP1与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 525
<212> PRT
<213> P450酶(Citrus sinensis (L.) Osbeck)
<400> 1
Met Asp Ser Thr Ser Phe Ser Pro Pro Ile Phe Glu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ile Val Tyr Cys Phe Trp Arg Ile Ile Ala Lys Ser Ile Asn Lys
20 25 30
Arg Glu Lys Asn Thr Ala Pro Glu Pro Ser Gly Ala Trp Pro Leu Ile
35 40 45
Gly His Leu Pro Leu Leu Asn Gly Gln Glu Pro Ile Cys Lys Ile Leu
50 55 60
Gly Ala Leu Ala Asp Lys Tyr Gly Pro Ile Tyr Ser Leu Arg Leu Gly
65 70 75 80
Lys His Pro Ile Leu Ile Val Ser Ser Trp Glu Ile Val Lys Asp Cys
85 90 95
Phe Thr Thr Asn Asp Arg Ile Leu Ala Thr Arg Ala Lys Ile Val Ala
100 105 110
Gly Lys Leu Met Gly Tyr Asp Asn Ala Ile Phe Ala Leu Ala Pro Tyr
115 120 125
Gly Pro Tyr Trp Arg Asp Ile Arg Lys Ile Ala Thr Thr Glu Leu Leu
130 135 140
Ser Ser His Arg Leu Glu Leu Leu Lys His Val Arg Tyr Ser Glu Val
145 150 155 160
Asp Thr Phe Ile Lys Asp Leu Tyr Ser Leu Cys Ser Glu Asn Ala Phe
165 170 175
Asn Pro Ala Lys Val Val Ile Ser Lys Leu Ile Glu Gln Leu Thr Phe
180 185 190
Asn Ile Ser Leu Lys Leu Ile Ala Gly Lys Arg Phe Ser Ala Lys Asp
195 200 205
Tyr Glu Glu Gln Gly Ser Glu Ala Trp Arg Ile Asn Arg Ala Ile Lys
210 215 220
Glu Ala Thr His Leu Phe Gly Val Phe Ile Leu Gly Asp Ala Ile Pro
225 230 235 240
Trp Leu Glu Trp Ile Asp Phe Gln Gly His Val Gly Ser Met Lys Ser
245 250 255
Thr Ala Lys Glu Ile Asp Asp Val Ile Gly Asn Trp Leu Lys Glu Arg
260 265 270
Leu Gln Asn Lys Leu Gln Gly Glu Gly His Asn Gly Lys Gly Asp Leu
275 280 285
Ile Asp Val Leu Leu Ser Lys Leu Gln Glu Asp Ala Val Met Gly Gly
290 295 300
His Thr Arg Asp Thr Val Val Lys Ala Thr Ala Leu Ile Leu Ile Leu
305 310 315 320
Thr Gly Ser Glu Ser Thr Tyr Leu Gly Ile Ile Trp Thr Met Ser Leu
325 330 335
Leu Leu Asn His Pro Lys Glu Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Leu Asp
340 345 350
Val His Val Gly Arg Asp Arg Trp Val Asn Glu Ser Asp Met Lys Lys
355 360 365
Leu Lys Tyr Leu Arg Ala Ile Val Lys Glu Thr Leu Arg Ile Tyr Pro
370 375 380
Pro Gly Pro Val Thr Gly Ile Arg Glu Ala Met Glu Asp Cys Glu Ile
385 390 395 400
Gly Gly Tyr His Val Pro Lys Gly Thr Arg Leu Ile Val Asn Ile Trp
405 410 415
Lys Leu His Arg Asp Pro Arg Met Trp Glu Asn Pro Cys Glu Phe Arg
420 425 430
Pro Glu Arg Phe Leu Thr Thr His Ala Asp Val Asp Val Asn Thr Gln
435 440 445
His Phe Glu Tyr Val Pro Phe Ser Phe Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly
450 455 460
Met Thr Ser Gly Leu Gln Ile Val Gln Leu Thr Leu Ala Arg Ile Leu
465 470 475 480
Gln Gly Phe Asp Leu Ala Thr Val Gly Gly Thr Pro Val Asp Met Gln
485 490 495
Ile Gly Leu Gly Leu Ala Leu Pro Lys Ser Asn Pro Leu Glu Val Ile
500 505 510
Ile Lys Pro Arg Leu Ala Glu Asp Leu Phe Arg Cys Ile
515 520 525
<210> 2
<211> 1578
<212> DNA/RNA
<213> CsCYP1基因(Citrus sinensis (L.) Osbeck)
<400> 2
atggattcta cttctttcag cccaccaatt tttgagctct tatctctgct aattgtctat 60
tgtttttgga gaatcatagc aaaatctata aacaaaagag agaaaaatac tgcccccgag 120
ccatctgggg catggccact catcggccat ttgcctctgc taaatggcca agaaccaatt 180
tgcaaaatac ttggagcatt ggccgataaa tatgggccca tctattctct tagacttggc 240
aagcatccca tattgattgt gagcagttgg gaaattgtga aggattgctt cactaccaat 300
gacagaattc tggctactag ggcaaaaatt gtagcaggca agttgatggg ttatgacaac 360
gccatttttg cacttgctcc ctacggtccg tactggcgtg atattcgcaa aatagccacc 420
acagagcttc tctcaagtca ccggcttgaa ttgctgaagc acgttcgcta ctcagaagtt 480
gacactttca tcaaagattt gtactcactt tgctcagaaa acgcattcaa tcctgcgaag 540
gtggtgatca gcaagttaat cgagcagttg actttcaata taagcctgaa actgatagct 600
gggaagcgat tttcagctaa agattatgag gaacaaggca gcgaggcttg gcgtatcaat 660
agagcaataa aagaagcaac gcacctattc ggggttttca tcttgggaga tgccatacca 720
tggcttgaat ggattgactt tcagggtcat gtgggatcta tgaagagtac tgctaaggaa 780
attgacgatg tgatcggcaa ctggcttaaa gaacgtcttc aaaataaatt acagggcgaa 840
ggccataatg gtaaaggtga cctcatagac gtgttgcttt caaaactgca agaagatgct 900
gtgatgggcg gacatacacg tgatactgtc gtcaaagcaa cagctctaat tttaatcctt 960
acaggctcag aaagcacgta tcttggaata atttggacaa tgtccctgtt gttgaaccac 1020
ccgaaagagc tgaagaaggc acaggaagag ttggacgtcc atgttggaag agatagatgg 1080
gtaaacgagt cagatatgaa gaaactaaaa taccttcgag ccattgtcaa agaaactcta 1140
cggatttacc caccgggtcc tgtaacagga attcgggaag ccatggaaga ttgtgaaatt 1200
ggtggttatc atgtcccgaa aggcacgcgt ttgatcgtga acatatggaa gctgcacaga 1260
gaccctcgga tgtgggaaaa tccgtgcgag ttcagaccag aaaggtttct gacaactcat 1320
gctgatgttg atgtcaacac tcaacatttt gagtatgttc cgttcagctt cggaagaaga 1380
tcgtgccctg gaatgacatc tggcttacaa attgttcaat taacgcttgc tcggattctt 1440
caggggtttg atttggcaac cgtggggggc acacctgttg atatgcagat tggtttgggc 1500
cttgccttgc ccaaatcgaa ccctcttgaa gttatcataa aacctcgcct cgctgaggat 1560
ctttttcgat gcatttga 1578
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> CsCYP1-F(Artificial Sequence)
<400> 3
atggattcta cttctttcag c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> CsCYP1-R(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaaatgcat cgaaaaagat c 21
<210> 5
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> pYES2-CsCYP1-F(Artificial Sequence)
<400> 5
cttggtaccg agctcggatc cacaatggat tctacttctt tcagc 45
<210> 6
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> pYES2-CsCYP1-R(Artificial Sequence)
<400> 6
gcggccgtta ctagtggatc ctcaaatgca tcgaaaaaga tc 42
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