本发明公开了一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法和应用,属于基因工程和生物催化领域。具体涉及一种新型α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列和编码基因、含有上述基因的重组载体和重组微生物、利用上述重组微生物发酵制备α-L-鼠李糖苷酶的方法以及所述α-L-鼠李糖苷酶在水解薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用。本发明提供的α-L-鼠李糖苷酶可以特异性水解植物黄姜中甾体皂苷C-(3)位置外侧α-L-1,2-鼠李糖苷键,具有催化效率高、热稳定性好、糖耐受性高等优点。此外,在所述α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的共催化下,黄姜粗提物中的甾体皂苷几乎完全转化为薯蓣皂素,转化率高达98.5%,表明其在规模化皂素生产中具有良好的应用前景。