7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A

文档序号：30185 发布日期：2021-09-24 浏览：25次 >En<

阅读说明：本技术 7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A (Mutants of 7 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase St-2-2T15G, T15S and T15A ) 是由祝连彩潘银平唐士金王伯初于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及羟基类固醇脱氢酶,具体涉及7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A。所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2,3或4所示,是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的7α-羟基类固醇脱氢酶的第15位氨基酸由Thr定点突变为Gly、Ser或Ala所得。所述突变体在相同底物TCDCA和NADP～(+)的存在下,酶活分别是野生型的3.18、4.27、7.85倍,在生物转化TCDCA获取TUDCA的过程中具有巨大的应用潜力。(The invention relates to hydroxysteroid dehydrogenase, in particular to mutants T15G, T15S and T15A of 7 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase St-2-2. The amino acid sequence of the mutant is shown as SEQ ID NO. 2, 3 or 4, and the mutant is obtained by the site-specific mutagenesis of Thr to Gly, Ser or Ala at the 15 th amino acid of 7 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase of which the amino acid sequence is SEQ ID NO. 1. The mutant has the same substrates TCDCA and NADP + In the presence of (2), the enzyme activities are respectively 3.18, 4.27 and 3.18 of wild type,7.85 times, has great application potential in the process of obtaining TUDCA by biotransformation of TCDCA.)

技术领域

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A。

背景技术

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性，还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-HSDH联合差向异构转化鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)。

HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。然而，活性更高的HSDH改造体是其在生物转化领域进一步应用的基本保障。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有8个，它们分别来自于Bacteroides fragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridiumabsonum、Stenotrophomonas maltophilia、Eubacterium sp.VPI 12708、Clostridiumdifficile和Escherichia coli；来自Clostridium absonum和Collinsella aerofaciens的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。上述双酶偶联构建的生物转化体系不但克服了辅酶循环难题，还实现了氧化、还原“一锅式”进行特定化学区域的羟基差向异构。

酶的活性较低是限制其工业应用的主要因素之一，几乎所有的天然酶都需要经过改造后才能达到工业应用的要求。申请号为2019106381160，发明名称为“7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用”的中国专利申请中公布了一种7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2，该酶对TCDCA、GCDCA的催化活性优于本课题组前期发现的5个7α-HSDHs。目前，尚未见到关于该酶第15位氨基酸改造的相关报道。

发明内容

为进一步提高酶催化效率，本发明提供一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2，3或4所示，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的7α-羟基类固醇脱氢酶的第15位氨基酸由Thr变为Gly、Ser或Ala所得。

编码所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因也属于本发明的保护范围。

在本发明的优选实施例中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，7或8所示。

包含所述基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述载体，可以是克隆载体，包含任一所述的7α-HSDH St-2-2突变体的编码基因以及质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含任一所述的7α-HSDH St-2-2突变体的编码基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了突变体基因的pGEX-6p-2载体。

所述重组菌，可以是包含克隆载体的重组菌，例如E.coli DH5α，通过培养细胞使细胞内的7α-HSDH St-2-2突变体基因得到复制；也可以是包含表达载体的细胞，例如E.coli BL21，在适当的条件下培养细胞，例如，加入适量的IPTG，16℃诱导7α-HSDH St-2-2突变体蛋白的表达。

本发明还提供所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备方法，包括如下步骤：合成所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达并纯化。

在本发明的一些实施例中，所述制备方法中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，7或8所示。

本发明还提供一种催化剂，其有效成分包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。所述催化剂的有效成分包含7α-HSDH St-2-2突变体T15G、T15S和T15A中的1种、2种或3种。所述催化剂可以单独使用，也可以与其它适合的催化剂同时使用，以提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。

所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或所述催化剂在羰基不对称还原反应中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种实现化学物质的羰基不对称还原的方法，其使用所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或所述催化剂与反应底物进行催化反应；所述反应底物为牛磺鹅去氧胆酸或甘氨鹅去氧胆酸，或含有牛磺鹅去氧胆酸或甘氨鹅去氧胆酸的胆汁酸组分。

在本发明的一些实施例中，所述催化反应在室温下，在pH 8.0、50mM Tris-HCl中进行。

在酶突变体的开发过程中，我们首先对7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2(简称为7α-HSDH St-2-2)进行了序列分析，发现7α-HSDH St-2-2拥有N-末端辅酶结合位点的保守区域(Gly-X-X-X-Gly-X-Gly)，并确定了第15位氨基酸(苏氨酸)是影响7α-HSDH St-2-2酶学性质的位点。然后通过密码子替换将第15位的苏氨酸分别变为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸，并利用PCR技术克隆获得了7α-HSDH St-2-2突变体T15G、T15S和T15A的编码基因。最后通过构建突变体基因的GST融合表达载体并导入基因工程菌E.coli BL21中诱导表达，获得了突变体酶蛋白。酶活测定结果显示，与野生型7α-HSDH St-2-2相比，突变体的催化效率显著提高。在相同底物TCDCA和NADP⁺存在下，7α-HSDH St-2-2突变体T15G、T15S和T15A的酶活分别是野生型的3.18、4.27、7.85倍。在相同底物GCDCA和NADP⁺的存在下，7α-HSDH St-2-2突变体T15G、T15S和T15A的酶活分别是野生型的2.27、2.91、4.68倍。因此，本发明提供的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体在生物转化TCDCA获取TUDCA的过程中具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1.7α-HSDH、7β-HSDH联合转化TCDCA制备TUDCA的示意图。

图2.7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2突变体T15G、T15S和T15A的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质分子量标准(Marker)；泳道1、2、3分别为T15G、T15S和T15A突变体蛋白，分子量大小为28.2kDa。

图3.野生型7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质分子量标准(Marker)；St-2-2为野生型7α-HSDH St-2-2蛋白，分子量大小为28.2kDa。

图4.NADPH的标准曲线；其中，横坐标为NADPH溶液的浓度(mM)，纵坐标为NADPH溶液在340nm处的光吸收值。

图5.野生型7α-HSDH St-2-2与突变体的相对酶活(以TCDCA为底物)，其中，St-2-2代表野生型，T15G、T15S和T15A为突变体。

图6.野生型7α-HSDH St-2-2与突变体的相对酶活(以GCDCA为底物)，其中，St-2-2代表野生型，T15G、T15S和T15A为突变体。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中所使用的野生型7α-HSDH St-2-2基因是本实验室前期以黑熊粪便样品的总DNA为模板，采用PCR技术克隆所得，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其基因序列如SEQ ID NO:5所示。该基因的分离方法已经在申请号为2019106381160，发明名称为“7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用”的专利申请文本中公开，通过引用将该专利申请的全部内容并入本文。该野生型7α-HSDH St-2-2基因也可以通过基因合成的方法获得。

以下实施例中所使用的pGEX-6p-2载体为大肠杆菌蛋白表达载体，购买自上海生工生物科技有限公司；载体大小为4985bp，载体标签为N-GST，载体抗性为Ampicillin。

以下实施例中所使用的感受态细胞：

Trans5α感受态细胞，购买自全式金生物技术有限公司，货号：CD201-01。

E.coli BL21感受态细胞，购买自全式金生物技术有限公司，货号：CD601。

以下实施例中所使用的主要试剂：

Prime STAR Max Premix(2×)，购买自宝生物科技有限公司(大连)，货号：R045A。BamH I限制性内切酶，购买自宝生物科技有限公司(大连)，货号：1010S。Xho I限制性内切酶，购买自宝生物科技有限公司(大连)，货号：1094S。T4 DNA Ligase，购买自宝生物科技有限公司(大连)，货号：2011A。PBS缓冲液干粉，购买自北京索莱宝科技有限公司，货号：P1010。Glutathione Sepharose 4B，购买自GE Healthcare，货号：10223836。PreScissionProtease酶，购买自GenScript公司，货号：Z02799-100。BCA试剂盒，购买自Beyotime公司，货号：P0006。NADPH，购买自Sigma-Aldrich公司，CAS号：2646-71-1，货号：10621692001。NADP⁺，购买自Sigma-Aldrich公司，CAS号：53-59-8，货号：N5755。TCDCA(牛磺鹅去氧胆酸)，购买自百灵威科技公司，CAS号：6009-98-9，货号330776。GCDCA(甘氨鹅去氧胆酸)，购买自上海麦克林生化科技有限公司，CAS号：16564-43-5，货号：G835599。

以下实施例中所使用的LB培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH 7.4。配制方法为：在950mL ddH₂O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节pH为7.4，用ddH₂O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。

以下实施例中所使用的反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)的配制方法为：取6.057gTris固体粉末溶于1L去离子水中，用盐酸调pH到8.0，室温放置备用。

若未特别说明，以下实施例中所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例中所使用的方法均为本领域常规方法，可参考相关实验手册或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1.7α-羟基类固醇脱氢酶(St-2-2)突变体的获得

1.突变体设计

野生型7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的氨基酸序列(262aa)如下：

MKRVENKVALVTSSTRGIGLAIAKTLAKEGARVYLAVRRLDAGQEVANEIIAEGGFAKPVYFDASKVETHMSMIEEVVEAEGRIDILVNNYGSTDVQKDLDLVHGDTEAFFNIVNQNLESVYLPCKVAVPYMIKNGGGSIINISTIGSVNPDLGRIAYVVSKAAINALTQNIAVQYAKKGIRCNAVLPGLIATDAALNNMSEEFLEHFLRHVPLDRTGHPQDIANAVLFFASDESSYITGTLQEVAGGFGMPSPIYGDAVKK(SEQ ID NO:1)。

野生型7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的基因序列(789bp)如下：

ATGAAAAGAGTAGAAAATAAAGTAGCATTAGTCACATCTTCTACAAGAGGGATTGGACTTGCTATTGCTAAAACACTTGCTAAAGAAGGTGCACGTGTATACCTTGCAGTAAGAAGATTAGATGCAGGTCAGGAGGTAGCGAATGAAATTATTGCAGAAGGTGGATTTGCTAAGCCTGTTTACTTTGATGCTTCTAAAGTAGAGACACACATGAGTATGATTGAAGAAGTAGTTGAAGCTGAAGGACGTATAGATATTTTAGTCAATAATTATGGTTCAACAGACGTTCAAAAGGACTTAGATCTCGTACATGGAGATACAGAAGCTTTCTTTAATATTGTTAATCAAAATCTTGAAAGTGTTTACTTACCATGTAAGGTGGCGGTACCTTATATGATTAAAAATGGTGGAGGAAGCATTATTAACATTTCTACAATTGGTTCAGTAAACCCTGACCTTGGACGTATTGCTTATGTTGTATCTAAAGCAGCTATCAACGCGCTTACACAAAATATTGCAGTTCAGTATGCAAAAAAAGGGATAAGATGTAATGCTGTTCTTCCAGGTCTTATTGCTACGGATGCAGCCCTTAATAATATGTCAGAGGAGTTCTTAGAACATTTCTTAAGACATGTACCACTTGACCGTACAGGGCATCCTCAAGATATTGCTAATGCAGTACTTTTCTTTGCAAGTGATGAATCTTCTTATATTACAGGTACACTTCAAGAAGTAGCAGGTGGATTTGGTATGCCATCACCTATTTATGGGGATGCTGTTAAGAAATAA(SEQ ID NO:5)。

我们通过序列分析发现7α-HSDH St-2-2拥有N-末端辅酶结合位点的保守区域(Gly-X-X-X-Gly-X-Gly)，即Ser13，Ser14，Thr15，Arg16，Gly17，Ile18和Gly19的位点；通过分子对接发现在7α-HSDH St-2-2中Thr15与辅酶II腺嘌呤核糖2’-磷酸基之间具有相互作用，位阻较小的丙氨酸、甘氨酸对于底物TCDCA的催化活性更好，可能更有利于底物TCDCA的进出，因此，确定了第15位氨基酸(苏氨酸)是影响7α-HSDH St-2-2酶学性质的位点，该位点对应7α-HSDH St-2-2基因序列的第43-45位密码子。

将野生型7α-HSDH St-2-2基因序列的第43-45位密码子由ACA分别更改为GGT、TCT、GCT，也就是将野生型7α-HSDH St-2-2氨基酸序列中第15位的苏氨酸分别替换成甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸，得到3个7α-HSDH St-2-2突变体，分别命名为T15G、T15S、T15A突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2～4所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6～8所示。

2.表达载体的构建

2.1突变体基因的获得

本实验以野生型7α-HSDH St-2-2基因为模板，采用定点突变引物，通过PCR法获得突变体基因。分别在T15G、T15S、T15A突变体基因序列的5’端引入酶切位点BamH I(GGATCC)，3’端引入酶切位点Xho I(CTCGAG)。引物的核苷酸序列如表1所示。委托SangonBiotech(中国，上海)公司进行引物合成。

表1 7α-HSDH St-2-2突变体基因的PCR引物

注：FP表示上游引物，RP表示下游引物。*所有突变体基因的下游引物均相同，X表示G、S或A。

PCR体系：

PCR条件：

采用回收试剂盒Cycle Pure Kit(OMEGA BIO-TEK，货号D6493)，根据试剂盒说明书记载的操作步骤回收PCR产物。

2.2酶切和连接

2.2.1酶切

利用BamH I和Xho I限制性内切酶分别对野生型7α-HSDH St-2-2基因、突变体基因和pGEX-6p-2质粒进行双酶切。

酶切体系：

酶切条件：37℃酶切3h(干浴)。

2.2.2双酶切产物回收

采用回收试剂盒Cycle Pure Kit(OMEGA BIO-TEK，货号D6493)，按照试剂盒说明书记载的操作步骤进行酶切产物回收，如下：

1)向每个离心管加入等体积的结合剂Binding Buffer，使之与酶切产物充分混匀后，吸入DNA微型柱的2mL收集管中，离心(10000×g，1min)。

2)向收集管加入300μL Binding Buffer，离心(14000×g，1min)。

3)加入700μL乙醇稀释的SPW Wash Buffer洗涤吸附柱，离心(14000×g，1min)，重复一次。

4)弃去液体，并将空的吸附柱离心(14000×g，2min)。

5)将收集管弃去，将DNA微型柱放在干净的纸上，开盖静置10min，充分挥发酒精。期间将一管无菌的ddH₂O预热至65℃备用。

6)将DNA微型柱放于已灭菌的1.5mL离心管中，加50μL加热到65℃的ddH₂O，于室温下放置1-2min，洗脱DNA，离心(14000×g，2min)。

7)测浓度。吸取2μL DNA溶液于超微量分光光度计中，测定DNA的浓度。(浓度单位：ng/μL，260/280：核酸含量)。

2.2.3线性化载体pGEX-6p-2与基因酶切产物的连接

使用T4 DNA连接酶，按照如下体系和条件进行连接。

连接反应条件：16℃连接过夜，得到如下连接产物：pGEX-6p-2/St-2-2、pGEX-6p-2/St-2-2T15G、pGEX-6p-2/St-2-2T15S、pGEX-6p-2/St-2-2T15A。

2.3连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞

1)培养基制备：配制适量的100mL Luria-Bertani琼脂培养基，121℃高压蒸汽灭菌30min，待培养基冷却至40-50℃，向其中加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。取适量培养基均匀地铺在无菌的培养皿中，然后放置于超净台上凝固。期间将-80℃冷冻保存的Trans5α感受态细胞(全式金，CD201-01)取出并迅速放在冰上，静置10min融化。

2)快速将Trans5α感受态细胞按照需求分装于无菌的1.5mL离心管中，加入10μL连接产物，在冰上静置30min。

3)于45℃热激45s。

4)快速将离心管转移到冰上放置2min(切勿晃动离心管)。

5)向其中加入无抗生素、无菌的Luria-Bertani液体培养基500μL，摇床培养，温度37℃，摇速180rpm，时间45min，复苏细胞。

6)吸取100μL左右菌液，涂布于Amp⁺抗性LB平板培养基上(Amp⁺终浓度为100μg/mL)，37℃过夜培养。

2.4阳性克隆筛选

1)挑取单菌落，接种于适量的无菌的含100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani液体培养基中，摇床培养，温度37℃，摇速220rpm。培养至OD₆₀₀大约为0.8-1。

2)保种：将菌液和25％无菌甘油按照2:1的体积比混匀后，液氮速冻，保存于-80℃冰箱中。

3)余下的菌液用于质粒提取。采用OMEGA Plasmid Mini Kit I(OMEGA BIO-TEK，D6943)按试剂盒说明书记载的操作步骤提取质粒，如下：

1)菌液生长至OD₆₀₀大约为0.8-1，8000rpm离心5min获取菌体。

2)弃上清液，并立即用200μL移液枪吸干残留液体，立即加入250μL Solution I(已加入RNA酶，并保存于4℃)，涡旋直至菌体沉淀完全悬浮。

3)将混匀的菌液加入1.5mL无菌离心管中，向离心管中加入同等体积的SolutionⅡ，缓慢的转动离心管彻底混匀样品，以获得澄清裂解液。立即向其中加入350μL SolutionⅢ，缓慢的转动离心管混合样品(出现白色絮状沉淀)，离心(4℃，13000×g，10min)。(注意这步必须在5min内完成，并且不能剧烈混合，否则染色体DNA断裂使得到的质粒纯度降低)。

4)用200μL移液枪小心吸取上清(确保没有吸入沉淀)，转移至装DNA微型柱的2mL收集管中。

5)离心(13000×g，1min)，弃滤液。

6)向收集柱中加入500μL Buffer HB，离心(13000×g，1min)，弃滤液。

7)向收集柱中加入700μL DNA Wash Buffer(已加入无水乙醇)，离心(13000×g，1min)，弃滤液，除杂。重复一次，弃液体。

8)离心(15000×g，2min)以甩干DNA微型柱，打开收集柱盖子，静置10min，使无水乙醇挥发干净。期间取一管无菌的ddH₂O预热到65℃。

9)将DNA微型柱置于无菌的1.5mL离心管中，加入50μL已经预热到65℃ddH₂O，室温静置2min，离心(15000×g，2min)。

10)测浓度。吸取2μL DNA溶液于超微量分光光度计，测定DNA的浓度。(浓度单位：ng/μL，260/280：核酸含量)。

2.5质粒的双酶切鉴定

酶切体系：

酶切条件：37℃酶切1.5h。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

2.6测序确认

选取双酶切鉴定正确的重组质粒送Sangon Biotech(中国，上海)公司测序，将测序结果正确的重组质粒作为7α-HSDH St-2-2野生型和7α-HSDH St-2-2T15G、7α-HSDH St-2-2T15S、7α-HSDH St-2-2T15A突变体的表达载体。

3.酶蛋白的GST融合异源表达

3.1表达载体转化E.coli BL21细胞

按照上述2.3(连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞)所述的转化方法将获得的表达载体转入E.coli BL21感受态细胞中，获得用于蛋白表达的重组菌。

3.2蛋白表达与纯化

1)接种100μL重组菌的菌液于400mL无菌LB培养基中，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃，180rpm摇床培养。

2)待OD₆₀₀≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，16℃诱导过夜(12h)。将菌液分装至高速离心瓶中，8000rpm离心5min，收集菌体。

3)按1L培养体系加30mL 50mM PBS的比例重悬菌体，4℃超声破菌至澄清。破碎的菌液均分至预冷到4℃的无菌的50mL离心管中12000rpm离心20min，离心沉降菌体，待离心结束后，用精密移液枪将上清转移到50mL无菌的离心管中。

4)取4mL Glutathione Sepharose 4B填料于亲和层析柱(GE Healthcare，货号10223836)中，用无菌的4℃预冷的50mM PBS冲洗3个柱体积，去除无水乙醇。将上清与Glutathione Sepharose 4B结合，4℃结合3h。轻轻垂直颠倒混悬。

5)结合完毕后，沉淀填料。滤掉上清，用无菌的4℃预冷的50mM PBS(含有体积分数为0.25％的吐温20)冲洗3到5个柱体积，再用无菌的4℃预冷的50mM PBS冲洗3个柱体积，去除杂蛋白，最后一次洗脱的时候每个亲和层析柱留下1mL 50mM PBS。

6)加入PreScission Protease酶(GenScript，货号Z02799-100)40-60μL。

7)4℃酶切过夜。酶切完毕后，将上清从层析柱中放出即为洗脱的7α-HSDH酶液。

8)将所得的酶液进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度，分子量约为28.2kDa，使用BCA试剂盒(Beyotime，货号P0006)按照试剂盒说明书测定纯化蛋白的浓度。将酶液和体积分数为80％的无菌甘油按照3:1的体积比混匀，并将含有甘油的酶液分装于无菌的1.5mL离心管中，然后保存于-80℃冰箱中。

9)使用后的Glutathione Sepharose 4B填料用6mol/L的盐酸胍浸泡20min，再用PBS大量冲洗填料后用20％乙醇浸泡填料，保存于4℃冰箱中。

SDS-PAGE检测结果显示，突变体酶蛋白和野生型酶蛋白的可溶性表达成功，并且经一步亲和层析后蛋白的条带单一(图2和图3)。纯化的T15G、T15S、T15A突变体酶蛋白的浓度分别是1.42mg/mL，1.31mg/mL，1.60mg/mL。纯化的野生型酶蛋白的浓度为1.59mg/mL。

实施例2.7α-羟基类固醇脱氢酶(St-2-2)突变体的酶活测定

1.NADPH标准曲线的制作

利用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)分别配制0mM，0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM的NADPH(Sigma-Aldrich，货号10621692001)溶液。用空白溶剂(50mM Tris-HCl，pH8.0)调零后将各个浓度的NADPH溶液分别加入2mL比色皿中，于室温下，在340nm测定光吸收值OD₃₄₀。以NADPH溶液的浓度为横坐标，对应的340nm光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。结果如图4所示，获得的标准曲线方程式为y＝2.7990x-0.001，R²＝0.9999。

2.酶活测定

1)用ddH₂O配置50mM NADP⁺(Sigma-Aldrich，货号N5755)，50mM TCDCA(百灵威科技，货号330776)，50mM GCDCA(麦克林，货号G835599)。

2)在2mL比色皿中首先加入1955μL反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)，再依次加入20μL 50mM NADP⁺辅酶溶液，再向其中加入5μL实施例1制备的酶蛋白溶液，充分混匀后在波长为340nm条件下调零，然后立即向混合液中加入20μL 50mM TCDCA(牛磺鹅去氧胆酸)或者20μL 50mM GCDCA(甘氨鹅去氧胆酸)底物溶液，充分吹打混匀，于室温，在340nm处记录30s内的光吸收变化，并根据NADPH的标准曲线计算产物的生成量。每个酶蛋白样品进行3次重复试验，结果取平均值。酶活单位定义为：相应条件下，每分钟转化1μmol TCDCA或GCDCA所需7α-HSDH的酶量定义为一个酶活单位U。酶的比活定义为：每毫克酶蛋白含有的活性单位数，单位为：U/mg。

3)酶活计算：将340nm处记录的30s内的光吸收变化值带入NADPH标准曲线y＝2.7990x-0.001，R²＝0.9999中计算30s时已转化底物浓度mmol/L。

Vt：反应总体积(mL)。

结果显示，在相同底物TCDCA和NADP⁺的存在下，7α-HSDH St-2-2突变体T15G、T15S、T15A的酶活分别是7α-HSDH St-2-2野生型的3.18、4.27、7.85倍(图5)。在相同底物GCDCA和NADP⁺的存在下，7α-HSDH St-2-2突变体T15G、T15S、T15A的酶活分别是7α-HSDHSt-2-2野生型的2.27、2.91、4.68倍(图6)。

序列表

<110> 重庆大学

<120> 7α-羟基类固醇脱氢酶St-2-2的突变体T15G、T15S和T15A

<130> P2130663-CQD-CQ-XDW

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Arg Val Glu Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Ser Ser Thr Arg

1 5 10 15

Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Lys Thr Leu Ala Lys Glu Gly Ala Arg

20 25 30

Val Tyr Leu Ala Val Arg Arg Leu Asp Ala Gly Gln Glu Val Ala Asn

35 40 45

Glu Ile Ile Ala Glu Gly Gly Phe Ala Lys Pro Val Tyr Phe Asp Ala

50 55 60

Ser Lys Val Glu Thr His Met Ser Met Ile Glu Glu Val Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Gly Arg Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Tyr Gly Ser Thr Asp Val

85 90 95

Gln Lys Asp Leu Asp Leu Val His Gly Asp Thr Glu Ala Phe Phe Asn

100 105 110

Ile Val Asn Gln Asn Leu Glu Ser Val Tyr Leu Pro Cys Lys Val Ala

115 120 125

Val Pro Tyr Met Ile Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Ile Asn Ile Ser

130 135 140

Thr Ile Gly Ser Val Asn Pro Asp Leu Gly Arg Ile Ala Tyr Val Val

145 150 155 160

Ser Lys Ala Ala Ile Asn Ala Leu Thr Gln Asn Ile Ala Val Gln Tyr

165 170 175

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180 185 190

Thr Asp Ala Ala Leu Asn Asn Met Ser Glu Glu Phe Leu Glu His Phe

195 200 205

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210 215 220

Asn Ala Val Leu Phe Phe Ala Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Ile Thr Gly

225 230 235 240

Thr Leu Gln Glu Val Ala Gly Gly Phe Gly Met Pro Ser Pro Ile Tyr

245 250 255

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260

<210> 2

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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Val Tyr Leu Ala Val Arg Arg Leu Asp Ala Gly Gln Glu Val Ala Asn

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Asn Ala Val Leu Phe Phe Ala Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Ile Thr Gly

225 230 235 240

Thr Leu Gln Glu Val Ala Gly Gly Phe Gly Met Pro Ser Pro Ile Tyr

245 250 255

Gly Asp Ala Val Lys Lys

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<210> 4

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

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Val Tyr Leu Ala Val Arg Arg Leu Asp Ala Gly Gln Glu Val Ala Asn

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Ile Val Asn Gln Asn Leu Glu Ser Val Tyr Leu Pro Cys Lys Val Ala

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Val Pro Tyr Met Ile Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Ile Asn Ile Ser

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Gly Asp Ala Val Lys Lys

260

<210> 5

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaaaagag tagaaaataa agtagcatta gtcacatctt ctacaagagg gattggactt 60

gctattgcta aaacacttgc taaagaaggt gcacgtgtat accttgcagt aagaagatta 120

gatgcaggtc aggaggtagc gaatgaaatt attgcagaag gtggatttgc taagcctgtt 180

tactttgatg cttctaaagt agagacacac atgagtatga ttgaagaagt agttgaagct 240

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gatctcgtac atggagatac agaagctttc tttaatattg ttaatcaaaa tcttgaaagt 360

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<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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