白桦脂酮酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用
阅读说明：本技术 白桦脂酮酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用 (Application of betulonic acid derivative in preparation of medicine for treating nervous system diseases ) 是由 陈广通 吴艳妮 徐天怡 陆游佳 范博义 宋妍 于 2021-09-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,公开了一类白桦脂酮酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。本发明利用微生物转化技术,对白桦脂酮酸成功地进行了结构修饰,获得了16个具有母核结构修饰的新型的化合物,通过体外神经小胶质细胞炎症试验证实,这些化合物具有较好的抗神经炎症活性,可以作为治疗神经退行性疾病、创伤性脑损伤、中风药物的活性成分,具有广泛的用途。(The invention belongs to the technical field of medicines, and discloses an application of betulonic acid derivatives in preparation of medicines for treating nervous system diseases. The invention successfully carries out structural modification on the betulonic acid by utilizing a microbial transformation technology to obtain 16 novel compounds with mother nucleus structural modification, and the compounds have better anti-neuritis activity and can be used as active ingredients of medicaments for treating neurodegenerative diseases, traumatic brain injury and stroke as proved by in vitro neuroglia cell inflammation tests, thereby having wide application.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及白桦脂酮酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用。
背景技术
随着老龄化加剧，神经退行性疾病、创伤性脑损伤及中风等神经系统疾病发病率逐年上升。目前临床药物只能缓解部分症状，不能有效地预防疾病的发生，改善患者认知状态和阻止疾病发展。寻找积极有效的治疗方法已经成为神经科学等相关学科刻不容缓的重任。在上述疾病的发生、发展过程中，大脑的神经细胞受损、缺失或死亡是其最基本的病理改变，常使神经功能严重受损而导致偏瘫、失语、智力障碍或昏迷，甚至死亡。有研究表明，在神经退行性疾病的发生与发展中，脑内始终存在着以胶质细胞激活为主要特征的炎症反应。因此，神经炎症在整个神经学领域的重要性越来越明显。
白桦脂酮酸又称桦木酮酸、路路通酸等，是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，主要来源于桦树的树皮,也存在于苹果、使君子、黄荆和黄杨等植物中。现代药理研究发现，白桦脂酮酸具有抗肿瘤、抗病毒和抗炎等生物活性，其中以抗黑色素瘤而闻名。白桦脂酮酸作为合成抗肿瘤药物的重要中间体白桦酸的氧化产物，也是药物化学研究的主要对象之一。现有技术中，化学结构修饰的位点主要为白桦脂酮酸3位的羰基和28位的羧基。由于五环三萜类化合物结构的特殊性，母核缺乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以对母核结构进行修饰，获得母核上具有羟基、羰基等修饰的衍生物，因此，具有母核结构修饰的白桦脂酮酸衍生物以及其化学和药理研究较少。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白桦脂酮酸衍生物在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，该白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐可用于制备治疗神经系统疾病药物。
本发明提供的技术方案如下：
一种如下任一结构式所示的白桦脂酮酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，
上述白桦脂酮酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：
1)发酵培养微生物，向培养基中加入白桦脂酮酸，培养基中白桦脂酮酸的浓度为2-5000μg/mL，接着进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为根霉，犁头霉，毛霉或共头霉属的菌株；
2)将所述发酵液经有机溶剂萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物，其中，有机溶剂优选乙酸乙酯；
3)转化粗提物经反相硅胶柱色谱，以甲醇：水作为流动相进行梯度洗脱，收集流份后经HPLC分析合并得5个组分，其中，梯度洗脱条件优选采用甲醇：水20:80-40:60-60:40-80:20-100:0；
4)将所述组分用反相高效液相色谱纯化，得到白桦脂酮酸衍生物。
进一步的，所述治疗神经系统疾病药物为修复神经损伤药物。
进一步的，所述治疗神经系统疾病药物为抗神经炎症药物。
进一步的，所述神经损伤包括神经退行性疾病、创伤或中风引起的中枢神经损伤。
进一步的，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森氏症、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化症。
进一步的，所述药物还含有药学上可以接受的辅料。
进一步的，所述药学上可接受的辅料为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明利用微生物转化技术，对白桦脂酮酸成功地进行了结构修饰，获得了一类新的白桦脂酮酸衍生物，通过神经细胞损伤保护试验和神经小胶质细胞炎症试验证实，这些化合物具有较好的神经细胞损伤修复及抗神经炎症活性，可以作为治疗神经退行性疾病、中风以及脑损伤等药物的活性成分，具有广泛的用途。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细描述。
实施例1、结构式为式Ⅰ-式XVI的化合物的制备
本发明采用微生物转化方法，以白桦脂酮酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。根霉(Rhizopus)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。
以少根根霉Rhizopus arrhizus CGMCC 3.868为例，制备结构式为式Ⅰ-式XVI的化合物的过程如下：
1)发酵、转化以及萃取
将少根根霉Rhizopus arrhizus CGMCC 3.868接入2个250mL三角瓶(装有100mL马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1mL的种子液，加入到20个1000mL摇瓶(装有400mL马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入20mg白桦脂酮酸(0.2mL，100mg/mL DMSO溶液)，共用400mg底物。相同条件下继续转化7天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.78g。
2)反相柱色谱分离
转化粗提物经反相硅胶柱色谱ODS-C18(100g，60×3cm，50μM)进行分离。甲醇：水梯度洗脱(20:80，40:60，60:40，80:20，100:0)。收集流份，经HPLC分析后合并，得合并组分A-E。
3)反相高效液相色谱纯化
合并组分A-E分别用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱YMC ODSA-5μm，10.0×250mm，乙腈-水(35:65，42:58，55:45，58:42，V/V)，流速2.5mL/min，检测波长203nm。得到结构式为式Ⅰ-式XVI的16个转化产物，其质谱和波谱数据如下所示。
化合物Ⅰ：7β-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-7β-acetoxy-lup-20(29)-en-28-oicacid)；熔点286–288℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3562,3029,2921,1741,1707,1693,1376,1214,1061cm-1；高分辨质谱m/z 511.3426[M–H]-(calcd.for C32H47O5,511.3423)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅱ：11α,15α-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-11α,15α-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点324–325℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3457,3035,2943,1745,1712,1382,1241,1076cm-1；高分辨质谱m/z 485.3264[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅲ：7β,11β-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,11β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点318–320℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3524,3041,2938,1742,1705,1365,1231,1086cm-1；高分辨质谱m/z 485.3266[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅳ：7β-羟基-30-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-30-acetoxy-7β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点304–305℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3481,3036,2952,1738,1715,1698,1388,1235,1057cm-1；高分辨质谱m/z 527.3372[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表1。
化合物Ⅴ：15α-羟基-30-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-30-acetoxy-15α-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点297–299℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3506,3041,2953,1748,1711,1695,1368,1227,1050cm-1；高分辨质谱m/z 527.3370[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅵ：30-过氧羟基白桦脂酮酸(3-oxo-30-hydroperoxyl-lup-28-oicacid)；熔点296–298℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3577,3039,2963,1735,1701,1371,1243,1075cm-1；高分辨质谱m/z 485.3264[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅶ：7β,23-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,23-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点322–324℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3497,3044,2962,1753,1712,1384,1207,1055cm-1；高分辨质谱m/z 509.3239[M+Na]+(calcd.for C30H46O5Na,509.3243)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅷ：7β,15α,23-三羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,15α,23-trihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点343–345℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3559,3035,2955,1751,1714,1379,1235,1033cm-1；高分辨质谱m/z501.3215[M–H]-(calcd.for C30H45O6,501.3216)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表2。
化合物Ⅸ：7β-羟基-23-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-23-acetoxy-7β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点311–312℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3543,3032,2941,1742,1715,1697,1376,1214,1028cm-1；高分辨质谱m/z 527.3373[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物Ⅹ：15α-羟基-23-乙酰氧基白桦脂酮酸(3-oxo-23-acetoxy-15α-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点305–306℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3537,3046,2938,1750,1712,1698,1384,1228,1031cm-1；高分辨质谱m/z 527.3376[M–H]-(calcd.for C32H47O6,527.3373)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物Ⅺ：2-羰基-3β,7β-二羟基白桦脂酮酸(2-oxo-3β,7β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点332–334℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3455,3046,2936,1724,1706,1388,1215,1024cm-1；高分辨质谱m/z485.3263[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物Ⅻ：2α,7β-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-2α,7β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点315–317℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3527,3046,2981,1746,1701,1382,1237,1022cm-1；高分辨质谱m/z 485.3262[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表3。
化合物XIII：7β,22β-二羟基白桦脂酮酸(3-oxo-7β,22β-dihydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)；熔点324–325℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3471,3053,2973,1757,1711,1379,1213,1027cm-1；高分辨质谱m/z 485.3261[M–H]-(calcd.for C30H45O5,485.3267)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
化合物XIV：20(S)-7β-羟基-29-乙酰氧基白桦脂酮酸(20(S)-3-oxo-7β-hydroxy-29-acetoxy-lup-28-oic acid)；熔点302–304℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3538,2963,1745,1713,1702,1369,1223,1033cm-1；高分辨质谱m/z 529.3531[M–H]-(calcd.for C32H49O6,529.3529)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
化合物XV：20(S)-7β-羟基-29-乙酰氧基白桦脂酮酸(20(R)-3-oxo-7β-hydroxy-29-acetoxy-lup-28-oic acid)；熔点311–313℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3533,2977,1744,1716,1701,1361,1227,1039cm-1；高分辨质谱m/z529.3533[M–H]-(calcd.for C32H49O6,529.3529)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
化合物XVI：7β-羟基白桦脂酮酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3-oxo-7β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid-β-D-glucopyranosyl ester)；熔点386–388℃；旋光度红外光谱主要的吸收峰(KBr)νmax：3575,3047,2967,1741,1709,1355,1237,1035cm-1；高分辨质谱m/z 631.3847[M–H]-(calcd.for C36H55O9,631.3846)；核磁共振氢谱和碳谱数据见表4。
表1.化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ和化合物Ⅳ的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
表2.化合物Ⅴ、化合物Ⅵ、化合物Ⅶ和化合物Ⅷ的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
表3.化合物Ⅸ、化合物Ⅹ、化合物Ⅺ和化合物Ⅻ的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
表4.化合物XIII、化合物XIV、化合物XV和化合物XVI的核磁氢谱和碳谱数据(氘代氯仿)
以上结果表明，所得化合物结构正确。
实施例2本发明化合物Ⅰ-XVI的抗神经炎症活性
1)实验材料
仪器与试剂：CO2培养箱(Jouan IGO150)；酶标仪(Bio-TEK ELx800)；荧光倒置显微镜(Olympus IX51)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、RPMI 1640培养基(Gibcol BRL)，神经小胶质细胞BV-2、Rnase A、胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)。
测试样品：白桦脂酮酸及实施例1所合成得到的化合物Ⅰ–Ⅳ，纯度在95％以上；同时，选取L-单甲基精氨酸(L-NMMA)为阳性对照药物，各化合物均以DMSO溶解后稀释。
2)实验方法
采用MTT法测定各受试化合物对神经小胶质细胞BV-2细胞活力的影响：取对数生长期的BV-2细胞，用含10％小牛血清及1％青霉素-链霉素双抗液的DMEM培养液，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔培养板，药物处理组和细胞对照组加入每孔100μL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，每孔100μL，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养72h。按MTT法于酶标仪，测定490nm的吸光度(A)值，计算抑制率[抑制率＝(1-实验组A值/对照组A值)×100％]。
采用Griess法测定各受试化合物对LPS诱导的BV-2细胞NO释放的影响：调整细胞浓度为2×105个/mL，接种于96孔培养板，每孔1mL细胞悬液，每组设3个复孔，空白对照组只加入DMEM全培养基，设3个复孔。将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱培养24h后，加入不同浓度的受试样品，使终浓度为0.1-100μM，继续培养12h后，取上清液，按试剂盒说明书操作，测定培养液中NO的水平。数据采用SPSS Statistics 25软件进行分析处理，计算各受试样品抑制NO释放的半数抑制浓度(IC50)。
3)实验结果
根据MTT法和Griess法测试结果，计算白桦脂酮酸及本发明化合物Ⅰ–XVI对LPS诱导的BV-2细胞NO释放的影响，结果如表5所示。
表5.测试样品抑制LPS诱导的BV-2细胞NO释放的结果
结果表明，本发明的化合物Ⅰ–XVI对BV-2均未见明显的细胞抑制作用，同时可显著降低由LPS诱导的BV-2细胞炎症因子NO的释放水平，具有良好的抗神经炎症活性，可以作为抗神经炎症药物的活性成分。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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