阅读说明：本技术 增加胰腺β细胞增殖的方法、治疗方法以及组合物 (Methods, treatment methods, and compositions for increasing pancreatic beta cell proliferation ) 是由 A·F·斯图尔特 C·阿克菲 P·王 B·戴维塔 于 2019-01-05 设计创作，主要内容包括：本文公开了增加胰腺β细胞群中细胞增殖的方法。还公开了治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法。还公开了包含DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂的组合物。本公开还描述了使移植患者的胰腺β细胞再生的方法。(Disclosed herein are methods of increasing cell proliferation in a pancreatic beta cell population. Also disclosed are methods of treating conditions associated with insufficient insulin secretion in a subject. Also disclosed are compositions comprising a DYRK1A inhibitor and a GLP1R agonist. The disclosure also describes methods of regenerating pancreatic beta cells in a transplant patient.)

增加胰腺β细胞增殖的方法、治疗方法以及组合物

本申请要求2018年1月5日提交的美国临时专利申请第62/614,136号的权益，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文中。

本发明在政府支持下在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款编号T32 GM062754、DK105015、DK105015-01A1S1、P30 DK 020541以及UC4 DK104211下进行。美国政府享有本发明的一定权利。

技术领域

描述了增加胰腺β细胞群中细胞增殖的方法、治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法以及包含双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体激动剂的组合物。

背景技术

糖尿病影响全球4亿2200万人，流行率日益提高(世界卫生组织全球糖尿病报告(World Health Organization Global Report on Diabetes)，2016)，并且最终是由功能性的产生胰岛素的β细胞的数目不足引起的(Butler等人，“患有糖尿病的人体内的β细胞缺陷和增加的β细胞凋亡(Beta Cell Deficit and Increased Beta Cell Apoptosis inHumans with Diabetes)”，《糖尿病(Diabetes)》52(1):102-110(2003)和Campbell-Thompson等人，“1型糖尿病自然病史中的胰岛炎和β细胞量(Insulitis and Beta CellMass in the Natural History of Type 1 Diabetes)”，《糖尿病》65(3):719-731(2016))。

1型和2型糖尿病最终都是由功能性的分泌胰岛素的胰腺β细胞的数目不足引起的。因此，替代人β细胞量和功能或使其再生是糖尿病研究的主要目标。令人遗憾地，已证实诱导成人β细胞复制具有挑战性：在儿童早期之后，人β细胞不能以治疗有效(relevant)速率复制，且已证实其对诱导其响应于药物、生长因子、营养素或其它方法而扩增的努力具有顽抗性(Gregg等人，“人β细胞群在胰岛内的形成在生命早期确定(Formation of a HumanBeta Cell Population within Pancreatic Islets is Set Early in Life)”，《临床内分泌学和代谢杂志(J.Clin.Endocrinol Metab.)》97(9):3197-3206(2012)和Wang等人，“针对糖尿病的人β细胞增殖中的进展和挑战(Advances and Challenges in Human BetaCell Proliferation for Diabetes)”，《自然评论·内分泌学(Nat.Rev.Endocrinol.)》11(4):201-212(2015))。

当前世界上最广泛开处的糖尿病药物中有直接或间接激活胰高血糖素样肽-1受体(“GLP1R”)的药物。GLP1R激动剂家族包括GLP1(7-36)自身、更稳定的爬行动物同系物艾塞那肽(exenatide)以及经修饰的艾塞那肽类似物，如利拉鲁肽(liraglutide)、利司那肽(lixisenatide)、索马鲁肽(semaglutide)和其它(Drucker DJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用(Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1)”，《细胞·代谢(Cell Metab.)》27(4):740-756(2018)和Guo X-H，“短效和长效胰高血糖素样肽激动剂在2型糖尿病管理中的价值：使用艾塞那肽的经验(TheValue of Short-and Long-Acting Glucagon-Like Peptide Agonists in theManagement of Type 2 Diabetes Mellitus:Experience with Exenatide)”，《当前医学研究与观点(Curr.Med.Res.Opin.)》32(1):1,67-76(2016))。这些GLP1R激动剂，和阻止内源性GLP1由酶二肽基肽酶IV(“DPP4”)降解的额外药剂(示例为西他列汀(sitagliptin)、维格列汀(vildagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)和其它(Drucker DJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用”，《细胞·代谢》27(4):740-756(2018)和Deacon等人，“用于治疗2型糖尿病的二肽基肽酶-4抑制剂：比较、功效和安全性(Dipeptidyl Peptidase-4Inhibitors for the Treatment of Type 2 Diabetes:Comparison,Efficacy andSafety)”，《药物治疗专家意见(Expert Opin.Pharmacother.)》14(15):2047-2058(2013))诱导啮齿动物β细胞增殖，但一直未能激活成人胰岛的β细胞复制(Parnaud等人，“分选的人和大鼠β细胞的增殖(Proliferation of Sorted Human and Rat Beta Cells)”，《糖尿病学(Diabetologia)》51(1):91-100(2008)和Dai等人，“由胰高血糖素样肽-1和钙调神经磷酸酶信号传导诱导的年龄相关人β细胞增殖(Age-Dependent Human Beta CellProliferation Induced by Glucagon-Like Peptide-1 and Calcineurin Signaling)”，《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》127(10):3835-3844(2017))。然而，所述药剂具有有益的“肠促胰岛素”效应，在血糖升高时诱导β细胞增强胰岛素分泌(Drucker DJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用”，《细胞·代谢》27(4):740-756(2018))。在当前情形下，尽管GLP1R激动剂未能诱导人β细胞增殖，但GLP1R具有受限的组织分布并且尤其在β细胞中高表达(Drucker DJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用”，《细胞·代谢》27(4):740-756(2018)；Pyke等人，“猴和人体组织中的GLP1受体定位：使用充分验证的单克隆抗体展现的新颖分布(GLP1 Receptor Localization in Monkey and Human Tissue:NovelDistribution Revealed With Extensively Validated Monoclonal Antibody)”，《内分泌学(Endocrinology)》155(4):1280-90(2014)；和Amisten等人，“人朗格汉斯岛中的G蛋白偶联受体的图谱和功能分析(An Atlas and Functional Analysis of G-ProteinCoupled Receptors in Human Islets of Langerhans)”，《药理学与治疗学(Pharmacol.Ther.)》139(3):359-391(2013))。因此，其提供了目前独特程度的β细胞特异性。

双特异性酪氨酸调节激酶1A(“DYRK1A”)是根据以下情境能够诱导人和啮齿动物β细胞增殖的信号传导级联的下游组分(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制(A High-Throughput Chemical Screen Revealsthat Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic BetaCell Replication)”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Gallo等人，“从细胞膜到细胞核的淋巴细胞钙信号传导(Lymphocyte Calcium Signaling from Membrane toNucleus)”，《自然·免疫学(Nat.Immunol.)》7(1):25-32(2006)；Heit等人，“钙调神经磷酸酶/NFAT信号传导调节胰腺β细胞生长和功能(Calcineurin/NFAT Signaling RegulatesPancreaticβ-cell Growth and Function)”，《自然(Nature)》443(7109):345-349(2006)；和Goodyer等人，“小鼠和人中新生β细胞发育受钙调神经磷酸酶/NFaT调节(Neonatal BetaCell Development in Mice and Humans is Regulated by Calcineurin/NFaT)”，《发育细胞(Dev.Cell)》23:21-34(2012))。细胞内钙的增加(例如，由葡萄糖、药物等诱导)引起钙调蛋白和钙调神经磷酸酶的依序激活，后者使名为活化T细胞核因子(“NFaT”)的转录因子细胞质池去磷酸化。这允许NfaT转位到细胞核，在细胞核中其反式激活细胞周期激活子基因并且阻遏细胞周期抑制子基因，引起β细胞增殖。核激酶DYRK1A充当这一过程上的“制动器(brake)”，重新使核NFaT磷酸化，迫使其离开细胞核，从而终止其促有丝***信号。去氢骆驼蓬碱类似物家族(“骆驼蓬碱类似物(harmalog)”)抑制DYRK1A，去除β细胞增殖的“制动器”，从而允许细胞周期进入。

DYRK1A抑制剂类别药物包括去氢骆驼蓬碱(harmine)(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015))、INDY(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015))、leucettine(Tahtouh等人，“衍生自海绵生物碱Leucettamine B的蛋白激酶抑制剂家族leucettine的选择性、共晶体结构和神经保护特性(Selectivity，Co-Crystal Structures and NeuroprotectiveProperties of Leucettines，a Family of Protein Kinase Inhibitors Derived fromthe Marine Sponge Alkaloid Leucettamine B)”，《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》55(21):9312-9330(2012))、GNF4877(Shen等人，“抑制DYRK1A和GSK3B诱导人β细胞增殖(Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation)”，《自然·通讯(Nat.Commun.)》6:8372(2015))、5-碘代杀结核菌素(“5-IT”)(Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖(Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta CellProliferation)”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016))；CC-401(Abdolazimi等人，“CC-401通过DYRK1A/B抑制的多效性结果促进β细胞复制(CC-401Promotes Beta CellReplication via Pleiotropic Consequences of DYRK1A/B Inhibition)”，《内分泌学》159(9):3143-3157(2018))，和其它(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Shen等人，“抑制DYRK1A和GSK3B诱导人β细胞增殖”，《自然·通讯》6:8372(2015)；Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016)；Abdolazimi等人，“CC-401通过DYRK1A/B抑制的多效性结果促进β细胞复制”，《内分泌学》159(9):3143-3157(2018)；Aamodt等人，“开发可靠自动化筛选系统以鉴别促进人β细胞再生的小分子和生物制剂(Development of a Reliable Automated Screening System to Identify SmallMolecules and Biologics that Promote Human Beta Cell Regeneration)”，《美国生理学杂志·内分泌学和代谢(AJP Endo.Metab.)》311:E859-68(2016)；和Wang等人，“人内分泌胰腺的单细胞质谱流式细胞术分析(Single Cell Mass Cytometry Analysis of HumanEndocrine Pancreas)”，《细胞·代谢》24(4):616-626(2016))。这些药物通过其诱导活化T细胞核因子(“NFaT”)核转位的能力诱导人β细胞的增殖，NFaT是随后反式激活细胞周期激活基因并且阻遏细胞周期抑制子基因的转录因子(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Shen等人，“抑制DYRK1A和GSK3B诱导人β细胞增殖”，《自然·通讯》6:8372(2015)；和Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016))。

尽管骆驼蓬碱类似物家族促有丝***的能力令人鼓舞，但仍存在两个难点。第一，通过Ki67或BrdU/EdUβ细胞标记指数评定，观察到的响应于去氢骆驼蓬碱家族的增殖速率在1-3％/天范围内(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Shen等人，“抑制DYRK1A和GSK3B诱导人β细胞增殖”，《自然·通讯》6:8372(2015)；Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016)；Aamodt等人，“开发可靠自动化筛选系统以鉴别促进人β细胞再生的小分子和生物制剂”，《美国生理学杂志·内分泌学和代谢》311:E859-68(2016)；和Wang等人，“人内分泌胰腺的单细胞质谱流式细胞术分析”，《细胞·代谢》24(4):616-626(2016))。尽管这模拟了正常幼年胰在生命第一年中所描述的生理增殖率(Gregg等人，“人β细胞群在胰岛内的形成在生命早期确定”，《临床内分泌学和代谢杂志》97(9):3197-3206(2012)和Wang等人，“针对糖尿病的人β细胞增殖中的进展和挑战”，《自然评论·内分泌学》11(4):201-212(2015))，但这一速率不大可能引起β细胞量减少了80-99％的患有1型糖尿病的人体内β细胞量的快速充满(Meier等人，“患有长期存在的1型糖尿病的患者体内的持续β细胞凋亡：胰岛再生的间接证据？(Sustained Beta Cell Apoptosis inPatients with Longstanding Type 1Diabetes:Indirect Evidence for IsletRegeneration？)”，《糖尿病学》48:2221-2228(2005)和Keenan等人，“患糖尿病50年后的残余胰岛素产生和β细胞更新：Joslin Medalist研究(Residual Insulin Production andBeta Cell Turnover after 50Years of Diabetes:Joslin Medalist Study)”，《糖尿病》59:2853(2010))。因此，期望更高的增殖速率。第二，去氢骆驼蓬碱家族的生物效应不限于β细胞的增殖：这一类别药物引起其它胰岛细胞类型(α细胞等)的增殖(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016)；和Wang等人，“人内分泌胰腺的单细胞质谱流式细胞术分析”，《细胞·代谢》24(4):616-626(2016))，并且由于钙-钙调蛋白-钙调神经磷酸酶-NFaT路径普遍存在，因此推测起来还引起其它细胞类型的增殖。此外，去氢骆驼蓬碱是CNS活性药物，具有众所周知的精神活性和致幻特性(Brierley等人，“去氢骆驼蓬碱药理学发展-南美卡皮木使用和药物依赖治疗意义(Developments in Harmine Pharmacology-Implications for Ayahuasca Useand Drug Dependence Treatment)”，《神经精神药理学与生物精神病学进展(Prog.Neuro-Psychopharmacol Biol.Psych.)》39:263-272(2012)和Heise等人，“南美卡皮木暴露：2005-2015年致电美国毒物控制中心协会的描述性分析(Ayahuasca Exposure:Descriptive Analysis of Call to US Poison Control Centers from 2005-2015)”，《医学毒理学杂志(J.Med.Toxicol.)》13:245-8(2017))。因此，需要鉴别将去氢骆驼蓬碱类别的促有丝***活性靶向或限于人β细胞的方法，限制脱靶不良影响。

使用GLP1R激动剂的组合疗法是否可进一步增强去氢骆驼蓬碱类别药物的促有丝***功效尚未得到研究。

本文所提供的公开内容涉及克服所属领域中的缺陷。

发明内容

本公开的一个方面涉及增加胰腺β细胞群中细胞增殖的方法。这一方法涉及使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触，其中所述接触在能有效引起所述胰腺β细胞群中细胞增殖协同增加的条件下进行。

本公开的另一方面涉及治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法。这一方法涉及向需要治疗胰岛素分泌水平不足相关病状的受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂，其中所述施用在能有效引起所述受试者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以治疗所述受试者胰岛素分泌水平不足。

本公开的另一方面涉及包含双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂的组合物。

本公开的又一方面涉及使移植患者的胰腺β细胞再生的方法。这一方法涉及向移植患者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂，其中所述施用在能有效引起所述移植患者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以使所述患者的胰腺β细胞再生。

本公开的另一方面涉及治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法。这一方法涉及向需要治疗胰岛素分泌水平不足相关病状的受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂，其中所述施用在能有效引起所述受试者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以治疗所述受试者胰岛素分泌水平不足。

最广泛开处的2型糖尿病药物中有GLP1R激动剂和DPP4抑制剂。尽管其增加来自β细胞的胰岛素分泌(Reimann等人，“作为2型糖尿病的新治疗靶标的G蛋白偶联受体(GProtein-Coupled Receptors as New Therapeutic Targets for Type 2Diabetes)”，《糖尿病学》59(2):229-233(2016)，其以全文引用的方式并入本文中)，但其未能增加人β细胞增殖(Drucker DJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用”，《细胞·代谢》27(4):740-756(2018)；Parnaud等人，“分选的人和大鼠β细胞的增殖”，《糖尿病学》51(1):91-100(2008)；和Dai等人，“由胰高血糖素样肽-1和钙调神经磷酸酶信号传导诱导的年龄相关人β细胞增殖”，《临床研究杂志》127(10):3835-3844(2017)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。DYRK1A的小分子抑制剂代表能够诱导成人β细胞增殖的首类药物，但速率不高(约2％/天)(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Shen等人，“抑制DYRK1A和GSK3B诱导人β细胞增殖”，《自然·通讯》6:8372(2015)；Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016)；Abdolazimi等人，“CC-401通过DYRK1A/B抑制的多效性结果促进β细胞复制”，《内分泌学》159(9):3143-3157(2018)；Aamodt等人，“开发可靠自动化筛选系统以鉴别促进人β细胞再生的小分子和生物制剂”，《美国生理学杂志·内分泌学和代谢》311:E859-68(2016)；和Wang等人，“人内分泌胰腺的单细胞质谱流式细胞术分析”，《细胞·代谢》24(4):616-626(2016)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。

下文描述将证明任何GLP1R激动剂与任何DYRK1A抑制剂组合出人意料地诱导人β细胞复制的协同速率(5-6％/天)并且增加人β细胞实际数目。协同作用需要DYRK1A抑制与cAMP增加的组合。治疗不引起β细胞去分化，并且提供先前未达成的人β细胞特异性程度。这些有益效应从正常人β细胞延伸到来源于患有2型糖尿病的人的β细胞。本公开证明这些效应不仅适用于正常人β细胞，而且适用于来自患有2型糖尿病的人的β细胞。

如本文出人意料地公开，通过将一大组当前广泛使用的直接(GLP1类似物)或间接(DPP4抑制剂)激活GLP1R的糖尿病药物中的任一种与具有口服活性的小分子DYRK1A抑制剂(如去氢骆驼蓬碱、INDY、leucettine、5-IT、GNF4877或其它)组合，人们能够诱导人β细胞复制的“速率”或“标记指数”。这些速率超过单独的DYRK1A抑制剂的速率，并且在人们可能设想为恢复患有2型糖尿病和或许1型糖尿病的人体内正常β细胞量所必需的范围内。人β细胞增殖标记物的增加伴有成人β细胞数目的实际增加。增殖的增加在严格药理学意义上具有协同性，并且甚至延伸到就其自身来说不具有增殖效应的去氢骆驼蓬碱和GLP1的剂量。

附图说明

图1A-1G展现DYRK1A抑制剂与GLP1R激动剂的组合产生人β细胞增殖的协同增加。图1A是显示指定的药物处理对经96小时处理并且针对Ki67和胰岛素免疫标记的分散人胰岛细胞的效应的图。“DMSO”指示0.1％浓度的对照载剂。条形物指示均值±SEM，并且条形物内的数字指示在各剂量下研究的人胰岛制备物的数目。对于每一条形物，对最少1000个β细胞进行计数。^*指示相对于单独的去氢骆驼蓬碱p<0.05，并且^**指示相对于单独的去氢骆驼蓬碱p<0.001。图1B显示图1A中所使用的Ki67和胰岛素免疫标记的实例。图1C是显示阴性对照的图，其展现对应于逐渐下降的人胰岛数目，FACS定量人β细胞的测数。图1D是显示第二阴性对照的图，其展现响应于用细胞介素处理(TNFα、IL1β和IFNγ各1000IU/ml)的人β细胞数目的减少。图1E是显示用载剂(0.1％DMSO)或去氢骆驼蓬碱(10μM)与GLP1(5nM)的组合处理的八个人胰岛制备物中的七个在处理96小时内人β细胞数目的增加的图。在图1C-1E中，^*指示p<0.05，^**p<0.001并且^***p<0.02。图1F是显示用如所指示联用或不联用GLP1的多种DYRK1A抑制剂处理分散人胰岛的结果的图。条形物指示均值±SEM，并且条形物内的数字指示在各剂量下研究的人胰岛制备物的数目。对于每一条形物，对最少1000个β细胞进行计数。在图1F-1G中，^#指示相对于单独的DYRK1A抑制剂p<0.025，并且^**指示相对于单独的去氢骆驼蓬碱p<0.01。注意，在各DYRK1A抑制剂情况下的增殖归一化为值1，并且GLP1组合以DYRK1A抑制剂增殖效应的函数表示，如图4中所详述。实际Ki67％值为：去氢骆驼蓬碱2.1％、INDY 1.7％、leucettine 2.8％、5-IT 2.6％以及GNF4788 2.9％。当施用GLP1 5nM时，这些值为近似两倍。图1G是显示用如所指示联用或不联用GLP1R激动剂的去氢骆驼蓬碱处理分散人胰岛的结果的图。数据如图1F中所表现；去氢骆驼蓬碱的实际Ki67％值是2.2％，因此来自各GLP1R激动剂的原始Ki67值是去氢骆驼蓬碱值的近似两倍。条形物指示均值±SEM，并且条形物内的数字指示在各剂量下研究的人胰岛制备物的数目。对于每一条形物，对最少1000个β细胞进行计数。*指示相对于单独的去氢骆驼蓬碱p<0.05，并且^**指示相对于单独的去氢骆驼蓬碱p<0.03。

图2显示图1A和3A的各个供体Ki67-胰岛素免疫标记数据。图2的呈现形式显示图1A和3A中所显示的二十个人胰岛供体对DMSO(0.1％)、去氢骆驼蓬碱(10μM)、GLP1(5nM)或GLP1-去氢骆驼蓬碱组合的增殖反应。粗黑条表示各处理条件的平均值。标准误差和统计显著性显示于图1A中。这张图突出显示了已熟知的不同人胰岛供体的响应性上的差异的反应性变化性。其还展现所显示的每个人胰岛供体响应于去氢骆驼蓬碱-GLP1组合的增强的增殖。

图3A-3E提供由去氢骆驼蓬碱-GLP1组合引起增殖的协同激活的额外证据。图3A是显示与图1A和图2中所显示的相同实验的结果的图，其被调整成使得Ki67⁺/胰岛素⁺细胞/总胰岛素⁺免疫标记细胞的百分比都相对于定义为“1”的去氢骆驼蓬碱组中的值归一化。由于并非每一人胰岛制备物都可在每一药物的每一剂量下分析，因此这允许对在相同人胰岛供体中进行的所有实验进行各数据集的调整。这一调整用于后续显示Ki67免疫标记的各个图。条形物指示均值±SEM。^*指示p<0.02并且^**指示p<0.001。各实验中所使用的胰岛供体的数目与图1A中相同。图3B是显示响应于所显示的条件，BrdU掺入到分散胰岛中β细胞中的图。在固定前18小时将BrdU添加到培养物中。条形物指示均值±SEM。条形物内或上方的数字指示用于各条件的人胰岛供体的数目。图3C是显示用对照载剂或10μM去氢骆驼蓬碱-5nMGLP1组合处理的人胰岛中的BrdU掺入的实例的图像。图3D-3E是显示与图1A和3A中所显示的相同类型实验的图，但使用较低剂量，3μM(图3D)和1μM(图3E)去氢骆驼蓬碱。同样，注意清楚的协同作用是显而易见的，尤其在图3E中，其中去氢骆驼蓬碱和GLP1几乎不诱导或不诱导增殖，但组合诱导与10μM去氢骆驼蓬碱剂量程度相同的增殖(2.7％)。条形物指示均值±SEM。条形物内或上方的数字指示用于各条件的人胰岛供体的数目。^*指示p<0.05并且^**指示p<0.01。

图4是显示单独或结合GLP1使用的DYRK1A抑制剂家族小分子的未调整的数据的图。这些是图1C中所显示的相同数据，显示成使得单独或与5nM GLP1组合的各DYRK1A抑制剂的效应能够可视化。

图5A-5H展现去氢骆驼蓬碱-GLP1协同作用需要对DYRK1A的抑制和β细胞cAMP的增加。图5A-5C是显示实验结果的图，其中增加cAMP的药剂(毛喉素(forskolin)、二丁酰基cAMP和磷酸二酯酶抑制剂异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和双嘧达莫(dipyridamole；DPD)在单独施用时对增殖无影响，但在与去氢骆驼蓬碱一起施用时可替代GLP1。图5D是显示实验结果的图，其中PKA抑制剂H89自身不产生影响，但阻断由去氢骆驼蓬碱和GLP1诱导的协同增殖。因此，协同作用部分由PKA介导。关于PKA和EPAC介导协同作用的额外证据，参见图5F-5H。图5E是显示PKA激活子6-bnz-cAMP对去氢骆驼蓬碱诱导的人β细胞增殖的影响的图。图5F是显示EPAC2激活子8-CPT-cAMP对去氢骆驼蓬碱诱导的增殖的影响的图。图5G是展现EPAC2是FACS分选的人β细胞中并且也是其它胰岛细胞类型中最丰富的EPAC的图(参见来自Wang等人，“通过整合人胰岛素瘤中的分子图谱获得的针对糖尿病的人β细胞再生的见解(Insights into Human Beta Cell Regeneration for Diabetes via Integration ofMolecular Landscapes in Human Insulinomas.)”《自然·通讯》8(1):767(2017)的RNA测序数据，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。相比之下，EPAC1仅略微可检测。图5H是显示EPAC2抑制剂ESI-05对去氢骆驼蓬碱组合的影响的图。在图5E、5F和5H中，条形物指示均值±SEM。条形物内或上方的数字指示用于各条件的人胰岛供体的数目。

图6A-6F显示关于DYRK1A-GLP1协同作用机制的额外信息。图6A是显示分散人胰岛经所指示处理的实验的结果的图。“GLP1”指示5nM GLP1，“Har”指示去氢骆驼蓬碱10μM，“Con.sh”指示表达针对β半乳糖苷酶的shRNA的对照腺病毒，并且“DYRK1A-sh”指示表达针对DYRK1A的shRNA的腺病毒，如先前(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)和图5E-5G和6D-6F(下文)中所描述。注意，以腺病毒方式沉默DYRK1A取得在GLP1和去氢骆驼蓬碱的情况下观察到的相同GLP1协同作用。图6B是显示图6A的逆实验的图。此处，DYRK1A cDNA或对照(Cre)以腺病毒方式(CMV启动子)在人胰岛中过表达。注意，DYRK1A过表达既阻断去氢骆驼蓬碱的效应，又阻断去氢骆驼蓬碱-GLP1组合的效应。图6C显示图6A-6B中胰岛素和Ki67的免疫标记的实例。图6D是显示四组分散人胰岛中DYRK1A的腺病毒过表达的定量PCR显示的结果的图。DYRK1A沉默使DYRK1A mRNA表达提高约25倍。图6E显示免疫组织化学，展现响应于Ad.DYRK1A，β细胞中蛋白质水平上的DYRK1A过表达。图6F是显示对人胰岛中DYRK1A进行腺病毒沉默使人胰岛中DYRK1A表达降低约80％的图。条形物指示均值±SEM。条形物内或上方的数字指示用于各条件的人胰岛供体的数目。^*指示p<0.01。在所有图中，条形物指示均值±SEM，并且分离的人胰岛的数目在条形物内显示。p值如所指示。如前面的附图，去氢骆驼蓬碱的值归一化为1.0，并且其它值以所述值的函数表示。

图7A-7B显示通过qPCR评估，载剂、5nM GLP1、10μM去氢骆驼蓬碱以及去氢骆驼蓬碱-GLP1组合对细胞周期分子的影响。图7A是显示暴露于四种条件后72小时对细胞周期激活子的影响的图。图7B显示对相同样品上细胞周期抑制子的影响。对于p15^INK4、p16^INK4、p18^INK4、p19^INK4、p21^CIP、p27^CIP以及p57^KIP，细胞周期抑制子的基因名称分别是CDKN2B、CDKN2A、CDKN2C、CDKN2D、CDKN1A、CDKN1B以及CDKN1C。条形物指示均值±SEM。条形物内或上方的数字指示用于各条件的人胰岛供体的数目。^*指示p<0.05并且^**指示p<0.005。

图8A-8C显示去氢骆驼蓬碱-GLP1处理维持或增强人β细胞分化。图8A是显示如使用qPCR评估，对照载剂(DMSO，0.1％)、GLP1 5nM、去氢骆驼蓬碱10μM或组合对β细胞分化的标记物的影响的图。条形物指示均值±SEM，并且条形物内或上方的数字指示在各条件下研究的人胰岛制备物的数目。^*指示相对于对照载剂处理p<0.05，并且^**指示相对于对照载剂处理p<0.008。图8B显示针对来自图8A中所显示的实验的PDX1、MAFA和NKX6.1对β细胞进行免疫标记的图像。注意，在去氢骆驼蓬碱或组合的情况下，每种都在β细胞核中增加。四种人胰岛制备物中的代表实验。图8C是显示在用载剂、GLP1(5nM)、去氢骆驼蓬碱(10μM)或组合处理72小时后，响应于低(2.8mM，灰色条形物)和高(16.8mM，黑色条形物)葡萄糖，来自四种不同供体的人胰岛的胰岛素分泌的图。数据表示为高葡萄糖刺激后胰岛素的增加倍数。胰岛素浓度(均值±SEM)在2.8mM葡萄糖对照(DMSO)孔中是19.9±9.1pmol/胰岛，并且在16.7mM葡萄糖下是33.3±12.6pmol/胰岛。

图9A-9E显示去氢骆驼蓬碱-GLP1组合对来自患有2型糖尿病(“T2D”)的人的β细胞的影响。图9A是显示联用或不联用GLP1的去氢骆驼蓬碱对如图8A中所显示的相同分化标记物的影响的图。去氢骆驼蓬碱或去氢骆驼蓬碱-GLP1组合对分化无不良影响。实际上，其似乎增加来自患有T2D的人的胰岛中的PDX1、MAFB、NKX6.1、GLUT2、GLP1R以及PCSK1。条形物指示均值±SEM，并且条形物内或上方的数字指示在各条件下研究的人胰岛制备物的数目。^*指示相对于对照载剂处理p<0.05，并且^**指示相对于对照载剂处理p<0.008。图9B呈现显示所示处理后分散人T2D胰岛的PDX1、MAFA和NKX6.1免疫标记的实例的图像。注意，所有三种都在β细胞内在蛋白质水平上增加。对于MAFA，即使图9A中不存在mRNA水平上的增加，增加也显而易见。图9C是显示在用载剂、GLP1、去氢骆驼蓬碱或组合预处理72小时的三种不同T2D胰岛制备物中响应于低(2.8mM，灰色条形物)和高(16.8mM，黑色条形物)葡萄糖的胰岛素分泌的图。数据表示为高葡萄糖刺激后胰岛素的增加倍数。平均胰岛素浓度在2.8mM葡萄糖对照(DMSO)孔中是18.1±3.2pmol/胰岛，并且在16.7mM葡萄糖下是32.2±4.6pmol/胰岛。误差条指示均值±SEM。^*指示相对于低葡萄糖p<0.01，^**指示相对于载剂处理，高葡萄糖响应p<0.02。图9D是显示响应于载剂、GLP1、去氢骆驼蓬碱或组合人T2Dβ细胞增殖的图。条形物指示均值±SEM，并且条形物内或上方的数字指示在各条件下研究的人胰岛制备物的数目。^*指示相对于载剂处理p<0.01，并且^**指示相对于单独的去氢骆驼蓬碱p＝0.02。图9E显示来源于患有T2D的供体的β细胞中的胰岛素和Ki67免疫标记的实例。

图10A-10D显示去氢骆驼蓬碱-GLP1组合对非β细胞的增殖和对β细胞死亡和DNA损伤的影响。图10A是显示响应于插图中所显示的处理，β(INS⁺)、α(GCG⁺)、δ(SST⁺)以及导管(CK19⁺)细胞中如使用BrdU标记评定的增殖的图。注意，去氢骆驼蓬碱激活所有四种细胞类型的增殖，如先前所报导(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)，并且GLP1加强含有GLP1受体的β细胞和导管细胞的这种增殖。条形物指示均值±SEM。条形物下方的数字指示用于各条件的人胰岛供体的数目。图10B显示响应于所示药剂人胰岛细胞亚型中BrdU免疫标记的实例。图10C是显示如通过TUNEL分析评定，去氢骆驼蓬碱-GLP1组合对细胞死亡的影响的图。第二条形物中的细胞因子混合液是阳性对照，并且含有如实施例(见下文)中所描述的IFNγ、TNFα和IL1β。条形物指示均值±SEM。条形物内的数字指示用于各条件的人胰岛供体的数目。图10D显示对图10C中所显示的条件的TUNEL反应的实例。

具体实施方式

公开了增加胰腺β细胞群中细胞增殖的方法、治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法以及包含双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A抑制剂和提高胰高血糖素样肽-1受体活性的药剂的组合物。

一个方面涉及增加胰腺β细胞群中细胞增殖的方法。该方法涉及使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和提高胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)活性的药剂接触，其中所述接触在能有效引起所述胰腺β细胞群中细胞增殖协同增加的条件下进行。提高GLP1R活性的合适药剂在下文中描述，并且包括(但不限于)GLP1R激动剂和DPP4抑制剂。

在进行该方法和本文所描述的其它方法时，胰腺β细胞可以是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞包括来自例如以下的细胞：小鼠、仓鼠、大鼠、奶牛、绵羊、猪、山羊、马、猴、狗(例如，家犬(Canis familiaris))、猫、兔、天竺鼠以及灵长类动物，包括人。举例来说，细胞可以是人胰腺β细胞。

根据一个实施例，“胰腺β细胞”是原代人胰腺β细胞。

在一个实施方案中，该方法和本文所描述的其它方法离体或在体内进行。离体进行时，可以通过从胰腺获得细胞并且在适用于体外或离体培养哺乳动物细胞(尤其人细胞)的液体培养基中培养细胞来提供细胞群。举例来说(但不受限制)，合适并且非限制性的培养基可基于市售培养基，如来自英杰(Invitrogen)的RPMI1640。

确定细胞是否具有胰腺β细胞表型的方法在所属领域中已知，并且包括(但不限于)用葡萄糖培育细胞并且测试细胞中的胰岛素表达是否提高或受诱导。其它方法包括测试β细胞特异性转录因子是否表达、借助于RNA定量PCR检测β细胞特异性基因产物、在糖尿病小鼠中移植候选细胞和在所述移植后对生理反应进行后续测试，以及用电镜分析细胞。

几种来自天然来源以及小分子药物发现项目的DYRK1A抑制剂已得到鉴别和表征。合适的DYRK1A抑制剂包括(但不限于)去氢骆驼蓬碱(harmine)、INDY、leucettine-41、5-碘代杀结核菌素(5-IT)、GNF4877、去氢骆驼蓬碱类似物、CC-401、噻二嗪激酶抑制剂和其它。其它合适的DYRK1A抑制剂包括(但不限于)GNF7156和GNF6324(Shen等人，“抑制DYRK1A和GSK3B诱导人β细胞增殖”，《自然·通讯》6:8372(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)。在进行本发明方法或形成本发明组合物时，可使用DYRK1A抑制剂的组合。在所有DYRK1A抑制剂中，去氢骆驼蓬碱和其类似物(β-咔啉)是迄今为止所涵盖的抑制剂中最被广泛研究并且仍是最强效力且具有口服生物可用性的一类(Becker等人，“DYRK1A的激活、调节和抑制(Activation,Regulation,and Inhibition of DYRK1A)”，《欧洲生物化学联合会杂志(FEBS J.)》278(2):246-256(2011)和Smith等人，“选择性DYRK1A抑制剂的设计、合成和生物评估的最新进展：阿尔茨海默病的疾病调节治疗的新途径？(Recent Advances in theDesign,Synthesis,and Biological Evaluation of Selective DYRK1A Inhibitors:ANew Avenue for a Disease Modifying Treatment of Alzheimer's？)”，《ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.)》3(11):857-872(2012)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。

除去氢骆驼蓬碱外，已显示抑制DYRK1A和其它激酶的其天然产物有EGCg和其它黄烷-3-醇(Guedj等人，“绿茶多酚拯救由DYRK1A过表达诱导的脑缺陷(Green TeaPolyphenols Rescue of Brain Defects Induced by Overexpression of DYRK1A)”，《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》4(2):e4606(2009)和Bain等人，“蛋白激酶抑制剂的特异性：更新(The Specificities of Protein Kinase Inhibitors:An Update)”，《生物化学杂志(Biochem.J.)》371(1):199-204(2003)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)、leucettine(Tahtouh等人，“衍生自海绵生物碱Leucettamine B的蛋白激酶抑制剂家族leucettine的选择性、共晶体结构和神经保护特性”，《药物化学杂志》55(21):9312-9330(2012)和Naert等人，“leucettine L41，一种DYRK1A优先DYRK/CLK抑制剂，在小鼠中预防由施用寡聚Aβ25-35肽诱导的记忆障碍和神经毒性(Leucettine L41,a DYRK1A-preferential DYRKs/CLKs Inhibitor,Prevents Memory Impairments andNeurotoxicity Induced by Oligomeric Aβ25-35Peptide Administration in Mice)”，《欧洲神经精神药理学(Eur.Neuropsychopharmacol.)》25(11):2170-2182(2015)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)、醌茜素(quinalizarine)(Cozza等人，“作为蛋白激酶CK2的强效、选择性并且细胞可渗透抑制剂的醌茜素(Quinalizarin as a Potent,Selective and Cell-permeable Inhibitor of Protein Kinase CK2)”，《生物化学杂志》421(3):387-395(2009)，其以全文引用的方式并入本文中)、盾木素类似物(peltogynoid)Acanilol A和B(“具有激酶抑制活性的两种来自***金合欢的新盾木素类似物(Two NewPeltogynoids from Acacia nilotica Delile with Kinase Inhibitory Activity)”，《药用植物(Planta Med.)》76(5):458-460(2010)，其以全文引用的方式并入本文中)、苯并香豆素(dNBC)(Sarno等人，“激酶抑制剂NBC和dNBC的选择性的基础结构特征：硝基区分CK2和DYRK1A的作用(Structural Features Underlying the Selectivity of the KinaseInhibitors NBC and dNBC:Role of a Nitro Group that Discriminates Between CK2and DYRK1A)”，《细胞和分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)》69(3):449-460(2012)，其以全文引用的方式并入本文中)以及吲哚并咔唑(司他波林(Starosporine)、蝴蝶霉素(rebeccamycin)和其类似物)(Sanchez等人，“通过糖基化吲哚并咔唑的组合性生物合成产生强效并且选择性的激酶抑制剂(Generation of Potent and Selective KinaseInhibitors by Combinatorial Biosynthesis of Glycosylated Indolocarbazoles)”，《化学通讯(Chem.Commun.)》27:4118-4120(2009)，其以全文引用的方式并入本文中)。

在由小分子药物发现尝试鉴别的其它骨架结构(scaffolds)中，以下显示强效DYRK1A活性以及不同程度的激酶选择性：INDY(Ogawa等人，“唐氏综合征相关激酶Dyrk1A的新颖选择性抑制剂的开发(Development of a Novel Selective Inhibitor of the DownSyndrome-Related Kinase Dyrk1A)”，《自然·通讯》1:文章号86(2010)，其以全文引用的方式并入本文中)、DANDY(Gourdain等人，“展现强效DYRK1A激酶抑制活性的新3,5-二芳基-7-氮杂吲哚DANDY的开发(Development of DANDYs,New 3,5-Diaryl-7-AzaindolesDemonstrating Potent DYRK1A Kinase Inhibitory Activity)”，《药物化学杂志》56(23):9569-9585(2013)，其以全文引用的方式并入本文中)和FINDY(Kii等人，“通过靶向激酶DYRK1A的折叠过程对其进行选择性抑制(Selective Inhibition of the KinaseDYRK1A by Targeting its Folding Process)”，《自然·通讯》7:11391(2016)，其以全文引用的方式并入本文中)、吡唑烷-二酮(Koo等人，“作为Dyrk1A抑制剂的吡唑烷-3,5-二酮衍生物的QSAR分析(QSAR Analysis of Pyrazolidine-3,5-Diones Derivatives asDyrk1A Inhibitors)”，《生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)》19(8):2324-2328(2009)；Kim等人，“患有唐氏综合征的人的学习和记忆缺陷的推定治疗剂(Putative Therapeutic Agents for the Learning and Memory Deficits of Peoplewith Down Syndrome)”，《生物有机化学与医药化学通讯》16(14):3772-3776(2006)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)、氨基-喹唑啉(Rosenthal等人，“Cdc2样激酶(Clk)和双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶(Dyrk)的特定同工型的强效并且选择性的小分子抑制剂(Potent and Selective Small Molecule Inhibitors of Specific Isoforms of Cdc2-Like Kinases(Clk)and Dual Specificity Tyrosine-Phosphorylation-RegulatedKinases(Dyrk))”，《生物有机化学与医药化学通讯》21(10):3152-3158(2011)，其以全文引用的方式并入本文中)、梅里啉(meriolin)(Giraud等人，“梅里啶衍生物的合成、蛋白激酶抑制效力和试管内抗增殖活性(Synthesis,Protein Kinase Inhibitory Potencies,andIn Vitro Antiproliferative Activities of Meridianin Derivatives)”，《药物化学杂志》54(13):4474-4489(2011)；Echalier等人，“梅里啉(3-(嘧啶-4-基)-7-氮杂吲哚)：合成、激酶抑制活性、细胞效应以及CDK2/细胞周期蛋白A/梅里啉复合物的结构(Meriolins(3-(Pyrimidin-4-yl)-7-Azaindoles):Synthesis,Kinase Inhibitory Activity,Cellular Effects,and Structure of a CDK2/Cyclin A/Meriolin Complex)”，《药物化学杂志》51(4):737-751(2008)；和Akue-Gedu等人，“结构上与梅里啶相关的氨基嘧啶基-吲哚的合成和生物活性(Synthesis and Biological Activities of Aminopyrimidyl-Indoles Structurally Related to Meridianins)”，《生物有机化学与医药化学(Bioorg.Med.Chem.)》17(13):4420-4424(2009)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)、吡啶和吡嗪(Kassis等人，“作为激酶抑制剂和细胞毒性剂的新3-(6-羟基吲哚-2-基)-5-(苯基)吡啶或吡嗪V形分子的合成和生物评估(Synthesis and Biological Evaluationof New 3-(6-hydroxyindol-2-yl)-5-(Phenyl)Pyridine or Pyrazine V-ShapedMolecules as Kinase Inhibitors and Cytotoxic Agents)”，《欧洲医药化学杂志(Eur.J.Med.Chem.)》46(11):5416-5434(2011)，其以全文引用的方式并入本文中)、苯并吡喃并吲哚(chromenoidoles)(Neagoie等人，“作为片螺素D类似物的苯并吡喃并[3,4-b]吲哚的合成：一类新颖DYRK1A抑制剂(Synthesis of Chromeno[3,4-b]indoles asLamellarin D Analogues:A Novel DYRK1A Inhibitor Class)”，《欧洲医药化学杂志》49:379-396(2012)，其以全文引用的方式并入本文中)、11H-吲哚并[3,2-c]喹啉-6-羧酸、噻唑并[5,4-f]喹唑啉(EHT 5372)(Foucourt等人，“作为DYRK1A抑制剂的噻唑并[5,4-f]喹唑啉的设计和合成，部分I(Design and Synthesis of Thiazolo[5,4-f]quinazolines asDYRK1A Inhibitors,Part I.)”，《分子(Molecules)》19(10):15546-15571(2014)和Coutadeur等人，“用于治疗阿尔茨海默病的新颖DYRK1A(双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A)抑制剂：对τ和淀粉样蛋白病变的体外效果(A Novel DYRK1A(Dual SpecificityTyrosine Phosphorylation-Regulated Kinase 1A)Inhibitor for the Treatment ofAlzheimer's Disease:Effect on Tau and Amyloid Pathologies In Vitro)”，《神经化学杂志(J.Neurochem.)》133(3):440-451(2015)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)以及5-碘代杀结核菌素(Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016)和Annes等人，“腺苷激酶抑制选择性促进啮齿动物和猪胰岛β细胞复制(Adenosine Kinase Inhibition Selectively Promotes Rodent and Porcine Isletβ-cell Replication)”，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)》109(10):3915-3920(2012)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。

合适的噻二嗪激酶抑制剂包括例如但不限于2018年11月20日提交的PCT申请第PCT/US2018/062023号中所描述的抑制剂，所述文献以全文引用的方式并入本文中。具体实例包括表1和2中所显示的抑制剂。

表1.噻二嗪激酶抑制剂

表2.其它噻二嗪激酶抑制剂

如前所述，胰高血糖素样肽-1受体激动剂模拟响应于食物摄入从肠释放的肠促胰岛素激素GLP-1的效应。所述激动剂的效应包括增加胰岛素分泌、减少胰高血糖素释放、增加饱腹感以及减缓胃排空。

适用于进行所公开的方法的GLP1R激动剂包括(但不限于)艾塞那肽、利拉鲁肽、艾塞那肽LAR、他司鲁肽(taspoglutide)、利司那肽、阿必鲁肽(albiglutide)、度拉糖肽(dulaglutide)以及索马鲁肽。艾塞那肽和艾塞那肽LAR是获自希拉毒蜥(Helodermasuspectum)(蜥蜴)的唾液的合成exendin-4类似物。利拉鲁肽是GLP-1酰化类似物，其自组装成延缓从皮下注射位点吸收的七聚结构。他司鲁肽与天然GLP-1具有3％同源性，并且对DPP-4降解具有完全抗性。利司那肽是人GLP1R激动剂。阿必鲁肽是长效GLP-1模拟物，对DPP-4降解具有抗性。度拉糖肽是长效GLP1类似物。索马鲁肽是批准用于T2D用途的GLP1R激动剂。临床上可用的GLP1R激动剂包括例如艾塞那肽、利拉鲁肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利司那肽、索马鲁肽。

在一些实施方案中，GLP1R激动剂选自由以下组成的组：GLP1(7-36)、extendin-4、利拉鲁肽、利司那肽、索马鲁肽以及其组合。

其它合适的GLP1激动剂包括(但不限于)二取代7-芳基-5,5-双(三氟甲基)-5,8-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮化合物和其衍生物，例如7-(4-氯苯基)-1,3-二甲基-5,5-双(三氟甲基)-5,8-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(参见例如Nance等人，“基于1,3-二取代-7-芳基-5,5-双(三氟甲基)-5,8-二氢嘧啶并[4,5-d]嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮核心的一系列新颖口服生物可用并且CNS穿透胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)非竞争性拮抗剂的发现(Discovery of a Novel Series of Orally Bioavailableand CNS Penetrant Glucagon-like Peptide-1Receptor(GLP-1R)NoncompetitiveAntagonists Based on a 1,3-Disubstituted-7-aryl-5,5-bis(trifluoromethyl)-5,8-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione Core)”，《药物化学杂志》60:1611-1616(2017)，其以全文引用的方式并入本文中)。

其它合适的GLP1激动剂包括GLP1R的正向变构调节剂(“PAMS”)，例如(S)-2-环戊基-N-((1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-2-环戊基-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；2-环戊基-N-(((S)-1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2,3,4-四氢吡嗪并[1,2-a]吲哚-4-羧酰胺；N-(((S)-1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-2-((S)-四氢呋喃-3-基)-l,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；N-(((R)-1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-2-((S)-四氢呋喃-3-基)-l,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-2-环戊基-8-氟-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-2-环戊基-8-氟-N-((1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-2-环戊基-N-(((S)-1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2,3,4-四氢吡嗪并[1,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-2-环戊基-N-(((S)-1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2,3,4-四氢吡嗪并[1,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-10-氯-2-环戊基-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-10-氯-2-环戊基-N-((1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-10-溴-2-环戊基-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-10-溴-2-环戊基-N-((1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-10-氰基-2-环戊基-N-((1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-2-环戊基-N-((1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-1-氧代-10-乙烯基-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-N-((1-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-2-(l-甲基-lH-吡唑-4-基)-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[1,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-2-(1-甲基-lH-吡唑-4-基)-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[1,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(S)-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-l-氧代-2-(吡啶-3-基)-l,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；(R)-N-((l-异丙基吡咯烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-2-(吡啶-3-基)-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；N-(氮杂环丁烷-2-基甲基)-2-环戊基-10-甲基-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[1,2-a]吲哚-4-羧酰胺；以及2-环戊基-N-((1-异丙基氮杂环丁烷-2-基)甲基)-10-甲基-1-氧代-1,2-二氢吡嗪并[l,2-a]吲哚-4-羧酰胺；或其药学上可接受的盐(参见PCT公开第WO 2017/117556号，其以全文引用的方式并入本文中)。

在进行本文所描述的方法时，使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触。

使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触可使用去氢骆驼蓬碱和GLP1(7-36)进行。

使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触可使用去氢骆驼蓬碱和N-(4-氟苯甲基)-5-(苯并[d]咪唑-2(3H)-酮)-6H-1,3,4-噻二嗪-2-胺进行。

使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触可使用包含DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂两者的单一组合物进行。或者，使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触可依次(serially)进行。举例来说，可使胰腺β细胞群首先与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂(或包含双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂的组合物)接触，并且随后与胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂(或包含胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂的组合物)接触；或首先与胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂(或其组合物)接触，并且随后与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂(或其组合物)接触。

在进行本文所描述的方法时，使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触可如下进行：一天多次、每天一次、每周一次、每周两次、每月一次、两月一次、每年一次、半年一次或其间的任何时间量。DYRK1A抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可以不同施用频率施用。使胰腺β细胞群与DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂接触可短期或长期进行。举例来说，接触可在1年、2年、3年、4年或更长的时段内长期进行。在一些实施方案中，施用不频繁地进行。

可进行胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂的接触，以使群中增殖胰腺β细胞的数目增加至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。

可进行胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂的接触，以使群中增殖胰腺β细胞的数目增加约4-10％/天，或约4-6％/天、5-7％/天、6-9％/天或7-10％/天。

使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触可使群中增殖胰腺β细胞的数目增加约6-10％/天。

使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触的方法可在能有效引起胰腺β细胞群中细胞增殖协同增加的条件下进行，协同增加意味着尤其相比于当使细胞与DYRK1A抑制剂或GLP1R激动剂单独接触时，或当细胞未与DYRK1A抑制剂或GLP1R激动剂中的任一种接触时，群中增殖胰腺β细胞的数目增加。

在进行这一方法和其它方法时，使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂接触可能不诱导细胞群中β细胞死亡或DNA损伤。此外，接触可诱导β细胞分化并且增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

可进行所述方法以增强细胞存活。举例来说，可进行所述方法以相对于未经处理的胰腺β细胞群，增强经处理的胰腺β细胞群的细胞存活。或者，可进行所述方法以相对于未经接触的胰腺β细胞群，减少经接触的胰腺β细胞群的细胞死亡或凋亡。

另一方面涉及治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法。这一方法涉及向需要治疗胰岛素分泌水平不足相关病状的受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂，其中所述施用在能有效引起所述受试者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以治疗所述受试者胰岛素分泌水平不足。

本公开的另一方面涉及治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法。这一方法涉及向需要治疗胰岛素分泌水平不足相关病状的受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂，其中所述施用在能有效引起所述受试者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以治疗所述受试者胰岛素分泌水平不足。

如本文所用，胰岛素分泌水平不足相关病状意指一种病状，其中受试者产生的血浆胰岛素水平比维持血液中正常葡萄糖水平所需的低，使得患有胰岛素分泌不足相关病状的受试者变为具有高血糖。在这种病状中，患病受试者的胰腺β细胞分泌的胰岛素水平不足以维持血液中存在正常浓度的葡萄糖(即，血糖量正常)。

胰岛素分泌水平不足相关病状之一是胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是受试者细胞变得对胰岛素的降糖作用较不敏感的病状。肌肉和脂肪细胞中的胰岛素抵抗减少葡萄糖摄取(以及因此减少葡萄糖以糖原和甘油三酯形式的局部贮积)，而肝细胞中的胰岛素抵抗导致糖原合成和贮积减少和不能抑制葡萄糖产生并且释放到血液中。胰岛素抵抗通常是指胰岛素的降糖作用减弱。然而，胰岛素的其它功能也可能受影响。举例来说，脂肪细胞中的胰岛素抵抗使胰岛素对脂质的正常作用减弱，并且导致循环脂质摄取减少和贮积甘油三酯的水解增加。这些细胞中贮积脂质的机动化增加使血浆中的游离脂肪酸升高。血液脂肪酸浓度升高、肌肉葡萄糖摄取减少以及肝脏葡萄糖产生增加都促成血糖水平升高。如果存在胰岛素抵抗，那么需要由胰腺分泌更多胰岛素。如果这种代偿性增加不发生，那么血糖浓度就会提高并且发生II型糖尿病。

胰岛素分泌水平不足相关病状之一是糖尿病。糖尿病可分成两大类疾病：I型(“T1D”)和II型(“T2D”)。术语“糖尿病”在本文中还指患者具有高血糖水平的一组代谢疾病，包括I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成年发病型糖尿病(“MODY”)、囊性纤维化相关糖尿病、血色素沉着症相关糖尿病、药物诱发的糖尿病(例如，类固醇糖尿病)以及几种形式的单基因糖尿病。

在某些实施方案中，受试者已接受或正接受对I型糖尿病(T1D)、II型糖尿病(T2D)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成年发病型糖尿病(MODY)、囊性纤维化相关糖尿病、血色素沉着症相关糖尿病、药物诱发的糖尿病或单基因糖尿病中的一种或多种的治疗。举例来说，受试者已接受或正接受对I型糖尿病的治疗。或者，受试者已接受或正接受对II型糖尿病的治疗。

胰岛素分泌水平不足相关病状是代谢综合征。代谢综合征一般用于限定与罹患II型糖尿病和动脉粥样硬化血管疾病风险提高相关的异常的群集(constellation)。相关病状和症状包括(但不限于)空腹高血糖(II型糖尿病或空腹血糖受损、糖耐量受损或胰岛素抵抗)；高血压；中心型肥胖(也被称作腹部、男性型或苹果形肥胖)，意指超重并且脂肪主要在腰部周围堆积；HDL胆固醇减少；以及甘油三酯升高。

胰岛素分泌水平不足相关病状可能是代谢综合征或胰岛素抵抗。因此，可进行所述方法以治疗患有代谢综合征或胰岛素抵抗或正在接受对代谢综合征或胰岛素抵抗的治疗的受试者。

可能与胰岛素分泌水平不足相关的其它病状包括(但不限于)高尿酸血症、脂肪肝(尤其在并行肥胖中)进展为非酒精性脂肪肝病、***(妇女中)以及黑棘皮病。

也可依据本文所公开的治疗方法来治疗相关病症，所述病症包括(但不限于)与在正常范围外的血液或血浆葡萄糖水平相关的任何疾病，如高血糖。因此，术语“相关病症”包括糖耐量受损(“IGT”)、空腹血糖受损(“IFG”)、胰岛素抵抗、代谢综合征、餐后高血糖以及超重/肥胖。这类相关病症的特征也可能是异常血液和/或血浆胰岛素水平。

可进行所述方法来治疗患有β细胞衰竭或缺乏相关病状的受试者。这类病状包括(但不限于)I型糖尿病(T1D)、II型糖尿病(T2D)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成年发病型糖尿病(MODY)、囊性纤维化相关糖尿病、血色素沉着症相关糖尿病、药物诱发的糖尿病或单基因糖尿病。药物诱发的糖尿病涉及通过使用对β细胞具有毒性的药物(例如，类固醇、抗抑郁药、第二代抗精神病药以及免疫抑制剂)导致的病状。示范性免疫抑制药物包括(但不限于)可的松(cortisone)家族成员(例如，***(prednisone)和***(dexamethasone))、雷帕霉素(rapamycin)/西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)以及钙调神经磷酸酶抑制剂(例如，FK-506/他克莫司(tacrolimus))。

其它β细胞缺乏相关病状包括(但不限于)未察觉低血糖、不稳定(labile)胰岛素依赖型糖尿病、胰腺切除、胰腺部分切除、胰腺移植、胰岛异体移植、胰岛自体移植以及胰岛异种移植。

如本文所用，未察觉低血糖是一种糖尿病并发症，其中患者未察觉到血糖深度下降，因为其未能触发肾上腺素分泌，肾上腺素分泌产生用以警告患者血糖下降的高血糖特征症状(例如，心悸、出汗、焦虑)。

胰腺移植可单独进行，在肾移植之后进行或与肾移植组合进行。举例来说，在患有因未察觉低血糖和不稳定胰岛素依赖型糖尿病而导致的严重致残并且潜在危及生命的并发症(且尽管进行最优医学管理但该并发症仍持续)的患者中，单独的胰腺移植可视为医学上必需的。在先前肾移植之后的胰腺移植可在患有胰岛素依赖型糖尿病的患者中进行。胰腺移植可在患有***的胰岛素依赖型糖尿病患者中与肾移植组合进行。可在首次胰腺移植失败后考虑胰腺再移植。

如本文所用，胰岛移植是仅分离朗格汉斯岛并且将其移植到患者中的手术，朗格汉斯岛含有胰腺内分泌细胞，包括产生胰岛素的β细胞和产生胰高血糖素的α细胞。当朗格汉斯岛是从一个或多个人供体胰腺中分离的时，发生胰岛异体移植。胰岛细胞也可来源于人胚胎干细胞或诱导多能干细胞。当朗格汉斯岛是从一个或多个非人供体胰腺(例如，猪胰腺或灵长类动物胰腺)中分离的时，发生胰岛异种移植。当朗格汉斯岛是从经历胰腺切除(例如，针对由胆囊结石、药物和/或家族遗传原因引起的慢性胰腺炎)的患者的胰腺中分离，并且通过输注到门静脉中、通过腹腔镜到达网膜、通过内窥镜到达胃壁或通过小切口皮下返回到同一患者时，发生胰岛自体移植。如同胰腺移植，胰岛移植可单独进行，在肾移植之后进行或与肾移植组合进行。举例来说，可单独进行胰岛移植以恢复低血糖感知、提供血糖控制和/或保护患者免于严重低血糖事件(Hering等人，“1型糖尿病并发严重低血糖的人胰岛移植3期试验(Phase 3 Trial of Transplantation of Human Islets in Type 1Diabetes Complicated by Severe Hypoglycemia)”，《糖尿病护理(Diabetes Care)》39(7):1230-1240(2016)，其以全文引用的方式并入本文中)。

胰岛移植可与全胰切除组合进行。举例来说，可在全胰切除后进行胰岛移植以通过保持β细胞功能预防或改善手术诱发的糖尿病(Johnston等人，“慢性胰腺炎患者中全胰切除并且使用非现场胰岛分离进行胰岛细胞自体移植后与胰岛产生和胰岛素非依赖性相关的因素：克利夫兰诊所经验(Factors Associated With Islet Yield and InsulinIndependence After Total Pancreatectomy and Islet Cell Autotransplantation inPatients With Chronic Pancreatitis Utilizing Off-site Islet Isolation:Cleveland Clinic Experience)”，《化学内分泌学与代谢杂志(J.Chem.Endocrinol.Metab.)》100(5):1765-1770(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，胰岛移植可提供持续长期胰岛素非依赖性。

在一些实施方案中，胰岛移植可与免疫抑制剂施用组合进行。合适的免疫抑制剂包括(但不限于)达利珠单抗(daclizumab)(赛尼哌(Zenapax)；罗氏(Roche))、低剂量雷帕霉素(西罗莫司)以及FK506(他克莫司)(Van Belle等人，“胰岛移植中的免疫抑制(Immunosuppression in Islet Transplantation)”，《临床研究杂志》118(5):1625-1628(2008)，其以全文引用的方式并入本文中)。

在一些实施方案中，胰岛移植在囊封(encapsulation)装置情形下进行，以保护移植胰岛细胞免于宿主自身免疫反应，同时允许葡萄糖和营养素到达移植胰岛细胞。

可进行本文所描述的方法以通过使患者中胰腺β细胞再生来增强胰腺、胰岛异体移植、胰岛自体移植、胰岛异种移植。举例来说，可使用本申请的方法以通过保持β细胞功能预防或改善手术诱发的糖尿病、恢复低血糖感知、提供血糖控制和/或保护患者免于严重低血糖事件。因此，本公开的另一方面涉及使移植患者的胰腺β细胞再生的方法。这一方法涉及向移植患者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂，其中所述施用在能有效引起所述移植患者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以使所述患者的胰腺β细胞再生。

可进行所述方法以治疗具有罹患II型糖尿病风险的受试者。具有罹患II型糖尿病风险的患者可能患有前期糖尿病/代谢综合征。

具有罹患II型糖尿病风险的患者可能已用精神活性药物治疗，所述药物包括(但不限于)用于抑郁症、强迫症(“OCD”)等的选择性血清素再吸收抑制剂(“SSRI”)。

受试者可以是哺乳动物受试者，例如人受试者。合适的人受试者包括(但不限于)患有β细胞和/或胰岛素缺乏的儿童、成人和老年受试者。

受试者也可以是非人，如牛、羊、猪、猫、马、鼠、犬、兔等。

向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可使受试者的增殖胰腺β细胞的数目增加至少约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。

向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可使受试者的增殖胰腺β细胞的数目增加约4-10％/天，或约4-6％/天、5-7％/天、6-9％/天或7-10％/天。

向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可使受试者的增殖胰腺β细胞的数目增加约6-10％/天。

向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可使受试者的胰腺β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌增加(例如，相比于未施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂的受试者)。

DYRK1A抑制剂可选自由以下组成的组：去氢骆驼蓬碱、INDY、leucettine-41、5-碘代杀结核菌素(5-IT)、GNF4877、CC-401、噻二嗪激酶抑制剂以及其组合。示范性DYRK1A抑制剂在上文中详细描述。

GLP1R激动剂可选自由以下组成的组：GLP1类似物、extendin-4、利拉鲁肽、利司那肽、索马鲁肽以及其组合，其在上文中描述。

向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可使用去氢骆驼蓬碱和GLP1(7-36)进行。

向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可使用去氢骆驼蓬碱和N-(4-氟苯甲基)-5-(苯并[d]咪唑-2(3H)-酮)-6H-1,3,4-噻二嗪-2-胺进行。

向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可通过包含DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂两者的单一组合物进行。或者，向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可依次进行。举例来说，受试者可首先施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂(或包含双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂的组合物)，并且随后施用胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂(或包含胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂的组合物)；或首先用胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂(或其组合物)施用，并且随后施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂(或其组合物)。

施用可每天多次、每天一次、每周一次、每周两次、每月一次、两月一次、每年一次、半年一次或以其间的任何时间量进行。DYRK1A抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可以不同施用频率施用。在一些实施方案中，施用短期(acutely)或长期(chronically)进行。举例来说，施用可在1年、2年、3年、4年或更长的时段内长期进行。在一些实施例中，施用不频繁地进行。如本文所用，术语“治疗”意指预防或改善或治愈性治疗。换句话说，可进行治疗方法以预防受试者患上胰岛素分泌不足相关病状，或预防受试者胰岛素分泌不足相关病状恶化。或者，进行治疗方法以改善受试者胰岛素分泌不足相关病状，或完全治愈所述病状(即，使得如通过有能力的保健专业人员判定，受试者不再患有胰岛素分泌水平不足相关病状)。

术语“治疗”意指使受试者的糖稳态受损得到修复、变化速率降低或减轻。血液中的葡萄糖水平在一天中波动。葡萄糖水平通常在早晨，当天第一次进餐前较低，并且餐后上升持续几个小时。因此，术语“治疗”包括通过提高或降低受试者血糖水平来控制受试者的血糖水平。这可取决于许多因素，包括受试者病状和/或当天特定时间，因为血糖水平在一天中波动。

“治疗”意指调节患有糖尿病或相关病症的受试者的血糖水平的暂时性或持续性降低。术语“治疗”也可意指改善受试者的胰岛素释放(例如，由胰腺β细胞释放)。

可能期望调节受试者的血糖水平以使具有异常水平(即，低于或高于具有正常糖稳态的相应受试者的已知对照、中值或平均值的水平)的受试者的血液或血浆葡萄糖水平正常化或对其进行调节。可进行本发明的治疗方法以达成这类效应。

在进行治疗方法时，向受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂可涉及施用药学组合物，其包含治疗有效量的双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂或胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂或两者，治疗有效量指有效治疗受试者的所述病状和/或病症的DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂的量。这类量一般根据所属领域普通技术人员认识范围内的数种因素而不同。这些包括(但不限于)特定受试者的一般健康状况、年龄、体重、身高、一般身体状况、病史、所使用的特定化合物以及配制所用的运载体和所选定的施用途径、治疗长度或持续时间以及所治疗的病状的性质和严重程度。

施用典型地涉及施用药学上可接受的剂型，这意味着本文所描述的化合物的剂型，并且包括例如片剂、糖衣药丸、粉末剂、酏剂、糖浆、液体制剂，包括悬浮液、喷雾剂、吸入剂片剂、***片、乳液、溶液、颗粒剂、胶囊和栓剂，以及注射用液体制剂，包括脂质体制剂。技术和配方一般可见于《雷明顿医药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，马克出版公司(Mack Publishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)，最新版，其以全文引用的方式并入本文中。

在进行治疗方法时，可在任何合适的运载体物质中含有任何适当量的DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂。DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂的存在量可以是组合物总重量的至多99％(按重量)。组合物可以适用于口服、肠胃外(例如，静脉内、肌肉内)、经直肠、经皮(cutaneous)、经鼻、经***、吸入、皮肤(skin)(贴剂)或眼部施用途径的剂型提供。因此，组合物可呈例如片剂、胶囊、丸剂、粉末剂、颗粒剂、悬浮液、乳液、溶液、包括水凝胶的凝胶、糊剂、软膏、乳膏、膏药、大剂量药液(drench)、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、可注射剂、植入物、喷雾剂或气雾剂形式。

药物组合物可被配制成基本上紧接在施用后或在施用后任何预定时间或时段释放活性DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂。

控制释放制剂包括(i)在身体内产生在延长时段内基本上恒定的药物浓度的制剂；(ii)在预定滞后时间后在身体内产生在延长时段内基本上恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在身体中维持相对恒定有效药物水平在预定时段期间维持药物作用，同时使与活性药物物质的血浆水平波动相关的不合期望的副作用减到最小的制剂；(iv)通过例如将控制释放组合物空间放置于邻近病变组织或器官或在其中来对药物作用进行定位的制剂；以及(v)通过使用运载体或化学衍生物来将药物递送到特定靶细胞类型从而靶向药物作用的制剂。

以控制释放制剂形式施用DYRK1A抑制剂和GLP1R激动剂在药物具有以下特征的情况下尤其优选：(i)窄治疗指数(即，导致有害副作用或毒性反应的血浆浓度与引起治疗效果的血浆浓度之间的差异小；一般，治疗指数(“TI”)被定义为中值致死剂量(LD₅₀)与中值有效剂量(ED₅₀)的比率)；(ii)胃肠道中的窄吸收窗；或(iii)极短生物半衰期，使得需要在一天期间频繁给药以便将血浆水平维持在治疗水平。

可实行数种策略中的任一种以获得控制释放，其中目标DYRK1A抑制剂和/或GLP1R激动剂的释放速率超过代谢速率。可通过适当选择各种制剂参数和成分，包括例如各种类型的控制释放组合物和包衣来获得控制释放。因此，将药物用适当赋形剂配制成在施用后以受控方式释放药物的药物组合物(单或多单元片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、纳米粒子、贴剂以及脂质体)。因此，施用可经鼻、口服、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内或通过施加到粘膜来进行。化合物可单独或与合适的药学运载体一起施用，并且可呈固体或液体形式，如片剂、胶囊、粉末剂、溶液、悬浮液或乳液。在某些实施方案中，施用经鼻、口服、经皮、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内进行。

在某些实施方案中，使用输注泵进行施用以提供例如速率受控输注、周期性输注和/或一次大剂量输注。输注泵可以是固定或移动式(ambulatory)输注泵。固定输注泵主要在患者床边使用。移动式输注泵是相对小的、至少基本上独立(self-contained)的装置，其用于向所选受试者引入药物和其它可输注物质(例如，胰岛素)。一些移动式输注泵被配置成佩戴在腰带上、携带在服装口袋中或另外支撑在某一种类的固持器内(统称为“口袋泵”)。其它输注泵被配置成以贴剂样方式粘附到皮肤(被称为“贴剂泵”)。输注泵可用于例如在临床环境外进行性或甚至持续地静脉内或皮下引入(或“输注”)药物。输注泵极大地降低皮下进入(access)事件(如基于针的注射)的频率。在某些实施方案中，输注泵是皮下或静脉内输注泵。举例来说，输注泵可以是移动式皮下胰岛素输注泵。

另一方面涉及包含双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体(GLP1R)激动剂的组合物。

合适的DYRK1A抑制剂在上文中描述，并且包括例如去氢骆驼蓬碱、INDY、leucettine-41、5-碘代杀结核菌素(5-IT)、GNF4877、CC-401、激酶抑制剂以及其衍生物。

合适的GLP1R激动剂在上文中描述，并且包括例如extendin-4、利拉鲁肽、利司那肽、索马鲁肽以及其衍生物。

组合物可进一步包含运载体。合适的运载体在上文中描述。运载体可以是药学上可接受的运载体。合适的药学上可接受的运载体在上文中描述。

另一方面涉及增加胰腺β细胞群中细胞增殖的方法。这一方法涉及使胰腺β细胞群与双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和增加cAMP的化合物接触，其中所述接触在能有效引起所述胰腺β细胞群中细胞增殖协同增加的条件下进行。

本公开的另一方面涉及治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法。这一方法涉及向需要治疗胰岛素分泌水平不足相关病状的受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和增加cAMP的化合物，其中所述施用在能有效引起所述受试者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以治疗所述受试者胰岛素分泌水平不足。

本公开的另一方面涉及包含双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和增加cAMP的化合物的组合物。

环单磷酸腺苷(cAMP)是调节β细胞复制的细胞内第二信使。在一些实施方案中，用于进行所公开方法的增加cAMP的化合物包括cAMP类似物，包括双丁酰-cAMP和/或8-氯-cAMP。已显示增加cAMP增加幼年啮齿动物的β细胞复制(Zhao等人，“改变调节cAMP的药剂的用途以促进β细胞复制(Repurposing cAMP-Modulating Medications to Promoteβ-CellReplication)”，《分子内分泌学(Mol.Endocrinol.)》28(10):1682-1697(2014)，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，如图5A-5H中所显示，除非施用与DYRK1抑制剂(例如，去氢骆驼蓬碱)组合进行，否则施用增加cAMP的药剂对人β细胞增殖没有影响。因此，本公开第一次证明增加cAMP与DYRK1A抑制剂组合协同增加人β细胞增殖。

细胞内cAMP水平受两种酶的活性之间的平衡调节：腺苷酸环化酶(“AC”)和环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)。大部分AC通过与G_s蛋白的α亚基(α_s)相互作用在G蛋白偶联受体(GPCR)(如β肾上腺素受体)下游激活，所述α亚基在激动剂配体与GPCR结合后(例如，在β肾上腺素受体情况下，肾上腺素与β肾上腺素受体结合)从异源三聚αβγG蛋白复合物中释放，并且结合到并激活AC(Sassone-Corsi，“环AMP路径(The Cyclic AMP Pathway)”，《冷泉港生物学观点(Cold Spring Harb.Perspect.Biol.)》4(12)(2012)，其以全文引用的方式并入本文中)。

β肾上腺素受体分成β₁、β₂和β₃亚型，其中的每一种与G_s蛋白偶合。激活β细胞上的β₂肾上腺素受体增加细胞内cAMP。因此，在某些实施方案中，用于进行所公开方法的增加cAMP的化合物包括β₂肾上腺素受体激动剂。合适的β₂肾上腺素受体激动剂包括(但不限于)肾上腺素、沙丁胺醇(albuterol)(羟甲叔丁肾上腺素(salbutamol))、甲磺酸比托特罗(bitolterol mesylate)、福莫特罗(formoterol)、异丙肾上腺素、左旋沙丁胺醇、间羟异丙肾上腺素(metaproterenol)、沙美特罗(salmeterol)、特布他林(terbutaline)和/或利托君(ritodrine)。

多种GPCR通过激活cAMP依赖性信号传导路径和细胞内cAMP水平促进β细胞复制。在某些实施方案中，增加细胞内cAMP水平的化合物是GPCR的配体。对于提高cAMP水平来说合适(并且非限制性)的激动剂列于以下表3中。

表3.示范性GPCR、配体和激动剂

其它GPCR描述于Amisten等人，“人朗格汉斯岛中的G蛋白偶联受体的图谱和功能分析”，《药理学与治疗学》139(3):359-391(2013)中，其以全文引用的方式并入本文中，并且其鉴别了人胰岛中存在的293种GPCR。

去甲肾上腺素充当β细胞中cAMP合成的生理抑制因子，并且通过激活α₂肾上腺素能受体阻碍β细胞激活(Zhao等人，“改变调节cAMP的药剂的应用以促进β细胞复制”，《分子内分泌学》28(10):1682-1697(2014)，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，抑制α₂肾上腺素能受体增加细胞内cAMP水平。在某些实施方案中，用于进行所公开方法的增加cAMP的化合物包括α₂肾上腺素能受体拮抗剂，包括(但不限于)米氮平(mirtazapine)。

PDE催化cAMP的水解。在人体内，存在包含11种结构相关家族(PDE1-11)的21种PDE基因。Β细胞表达几种PDE家族成员，包括PDE1、PDE3、PDE4、PDE7、PDE8、PDE10以及PDE11。

PDE抑制剂通过阻止细胞内第二信使(例如，cAMP)被PDE降解来提高细胞内cAMP水平。因此，适用于进行所公开方法的增加cAMP的化合物包括(但不限于)磷酸二酯酶(PDE)抑制剂。在某些实施方案中，PDE抑制剂是非选择性抑制剂。举例来说，PDE抑制剂可以是3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、扎达维林(zardaverine)和/或曲喹辛(trequinsin)。在某些实施方案中，PDE抑制剂是PDE1抑制剂、PDE3抑制剂、PDE4抑制剂、PDE7抑制剂、PDE8抑制剂、PDE10抑制剂和/或PDE11抑制剂。合适的PDE3抑制剂包括(但不限于)西洛酰胺(cilostamide)和/或米力农(milrinone)。合适的PDE4抑制剂包括(但不限于)伊索拉定(irsogladine)、海罂粟碱(glaucine)、依他唑酯(etazolate)、CGH2466、咯利普兰(rolipram)和/或bay 19-8004。合适的PDE5抑制剂包括(但不限于)双嘧达莫(dipyridamole)、伐地那非(vardenafil)和/或他达拉非(tadalafil)。合适的PDE10抑制剂包括(但不限于)罂粟碱(papaverine)。在某些实施方案中，PDE抑制剂选自由以下组成的组：曲喹辛(trequinsin)、扎达维林、西洛酰胺。在某些实施方案中，PDE抑制剂通过充当PDE4/PDE10抑制剂增加β细胞复制。因此，PDE抑制剂是双嘧达莫。

在一些实施方案中，PDE抑制剂对β细胞而非α细胞具有特异性(Zhao等人，“改变调节cAMP的药剂的应用以促进β细胞复制”，《分子内分泌学》28(10):1682-1697(2014)，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，在一个实施方案中，PDE抑制剂是双嘧达莫。

如上文所描述，GLP1R激动剂和阻止内源性GLP1由酶二肽基肽酶IV(DPP4)降解的额外药剂已显示诱导啮齿动物β细胞增殖，但未能显示激活成人胰岛的β细胞复制(DruckerDJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用”，《细胞·代谢》27(4):740-756(2018)和Deacon等人，“用于治疗2型糖尿病的二肽基肽酶-4抑制剂：比较、功效和安全性”，《药物治疗专家意见》14(15):2047-2058(2013)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。本公开证明抑制DYRK1A与提高GLP1活性的药剂的组合协同增加人β细胞增殖。

因此，本公开的另一方面涉及治疗受试者胰岛素分泌不足相关病状的方法。该方法涉及向需要治疗胰岛素分泌水平不足相关病状的受试者施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂，其中所述施用在能有效引起所述受试者的胰腺β细胞量协同增加的条件下进行，以治疗所述受试者胰岛素分泌水平不足。

如上文所描述，本文所描述的方法可体内进行。在一些实施方案中，施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂使用包含DYRK1A抑制剂和DPP4抑制剂两者的组合物进行。

如上文所描述，受试者可接受对I型糖尿病(“T1D”)、II型糖尿病(“T2D”)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成年发病型糖尿病(“MODY”)、囊性纤维化相关糖尿病、血色素沉着症相关糖尿病、药物诱发的糖尿病或单基因糖尿病中的一种或多种的治疗。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者。受试者可以是人受试者。

如上文所描述，施用双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A(DYRK1A)抑制剂和二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂可增加受试者的胰腺β细胞中葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

合适的DYRK1抑制剂在上文中详细描述。在一些实施方案中，DYRK1A抑制剂选自由以下组成的组：去氢骆驼蓬碱、INDY、leucettine-41、5-碘代杀结核菌素(5-IT)、GNF4877、CC-401、噻二嗪激酶抑制剂以及其组合。

合适的DPPR抑制剂包括(但不限于)西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利拉利汀、阿格列汀以及其组合(Drucker DJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用”，《细胞·代谢》27(4):740-756(2018)和Deacon等人，“用于治疗2型糖尿病的二肽基肽酶-4抑制剂：比较、功效和安全性”，《药物治疗专家意见》14(15):2047-2058(2013)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。

实施例

用于实施例1-6的材料和方法

人胰岛：通过美国国立卫生研究院(NIH)支持的整合胰岛分布计划(IntegratedIslet Distribution Program；IIDP)、阿尔伯塔大学(University of Alberta)的阿尔伯塔糖尿病研究所胰岛中心(Alberta Diabetes Institute Islet Core)以及阿尔伯塔大学医院临床胰岛实验室(Clinical Islet Laboratory,University of Alberta Hospital)获得来自81位正常供体的人胰岛。在胰岛分离中心在具有知情同意书和IRB批准的情况下从已故器官供体的胰收集胰岛，不加任何标识信息。供体年龄范围为15到76岁(均值±SEM，45.3±12.9)；26位女性，53位男性。均值BMI为30.3±5.6(范围17.3-44.4)，并且冷缺血时间为604分钟(范围270-969分钟)。纯度范围为55％到98％(均值84.9±8.5)。另外，从患有2型糖尿病的11位供体获得胰岛。年龄范围为26到71岁(均值48.2±13.6)；3位女性，8位男性。均值BMI为31.7±4.4(范围27.3-38.1)，并且冷缺血时间为582分钟(范围155-1200分钟)。纯度范围为55％到85％。HbA1C范围为6.6到14.1(均值7.9)。已知三位使用糖尿病药物治疗(二甲双胍n＝3，DPP4抑制剂n＝1)。一旦收到，就将胰岛在胰岛培养基(含10％胎牛血清(FBS)、5.5mM葡萄糖和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基)中在37℃和5％CO₂下培养过夜。胰岛分散：将胰岛用如先前所描述的阿库酶(Accutase)分散成单细胞(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21:383-388(2015)；Cozar-Castellano等人，“使用腺病毒递送细胞周期蛋白依赖性激酶-4和细胞周期蛋白D₁诱导大鼠和人胰岛的β细胞增殖和成视网膜细胞瘤蛋白质磷酸化(Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma ProteinPhosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin-Dependent Kinase-4and Cyclin D₁)”，《糖尿病》53:149-59(2004)；和Fiaschi-Taesch等人，“使用单一G1/S调节分子cdk6诱导人β细胞增殖和植入(Induction of Human BetaCell Proliferation and Engraftment Using a Single G1/S Regulatory Molecule,cdk6)”，《糖尿病》59:1926-36(2010)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。整个胰岛通过在200×G下离心沉淀，并且在PBS中洗涤两次。随后将胰岛在37℃下在阿库酶中培育15-17分钟，并且通过移液管湿磨完全分散为单细胞。单一胰岛细胞通过在700×G下离心沉淀，并且再悬浮于胰岛培养基中。

化学品和化合物：如下购买试剂：阿库酶(Mediatech：25-058-CL)、去氢骆驼蓬碱(286044，西格玛(Sigma))、leucettine-41(MR-C0023，Adipogen)、INDY(4997，TocrisBiosciences)、GLP-1(7-36)酰胺(H-6795，巴亨(Bachem))、Exendin-4(乙酸盐)(11940，开曼(Cayman))、利拉鲁肽乙酸盐(H-8148，巴亨)、利司那肽乙酸盐(H-7426，巴亨)、索马鲁肽乙酸盐(H-7894，巴亨)、毛喉素(forskolin)(11018，开曼)、布拉地新(ducladesine)(双丁酰cAMP)(14408，开曼)、IBMX(13347，开曼)、双嘧达莫(18189，开曼)、H-89(10010556，开曼)、N6-苯甲酰基-环AMP(5255，Tocris)、8-pCPT-2'-O-Me-环AMP(17143，开曼)、ESI-05(SML1907，西格玛)、重组人IL-1β(201-lb-005，安迪生物公司(R&D Systems))、重组人TNF-α(210-TA-010，安迪生物公司)、安玛西亚细胞增殖标记试剂(Amersham CellProliferation Labelling Reagent)(RPN201，GE)。

化合物处理：将分散胰岛涂铺在聚-D-赖氨酸-层粘连蛋白涂布的玻璃腔式载玻片或盖玻片上。每孔接种来源于20-30IEQ分散细胞的细胞，并且允许其回收24小时，随后进行化合物处理。将细胞处理96小时，随后进行Ki67染色、BrdU染色或TUNEL标记。对于TUNEL标记，使用含有分别为1000单位/毫升和500单位/毫升的TNFα和IL-1β的细胞因子混合液。

免疫细胞化学：处理后，将细胞用4％多聚甲醛固定并且用针对增殖标记物(Ki67或BrdU)和胰岛素的抗体免疫染色(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Cozar-Castellano等人，“使用腺病毒递送细胞周期蛋白依赖性激酶-4和细胞周期蛋白D₁诱导大鼠和人胰岛的β细胞增殖和成视网膜细胞瘤蛋白质磷酸化”，《糖尿病》53(1):149-59(2004)；和Fiaschi-Taesch等人，“使用单一G1/S调节分子cdk6诱导人β细胞增殖和植入”，《糖尿病》59(8):1926-1936(2010)，各个所述文献中以全文引用的方式并入本文中)。将抗体在封闭缓冲液(5％正常山羊血清(NGS)、1％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％曲拉通(Triton)，在PBS中)中稀释。所使用的第一和第二抗血清列于以下。在固定前18小时，将BrdU(细胞增殖标记试剂，安玛西亚通用电气医疗集团(GE Healthcare)，GE：RPN201)以1:100稀释度添加到每一处理物中。在固定后使用1N HCl在37℃下进行BrdU免疫染色的抗原修复30分钟，随后进行第一抗体培育。将细胞与根据以下表4的第一和第二抗体一起培育，随后用DAPI复染。使用DeadEnd荧光测定系统(目录号G3250，普洛麦格(Promega))进行TUNEL标记。

表4.细胞标记试剂

腺病毒产生和使用：使用编码Cre或人DYRK1A的cDNA或处于U6启动子控制下针对LacZ或人DYRK1A的shRNA，制备处于CMV启动子控制下的腺病毒，如先前所描述(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)。分散人胰岛在盖玻片上用实验或对照腺病毒在100-150感染复数下在无血清培养基中转导2小时。添加含10％FCS的完全培养基以停止转导，并且如图中所描述培养细胞96小时。

葡萄糖刺激的胰岛素分泌：由用载剂、去氢骆驼蓬碱、GLP1或组合处理的完整人胰岛(每种条件20胰岛当量)一式两份测量胰岛素释放72小时(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Cozar-Castellano等人，“使用腺病毒递送细胞周期蛋白依赖性激酶-4和细胞周期蛋白D₁诱导大鼠和人胰岛的β细胞增殖和成视网膜细胞瘤蛋白质磷酸化”，《糖尿病》53(1):149-59(2004)；和Fiaschi-Taesch等人，“使用单一G1/S调节分子cdk6诱导人β细胞增殖和植入”，《糖尿病》59(8):1926-1936(2010)，各个所述文献中以全文引用的方式并入本文中)。将胰岛在1ml补充有10mM HEPES、1％BSA和2.8mM葡萄糖的克雷布斯-林格氏(Krebs-Ringer)碳酸氢盐缓冲液中在5％CO₂培育箱中在37℃下培育1小时，随后在1ml补充有0.1％BSA和2.8或16.8mM葡萄糖的新鲜克雷布斯-林格氏碳酸氢盐缓冲液中在37℃下培育30分钟。将缓冲液取出，收集，并且在-20℃下冷冻，以便通过胰岛素ELISA(10-1113-01，Mercodia)进行胰岛素测量。将胰岛在0.1N NaOH中在37℃下消化过夜，并且在用HCl中和后通过布拉德福(Bradford)分析测量蛋白质。将胰岛素值相对于蛋白质含量归一化。

RNA提取和q-PCR：根据制造商的说明书使用凯杰(Qiagen)RNeasy微型系统(74104，凯杰)由分散胰岛纯化总RNA(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)。随后使用SuperScript IV VILO(11756050，生命技术)制备cDNA。在ABI 7500实时PCR机器(生命技术，纽约州格兰德岛(Grand Island,NY))上使用伯乐(BioRad)SYBRGreen系统(1725271，伯乐)分析分散胰岛中的基因表达。通过比较循环阈值方法使用亲环蛋白A(CYPA)作为参考分析基因表达的相对定量。引物显示在以下表5和6中。

表5.正向引物序列

表6.反向引物序列

定量人β细胞流式细胞术：将人胰岛(250-300IEQ)或干细胞源β细胞(300-500,000个)使用阿库酶(MT25058CI，飞世尔科技公司(Fisher Scientific))(用于人胰岛)或胰蛋白酶(用于hESC源β细胞)分散，并且涂铺在层粘连蛋白/聚-D-赖氨酸涂布的腔式载玻片(BD354688，VWR Scientific))上。对于人胰岛，用腺病毒标记β细胞，如先前所描述(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Cozar-Castellano等人，“使用腺病毒递送细胞周期蛋白依赖性激酶-4和细胞周期蛋白D₁诱导大鼠和人胰岛的β细胞增殖和成视网膜细胞瘤蛋白质磷酸化”，《糖尿病》53(1):149-59(2004)；和Fiaschi-Taesch等人，“使用单一G1/S调节分子cdk6诱导人β细胞增殖和植入”，《糖尿病》59(8):1926-1936(2010)，各个所述文献中以全文引用的方式并入本文中)。简单来说，将人胰岛细胞在八孔腔中分散为单细胞，并且在不含胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，用在大鼠胰岛素-1启动子(RIP1)和mini-CMV增强子控制下表达亮绿色荧光蛋白ZsGreen(克隆科技公司(Clontech)，加利福尼亚州山景城(Mountain View CA))的150moi腺病毒转导两小时(Wang等人，“通过整合人胰岛素瘤中的分子图谱获得的针对糖尿病的人β细胞再生的见解”《自然·通讯》8(1):767(2017)，其以全文引用的方式并入本文中)。RIP1-miniCMV启动子包括连接到RIP1启动子的438个碱基的hCMV IE-1启动子ClaI-SpeI片段的177个碱基。已通过用胰岛素对分选细胞进行免疫标记、通过qRT-PCR和通过RNAseq证实β细胞部分>92％纯(Wang等人，“通过整合人胰岛素瘤中的分子图谱获得的针对糖尿病的人β细胞再生的见解”，《自然·通讯》8(1):767(2017)，其以全文引用的方式并入本文中)。用Ad.RIP-ZsGreen腺病毒转导两小时后，添加300μl含10％FBS的RPMI1640培养基以终止腺病毒感染，并且使细胞表达ZsGreen 24小时。此时，再添加含DMSO或去氢骆驼蓬碱10μM、Ly3649473μM或harmine-LY组合的新鲜培养基四天。

对于流式细胞人β细胞定量，在药物处理(DMSO或去氢骆驼蓬碱+LY364947)四天(对于人胰岛细胞)或七天(对于hESC源β细胞)后，通过温和阿库酶(对于人β细胞)或胰蛋白酶(对于hESC源β细胞)解离收集细胞，并且添加50,000个荧光珠粒(ACURFP-50-10，Spherotech,Inc.)，充当内部回收标准和FACS计数参考。DAPI(D3571，生命技术)用作死/活细胞标记物。将分散细胞负载到Aria II细胞分选仪上，并且对活的ZsGreen⁺(来自人胰岛)或GFP⁺(来自hESC)细胞进行计数，直到从每个载剂和去氢骆驼蓬碱-LY364947处理的孔中计数到10,000个珠粒。结果以相对于50,000个初始内部珠粒标准修正的ZsGreen⁺或GFP⁺β细胞的绝对数表示。通过用胰岛素对分选细胞进行免疫标记、通过qRT-PCR和通过RNAseq证实β细胞部分>92％纯(Wang等人，“通过整合人胰岛素瘤中的分子图谱获得的针对糖尿病的人β细胞再生的见解”,《自然·通讯》8(1):767(2017)，其以全文引用的方式并入本文中)。

统计：如附图中所指明，所有实验在多个人胰岛制备中重复多次。如通过使用双尾学生t检验(Student's t-test)或单因素方差分析(one-way ANOVA)确定，在p<0.05下认为结果显著。对于所示的每张图，对来自最少五个不同供体的最少1,000个β细胞进行计数。

实施例1-去氢骆驼蓬碱-GLP1组合产生人β细胞增殖的协同增加

为了探究DYRK1A抑制剂与GLP1R激动剂的组合是否可协同诱导人β细胞复制，并且提供GLP1R激动剂的人β细胞靶向特异性，将成人尸体胰岛用载剂、去氢骆驼蓬碱、GLP1(7-36)酰胺(在本文中被称为“GLP1”)或组合处理，并且在从人胰岛分散的胰岛素阳性细胞中评定Ki67免疫标记(图1A-1B、2、3A)。如先前所报导(Drucker DJ，“胰高血糖素样肽-1的作用机制和治疗应用”，《细胞·代谢》27(4):740-756(2018)；Parnaud等人，“分选的人和大鼠β细胞的增殖”，《糖尿病学》51(1):91-100(2008)；和Dai等人，“由胰高血糖素样肽-1和钙调神经磷酸酶信号传导诱导的年龄相关人β细胞增殖”，《临床研究杂志》127(10):3835-3844(2017)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)，在宽剂量范围内，GLP1对人β细胞增殖的影响可忽略。正如期望，去氢骆驼蓬碱诱导约2％的人β细胞增殖(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)。然而，引人注目地，去氢骆驼蓬碱外加GLP1的组合引起人β细胞增殖难以预期并且明显的增加，在较高GLP1剂量下达到5-6％，显著高于在单独的去氢骆驼蓬碱情况下的观察值。通过人β细胞数目快速并且明确的增加证明了人β细胞的真实增殖。这与两个阴性对照形成对比。第一，在人胰岛的数目降低的情况下观察到β细胞数目的清楚的剂量相关减少，并且第二，在细胞因子处理的情况下观察到这种情况(图1C-1E)。值得注意地，不仅可在去氢骆驼蓬碱的较高剂量，例如10μM(图1A-1G、2、3A-3C)下观察到协同效应，而且即使在单独具有较低效应或无效应的去氢骆驼蓬碱和GLP1的剂量下也可观察到协同效应(图3D-3E)。去氢骆驼蓬碱的无效剂量(1μM)与GLP1的任何剂量的组合产生清楚的协同作用，产生人β细胞增殖的增加(2.7％)，与单独的去氢骆驼蓬碱的最大有效剂量(10μM)相当(图3E)。

实施例2-DYRK1A-GLP1R激动剂组合产生人β细胞增殖的协同增加

去氢骆驼蓬碱与GLP1组合驱动增殖的协同能力延伸到所测试的每一种DYRK1A抑制剂：INDY、leucettine、5-IT以及GNF4877(图1F、4)，表明对普遍DYRK1A抑制剂而言，与GLP1的协同作用是“类别效应”。相反来说，去氢骆驼蓬碱与所测试的每一种GLP1R激动剂组合的协同作用也是显而易见的：GLP1、exendin-4、利拉鲁肽、利司那肽、索马鲁肽(图1G)，表明对于GLP1受体激动剂普遍而言，与DYRK1A抑制剂的促有丝***协同作用也是“类别效应”。总的来说，研究结果表明，与任何GLP1R激动剂一起施用(并且延伸至与增强循环GLP1水平的任何DPP4抑制剂药物一起施用)的任何DYRK1A抑制剂能够产生先前未在任何药物类别情况下观察到的人β细胞增殖速率。

实施例3-去氢骆驼蓬碱-GLP1协同作用需要DYRK1A抑制和cAMP-PKA-EPAC信号传导

协同作用需要抑制DYRK1A激酶。可通过在人胰岛中用腺病毒沉默DYRK1A来模拟由去氢骆驼蓬碱诱导的协同增殖。相反来说，过表达DYRK1A可克服去氢骆驼蓬碱-GLP1组合的促有丝***效应(图6A-6F)。GLP1协同作用还需要细胞内cAMP的增加，如由以下观察结果所证明：去氢骆驼蓬碱与增加cAMP的药剂，如毛喉素、双丁酰-环AMP以及磷酸二酯酶抑制剂IBMX和双嘧达莫组合，模拟去氢骆驼蓬碱-GLP1人β细胞增殖(图5A-5C)。此外，协同作用可由PKA和EPAC2激活剂(分别6-BNZ-cAMP和8CPT-cAMP)两者模拟，并且可由H89和ESI-05(分别为PKA和EPAC2的药理学抑制剂)抑制(图5D-5H、6F)。总的来说，这些研究结果表明，去氢骆驼蓬碱和GLP1驱动人β细胞复制的协同功效需要DYRK1A抑制和cAMP-PKA-EPAC2信号传导激活两者，并可由两者模拟。

实施例4-去氢骆驼蓬碱激活细胞周期激活分子并且抑制细胞周期抑制子

已显示去氢骆驼蓬碱激活细胞周期激活分子(如细胞周期蛋白)和细胞周期蛋白依赖性激酶两者，并且抑制细胞周期抑制子(如INK4/CIP-KIP家族)(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)，其以全文引用的方式并入本文中)。这一观察结果得到证实，但在将GLP1添加到去氢骆驼蓬碱中时不引起细胞周期激活子或抑制子的增量变化(图7A-7B)。蛋白质水平上的其他变化可能强调了增殖的协同激活。

实施例5-去氢骆驼蓬碱-GLP1组合不诱导β细胞去分化

药理学诱导人β细胞增殖可能导致去分化。出乎意料地，去氢骆驼蓬碱-GLP1组合不导致β细胞分化标记物表达降低。实际上，如通过整个人胰岛的qPCR评定，其提高PDX1、NKX6.1、MAFA、MAFB、GLUT2、GLP1R以及PCSK1表达，与β细胞分化增加相匹配(compatible)(图8A)。这伴有各个β细胞中PDX1、MAFA和NKX6.1蛋白的增加，和保持对正常葡萄糖刺激的胰岛素分泌保持(图8B-8C)。这些观察结果表明，去氢骆驼蓬碱-GLP1组合不诱导β细胞去分化并且可能甚至维持或增强分化。

因为已在2型糖尿病(T2D)中观察到β细胞去分化(Talchai等人，“作为糖尿病β细胞衰竭机制的胰腺β细胞去分化(Pancreatic Beta Cell Dedifferentiation as aMechanism of Diabetic Beta Cell Failure)”，《细胞》150(6):1223-1234(2012)和Cinti等人，“人2型糖尿病中β细胞去分化的证据(Evidence of Beta Cell De-Differentiationin Human Type 2 Diabetes)”，《临床内分泌学和代谢杂志》101(3):1044-54(2016)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)，所以在来自患有T2D的人供体的胰岛中的β细胞中探究去氢骆驼蓬碱-GLP1组合对分化和增殖的影响。单独以及与GLP1组合的去氢骆驼蓬碱提高PDX1、MAFB、NKX6.1、GLUT2、GLP1R以及PCSK1表达(图9A)。值得注意地，如正常胰岛中出现的量，MAFA在mRNA水平上未显著增加(图8A)，但通过免疫组织化学观察到MAFA、NKX6.1和PDX1都在T2Dβ细胞中在蛋白质水平上增加，并且对葡萄糖的胰岛素分泌反应也正常，并且可能得到增强(图9A-9C)。此外，单独的去氢骆驼蓬碱激活T2Dβ细胞的β细胞增殖(图9D-9E)，这是先前未报导的观察结果。最后，去氢骆驼蓬碱-GLP1组合在T2Dβ细胞中提供与在正常β细胞中所观察到的相同的Ki67免疫标记的协同增加。

实施例6-去氢骆驼蓬碱-GLP1组合对除β细胞外的人胰岛细胞的影响

已报导去氢骆驼蓬碱诱导除β细胞外的胰岛细胞的增殖(Wang等人，“高通量化学筛选展现去氢骆驼蓬碱介导的DYRK1A抑制增加人胰腺β细胞复制”，《自然·医学》21(4):383-388(2015)；Dirice等人，“抑制DYRK1A刺激人β细胞增殖”，《糖尿病》65(6):1660-1671(2016)；和Wang等人，“人内分泌胰腺的单细胞质谱流式细胞术分析”，《细胞·代谢》24(4):616-626(2016)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)，如图10A-10B中所显示。向去氢骆驼蓬碱中添加GLP1进一步增加导管细胞的增殖(如在β细胞中一样)，但对分别产生胰高血糖素和生长抑素的α或δ细胞无额外影响，可能反映了α和δ细胞上不存在GLP1R(Pyke等人，“猴和人体组织中的GLP1受体定位：使用充分验证的单克隆抗体展现的新颖分布”，《内分泌学》155(4):1280-90(2014)；和Amisten等人，“人朗格汉斯岛中的G蛋白偶联受体的图谱和功能分析”，《药理学与治疗学》139(3):359-391(2013)，所述文献以全文引用的方式并入本文中)。去氢骆驼蓬碱和去氢骆驼蓬碱-GLP1组合处理都不诱导β细胞死亡标记物(TUNEL)(图10C-10D)。

对实施例1-6的讨论

实施例描述了几个值得注意的观察结果。第一，通过将一大组当前广泛使用的直接(GLP1类似物)或间接(DPP4抑制剂)激活GLP1R的糖尿病药物中的任一种与具有口服活性的小分子DYRK1A抑制剂(如去氢骆驼蓬碱、INDY、leucettine、5-IT、GNF4877或其它)组合，人们能够诱导先前无法得到的人β细胞复制的“速率”，或更准确地，“标记指数”。这些速率超过单独的DYRK1A抑制剂的速率，并且在人们可能设想为恢复患有2型糖尿病和或许1型糖尿病的人体内正常β细胞量所必需的范围内。第二，人β细胞增殖标记物的增加伴有成人β细胞数目的实际增加。第三，增殖的增加在严格药理学意义上具有协同性，并且甚至延伸到就其自身来说不具有增殖效应的去氢骆驼蓬碱和GLP1的剂量。重要的是，这可允许将就其自身来说不具有全身(systemic)效应的低剂量去氢骆驼蓬碱类似物添加到当前在患有T2D的人中广泛使用的标准长期药物方案中，产生对β细胞具有特异性的促有丝***效应。第四，单独和与GLP1R激动剂组合的去氢骆驼蓬碱能够诱导来源于患有T2D的人的β细胞的增殖以及分化两者，T2D为与β细胞数目不足以及去分化两者相关的疾病。最后，本文所提供的实施例延伸并且验证了用于对人β细胞数目进行计数的快速、简单并且可靠的基于FACS的分析。

这些实施例还强调了对治疗性人β细胞再生的其余障碍。一个是需要保护患有1型糖尿病的人的新产生的β细胞免于持续的免疫攻击。这项挑战目前仍未解决，但对于一大群也需要β细胞扩增的患有2型糖尿病的人来说不是障碍。第二是需要开发工具来将再生药物和成像剂特异性并且专一性地导向人β细胞。低剂量去氢骆驼蓬碱(就其自身来说不具有效应)与任何剂量GLP1R激动剂的协同功效提高了受关注的以下情况的可能性：通过在已使用GLP1受体激动剂的受试者中使用低剂量去氢骆驼蓬碱，可利用GLP1受体的β细胞特异性以便进行人β细胞增殖。

虽然已在本文中详细描绘并且描述了优选实施方案，但是相关领域的技术人员将显而易知在不脱离本发明精神的情况下可以进行各种修改、添加、替换等，并且因此将这些视为在如所附权利要求书所限定的本发明范围内。