阅读说明：本技术 MrgD免疫抗原片段、MrgD抗体及其制备方法和应用 (MrgD immune antigen fragment, MrgD antibody, preparation method and application thereof ) 是由 李鹏 吴晓光 赵锟 毛宇康 孔祥清 于 2020-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗体制备及其应用领域,具体是涉及单克隆抗体的制备及其应用于免疫荧光方面。此种抗体可与大鼠Mas相关性G蛋白耦联受体D(MrgD)结合,且具有良好的特异性,结合免疫荧光法,可快速检测心脏病理生理条件下MrgD表达水平的变化,对病理的发生发展过程提供可靠的依据。(The invention relates to the field of antibody preparation and application thereof, in particular to the preparation of a monoclonal antibody and the application thereof in immunofluorescence. The antibody can be combined with a rat Mas-related G protein coupled receptor D (MrgD), has good specificity, can be combined with an immunofluorescence method, can quickly detect the change of the MrgD expression level under the heart pathophysiology condition, and provides a reliable basis for the generation and development process of pathology.)

MrgD免疫抗原片段、MrgD抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及MrgD免疫抗原片段、MrgD抗体及其制备方法和应用，属于生物医药领域。

背景技术

高血压疾病逐年增加，其危害主要为靶器官损伤，包括心血管重构、脑卒中、肾衰、眼部疾病等。高血压的调控主要有激素调节和神经调控，前者主要为肾素-血管紧张素系统(RAS)，后者为交感副交感调控。研究发现，Mas相关性G蛋白耦联受体D(MrgD)是肾素-血管紧张素系统调控的主要受体，在肾素-血管紧张素系统调控中起到重要作用。但MrgD的体内分布以及作用机制尚未明确，因此，如果能发明一种方法，可以快速测定MrgD在体内的分布情况，对于高血压的调控有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种大鼠Mas相关性G蛋白耦联受体D(MrgD)免疫抗原片段，可用于制作MrgD抗体，MrgD抗体可用于MrgD免疫荧光示踪。

本发明采取的技术方案为：一种MrgD免疫抗原片段，其序列为：Ser Ser Pro AlaPro Gly Leu Thr Ile Ser Pro Thr Met Asp Cys。

本发明还公开了一种MrgD抗体，为上述的MrgD免疫片段注入动物体内后产生的抗体。

优选的，所述抗体为兔抗MrgD抗体。

本发明还公开了一种MrgD抗体的制备方法，其步骤包括：

(1)合成多肽片段Ser Ser Pro Ala Pro Gly Leu Thr Ile Ser Pro Thr MetAsp Cys；

(2)将步骤(1)合成的多肽片段注入动物体内进行免疫，

(3)取免疫后的动物脾脏，制成脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞融合后进行培养；

(4)取融合培养细胞，用包被MrgD蛋白的间接ELISA法筛选出滴度最高且为单克隆的细胞株进行扩大培养；

(5)将扩大培养的杂交杂交瘤细胞注入同种动物体内，收集腹水，离心取上清液；

(6)腹水上清液通过蛋白G微球柱,洗脱纯化后获得MrgD抗体。

本发明还公开了MrgD抗体在免疫荧光法检测MrgD体内分布状况中的应用。

优选的，其步骤包括：

(1)提取大鼠原代心肌细胞，在培养基中进行培养；

(2)弃去培养基，对心肌细胞进行清洗、固定、封闭处理后，加入上述的MrgD抗体过夜；

(3)PBS清洗后，加入荧光二抗cy3孵育，洗脱荧光二抗，加入抗荧光淬灭剂后封片拍照。

本发明提供了MrgD的特异性免疫抗原片段，将该片段注入动物体内，可产生MrgD抗体，MrgD抗体可与MrgD蛋白结合，具有良好的特异性，结合免疫荧光法，可快速检测心脏病理下MrgD表达水平的变化，为高血压病理的发生发展提供理论依据。

附图说明

图1：实施例2中正常的大鼠心肌细胞中MrgD分布示意图；

图2：实施例3中血管紧张素II诱导心肌肥大的大鼠心肌细胞中MrgD分布示意图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。

实施例1

1.多肽抗原合成

从大鼠MrgD序列中选择如下片段合成，SSPAPGLTISPTMDC，作为免疫抗原。

2.动物免疫

将合成的多肽抗原免疫2-3kg新西兰兔若干只。

初次免疫：抗原100ug/只，加完全弗氏佐剂佐剂(抗原和佐剂等体积混合，研磨成油包水的乳糜状)背部皮下皮下多点注射，体积1.5m l。

第二次免疫：初次免疫后间隔2周行第二次免疫，剂量途径同上，加不完全弗氏佐剂。

第三次免疫：第二次免疫后间隔2周行第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，10天后进行尾尖采血测其效价，检测免疫效价。选择效价在10⁵以上的小鼠，在融合前3天腹腔注射100ug抗原进行加强免疫。

3.细胞融合和单克隆抗体筛选

骨髓瘤细胞准备：融合前2天，将骨髓瘤细胞扩大培养。融合当天，将细胞从瓶壁吹下，收集于50ml离心管内。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。加入30ml RPMI-1640不完全培养基，离心洗涤一次。然后将细胞重悬于10ml RPMI-1640不完全培养基。

脾细胞准备：取已经免疫的新西兰兔子，处死，浸于75％酒精中5分钟，在超净台中取出脾脏置于已盛有10ml RPMI-1640不完全培养基的培养皿中，漂去血液，小心剥去周围结缔组织。在平皿上放置不锈钢筛网，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。吸取平皿中的细胞悬液置于50ml离心管中，用巴斯德吸管温柔吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只兔子1×10⁸-2.5×10⁸个脾细胞。

细胞融合：使脾细胞和骨髓瘤细胞按10:1的数量比混合于一支离心管中，加入1ml体积分数为50％的聚乙二醇(PEG4000)进行融合，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞，加至96孔细胞培养板中(每孔约有10⁵个细胞)，每孔100μl，将培养板放到37℃，5％CO2培养箱内培养，在融合第2天，添加1％HAT培养液，每孔100μl，放入37℃，5％的CO2培养箱中培养；在培养5～7天后，HAT培养基全换液一次。

4.杂交瘤细胞筛选：

在融合培养4～5天后，吸取培养液，用包被MrgD蛋白的间接ELISA法进行筛选。

5.杂交瘤细胞克隆化

通过间接ELISA法筛选出最优杂交瘤细胞后，加入含16％血清的HT培养基，混匀，混匀后铺板于96孔板中，铺板前需铺饲养细胞，铺板后放于37℃，5％CO2培养箱中培养，进行杂交瘤细胞亚克隆，当亚克隆后一周左右可进行亚克隆筛选，待克隆长势较好时可取样筛选，取上清100ul检测，选择阳性反应高的，并尽量选择单克隆的孔，待细胞长势好并当细胞生长约占孔底面积的1/4至1/3后转入24孔板，转孔前需在24孔板中铺饲养细胞，转孔后24h-72h进行滴度测定，选择滴度高的孔再次进行亚克隆，直至100％的孔为阳性，选出几株滴度高的且为单克隆的细胞株进行扩大培养，最后选出最好的一株细胞用于腹水制备。

6.单抗的生产

在新西兰兔腹腔注射杂交瘤细胞，在5-8天后兔肚子鼓起，此时可取腹水，将20ml注射器针头插在新西兰兔腹部，下面放50ml离心管，让腹水流到离心管中，每次取3ml左右，一般取3～5次，直到取完为止，取出的腹水离心(2000r/min 5分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装以后-80℃保存。

7.单抗的纯化

加入1/10腹水体积的1.0mol/L Tris(pH8.0)盐酸调含抗体腹水的pH值至8.0。将抗体溶液通过蛋白G微球柱(艾比玛特公司)。每毫升的微球能结合大约10—20毫升抗体(1个蛋白G微球分子结合2分子抗体)。记录装柱微球的大约体积。③用10倍微球柱体积的100mmol/L Tris(pH8.0)盐酸洗涤微球,接着用10倍微球柱体积的10mmol/L Tris(pH8.0)盐酸洗涤微球，然后用50mmol/L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1/2微球柱体积的缓冲液，分次加入。用含1/10微球柱体积的1mol/L Tris(pH8.0)盐酸的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性。⑥测定各收集管的280nm OD值以得到蛋白含量(10D约相当于0.75mg/ml免疫球蛋白),纯化后抗体重新进行效价测定。

实施例2

提取大鼠原代心肌细胞，在培养基DMEM+10％FBS中培养48小时候，弃去培养基、PBS清洗2遍、4％多聚甲醛固定30分钟，5％BSA封闭30分钟，加入实施例1中获得的MrgD抗体4度过夜，然后PBS清洗3遍，加入荧光二抗(cy3)常温孵育2小时，洗脱二抗，加抗荧光淬灭剂后封片拍照。如图1所示，可见正常心肌细胞中MrgD含量较低。

实施例3

提取大鼠原代心肌细胞，在加有血管紧张素II(浓度10^-6mol/L)的培养基DMEM+10％FBS中培养24小时，弃去培养基、PBS清洗2遍、4％多聚甲醛固定30分钟，5％BSA封闭30分钟，加入MrgD抗体4度过夜，然后PBS清洗3遍，加入二抗37℃孵育1小时，PBS清洗3遍，封片拍照。如图2所示，可见血管紧张素II诱导的肥大心肌细胞中MrgD表达量(高亮部分)较高。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。