具体实施方式

嵌合重组生长因子受体(CrGFR)

本文中提供了重组生长因子受体(CrGFR)，其包括：(i)细胞外(EC)结构域；(ii)血小板生成素跨膜(TM)结构域；以及(iii)嵌合生长因子受体细胞内(IC)结构域。在简单的形式中，CrGFR可以包含全长人Tpo受体(如本文中图1提供的)或其衍生物或变体，其响应于配体结合(例如这可以包括截短的血小板生成素信号结构域，该信号结构域已经表现出维持信号传导的能力)而维持信号传导和细胞增殖。CrGFR可以是模块化形式，EC、TM和IC结构域衍生自不同的受体。然而，CrGFR必须维持其在配体结合时将生长信号传递至细胞的能力。CrGFR可以在配体与TM结构域结合时被激活并且将生长信号传递至细胞。信号结构域可以包含一种或更多种另外的信号结构域

适合的CrGFR可以基于正常人组织上有限表达的GFR进行选择，例如，仅在小细胞群上表达的或局限于特定细胞类型例如c-kit的GFR。或者，生长因子受体的天然配体结合结构域可以被除去并且例如用标记或其他EC结构域置换。

CrGFR可以包括来自TpoR的无生长因子结合功能的EC结构域(例如TpoR EC结构域的截短形式)和/或标记(例如CD34)，以及TM和IC结构域。携带此类型受体的细胞的生长可以随后通过艾曲波帕与TM结构域的结合而被刺激

CrGFR可以在启动子的控制下在具有治疗活性的治疗性细胞群例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中单独表达。

或者，CrGFR可以与治疗性转基因例如嵌合抗原受体(CAR)和/或T-细胞受体(TCR)一起进行表达，例如，如图14中所述。适合的TCR和CAR在文献中是熟知的，例如HLA-A*02-NYESO-1特异性TCR(Rapoport等人，Nat Med 2015)或者抗-CD19scFv.CD3ζ融合CAR(Kochenderfer等人，J Clin Oncol 2015)，其已经成功地分别用于治疗骨髓瘤或B-细胞恶性肿瘤。本文中所述的CrGFR可以与任何已知的CAR或TCR一起被表达，因此提供具有可调节性生长开关的细胞以允许体外或体内细胞扩增/存活，以及用于抗癌活性的TCR或CAR形式的常规激活机制。因此，本发明提供用于过继性细胞疗法的细胞，该细胞包括本文中所述的CrGFR，以及与肿瘤相关抗原特异性地结合的TCR和/或CAR。

CrGFR可以具有人Tpo受体的TM结构域和第一IC结构域，以及野生型或截短的Tpo受体EC结构域(没有天然配体结合功能)。

CrGFR的具体实施方案包括图1和2中所示的那些。

在一些实施方案中，构建生长因子受体(CrGFR)，使得该CrGFR是基于TpoR受体，其中保留至少TM区和IC区(参见SEQ ID No.1，其示出TpoR TM结构域和514-635和TpoR胞质结构域)，并且另外的(第二)IC结构域被添加到构建体，以增强响应于Tpo或Tpo激动剂结合的信号传导。因此，在一些实施方案中，CrGFR包括：(i)TpoR细胞外(EC)结构域或截短的TpoREC结构域；(ii)血小板生成素跨膜(TM)结构域；以及(iii)包括人血小板生成素IC结构域(或其截短的变体，例如Δ60)的第一细胞内(IC)结构域；以及(iv)第二细胞内结构域，其中该第二细胞内结构域选自来自共刺激受体、细胞因子受体、共信号受体或人血小板生成素受体(c-mpl)的IC结构域。例如，该第二IC结构域可以是来自CD40、IL2R(IL2rβ、IL2Rγ)、ITAM1或LMP1的IC结构域。

在一些实施方案中，crGFR包括i)EC结构域；以及SEQ ID No 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中所示的TM和IC结构域，或其具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性的变体。适合的EC结构域包括本文中所述的那些，例如截短的TpoR EC结构域。这些受体保留它们的结合人血小板生成素或血小板生成素受体激动剂的能力。

在其他实施方案中，wt Tpo的IC结构域被来自适合的受体例如LMP1、IL2R、CD28或CD137的IC结构域置换；这种构建体的实例示出于图1中“TpoR.LMP1”“TpoR.IL2rβ-cyt.TpoR-cyt”，以及图2中“TpoRec.TpoRtm CD28cyto”和“TpoRec.TpoRtm CD137cyto”。

EC结构域

EC结构域可以是来自TpoR的EC结构域(SEQ ID No:1)或其衍生物或变体，其响应于配体与该受体结合而维持信号传导和细胞增殖。

EC结构域可以不是CrGFR信号传导所需的，例如，若使用TM结构域，其可以在配体结合例如TpoR TM结构域时使受体激活。EC结构域可以是截短的或突变的天然结构域(例如没有配体结合功能)，例如，截短的TpoR EC结构域。天然EC结构域可以被标记例如截短的CD34置换以便选择和/或体内监测。

TM结构域

可以使用来自Tpo受体(TpoR)的TM结构域(图1中所示)，包括其衍生物或变体，其响应于配体与该受体结合而维持信号传导和细胞增殖。因为已知TpoR在正常人组织中具有有限的表达并且还已知其与艾曲波帕、鲁索曲波帕(Lusutrombopag)和阿伐曲泊帕结合，所以这可以是有用的，因此，包括来自Tpo受体的TM结构域的CrGFR可以通过使细胞在体外或体内暴露于具有已知毒性特征的临床上验证的化合物而被激活。

IC结构域

可以使用来自Tpo受体的生长因子受体细胞内(IC)结构域(SEQ ID N^o 1中所示)，包括其衍生物或变体，其响应于配体与该受体(例如截短的TpoR信号结构域例如SEQ ID N^o2中所示的)结合而维持信号传导和细胞增殖。这可以与来自Tpo受体的TM结构域组合以便响应于配体结合而达到细胞增殖的良好水平。

生长因子受体样的其他IC结构域可以适合用于构建本发明的CrGFR，因为已知这些受体激活与Tpo受体相同的细胞信号传导通路。例如，来自G-CSF、GM-CSF、催乳素或人生长激素的IC结构域可以在与TpoR TM结构域组合时用于构建CrGFR。包括这些IC结构域的CrGFR响应于受体激动剂例如艾曲波帕而诱导细胞增殖的能力可以随后利用本文的实施例中所述的方法进行确定。TpoR IC结构域可以在C-末端处截短多达79个氨基酸。此上的截短已经表明完全敲除TpoR活性(Gurney等人，PNAS 1995)。

此外，该IC结构域还可以包括衍生自(但不限于)以下之一的第二结构域：细胞因子受体信号结构域(例如IL2受体)、共信号结构域(例如CD40)、病毒致癌性蛋白(例如LMP1)、共刺激结构域(例如CD28、CD137、CD150等)或其他促有丝分裂的结构域(例如Toll样受体、免疫受体酪氨酸激活基序、CD3信号结构域等)。

细胞因子受体是在多种细胞类型上表达的广泛的受体组，并且参与通过与可溶性细胞因子结合而感测细胞外环境提示。此结合事件引起经由JAK/STAT信号传导的信号级联，导致涉及存活和扩增的基因的上调。这种受体包括IL-2受体、IL-4受体和血小板生成素受体(Liongue等人，2016)。共刺激受体是参与在细胞通过T-细胞受体接收初级信号时增强T-细胞的活性的蛋白。这是基于信号1和信号2的构思，由此信号1通过T-细胞受体与肽-MHC衔接而被递送，并且信号2通过T-细胞上的共刺激受体与靶细胞(例如树突状细胞)上的共刺激配体衔接而被递送。通过共刺激结构域递送的信号2为T-细胞提供关键的存活信号。常见的共刺激受体包括CD28、CD137和CD150(Leitner等人，2010)。术语共信号定义细胞膜蛋白组，其提供相似的支持性信号至共刺激受体所述的那些，但是在某些情形下可能通常不被视为共刺激，这是因为它们可能在T-细胞上未被表达，这种受体包括在抗原呈递细胞中被正常表达的CD40，在其中它在T-细胞上表达的CD40-配体衔接时增强存活(He等人，2012；Kumar等人，2018)。

此第二IC结构域可以直接地或经由接头结构域被融合至第一IC结构域(例如TpoRIC结构域，其排列成紧邻跨膜Tpo结构域)的C-末端。因此，嵌合生长因子受体可以包括TpoR跨膜结构域和TpoR IC结构域(第一IC结构域)以及第二IC结构域，该第二IC结构域可以来自TpoR，或者可以是细胞因子受体信号结构域、共信号结构域、病毒致癌性蛋白(例如LMP1)或共刺激结构域，例如前一段落中论述的那些。

此外，共刺激、共抑制或共信号结构域可以被直接地融合至TpoR跨膜结构域而产生受体，例如图2和SEQ ID N^o 13和14中所示的那些受体。这些受体可以包括另外的(第二)IC结构域，例如TpoR结构域。

细胞

用于本发明的细胞可以是可用于过继性细胞疗法的任何淋巴细胞，例如T-细胞或自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、γ/δT-细胞或调节性T细胞。所述细胞可以是同种异体的或自体的。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中具有核心作用的淋巴细胞类型。它们可以通过在细胞表面上存在T-细胞受体(TCR)而区别于其他淋巴细胞，例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)。存在多种类型的T细胞，如以下概述。

细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)杀死病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。CTL在它们的表面表达CD8分子。这些细胞通过与存在于所有有核细胞的表面上的MHCI类相关抗原结合而识别它们的靶标。通过IL-10、腺苷以及由调节性T细胞分泌的其他分子，CD8+细胞可以失活至无反应性状态，由此防止自身免疫疾病例如试验性自身免疫脑脊髓炎。

记忆T细胞是在感染已经消除之后长期继续存在的抗原特异性T细胞亚群。它们在重新暴露于它们的同源抗原时快速地扩增至大量的效应T细胞，因此提供对过去的感染具有“记忆”的免疫系统。记忆T细胞包括三种子类型：中枢记忆T细胞(TCM细胞)以及两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

调节性T细胞(Treg细胞)，原先称为抑制性T细胞，对维持免疫耐受性是关键的。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫，趋向于结束免疫反应并且抑制逃逸胸腺中的负选择过程的自体反应性T细胞。

已经描述两种主要类别的CD4+Treg细胞—天然存在的Treg细胞和适应性Treg细胞。

天然存在的Treg细胞(还称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)在胸腺中产生并且已经与介于发育中的T细胞和已经用TSLP激活的髓样(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞之间的相互作用连接。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在而区别于其他T细胞。

适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间产生。

自然杀伤细胞(或NK细胞)是构成固有免疫系统的部分的溶细胞性细胞类型。NK细胞以MHC非依赖性方式对来自病毒感染的细胞的固有信号提供快速应答。

NK细胞(属于固有的淋巴样细胞组)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)并且构成从常见的产生淋巴样祖细胞的B和T淋巴细胞分化的第三种细胞。

核酸

本发明的一方面提供本发明的核酸序列，该核酸序列编码本文中所述的CrGFR、多肽或蛋白(包括其功能性部分和功能性变体)中的任一种。

本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”意在彼此同义。

技术人员将理解，由于遗传密码简并，所以许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。此外，应理解，技术人员可以利用常规技术进行核苷酸置换，所述核苷酸置换不影响由在此所述的多核苷酸编码的多肽序列，从而反映了在其中要表达该多肽的任何特定宿主生物体的密码子选用，例如密码子优化。

根据本发明所述的核酸可以包括DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们还可以是在其中包含合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域中已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸骨架，在分子的3'和/或5'端处添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本发明的目的，应理解，多核苷酸可以通过本领域中可用的任何方法进行修饰。可以实施这种修饰以增强目的多核苷酸的体内活性或寿命。

与核苷酸序列相关的术语“变体”、“同源体”或“衍生物”包括对该序列的一个(或更多个)核酸进行的任何置换、变异、修饰、替代、缺失或添加。

核酸序列可以编码SEQ ID NO.3至14中所示的蛋白序列或其变体，包括编码或包括Tpo受体的截短形式的核酸序列，例如SEQ ID No 2中所示的核酸序列。

核苷酸序列可以包括SEQ ID NO 17至28中所示的TpoR的核苷酸序列，或其变体。

本发明还提供核酸序列，该核酸序列包括编码CrGFR的核酸序列以及编码T-细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)的其他核酸序列。

所述核酸序列可以由允许共表达两种或更多种核酸序列的序列进行连接。例如，该构建体可以包括内部启动子、内部核糖体进入序列(IRES)序列或编码切割位点的序列。该切割位点可以是自切割，从而在产生多肽时，它被立即切割成分离的蛋白而无需任何外部切割活性。

各种自切割位点是已知的，包括足口病病毒(FMDV)和2a自切割肽。

共表达序列可以是内部核糖体进入序列(IRES)。共表达序列可以是内部启动子。

载体

在一方面中，本发明提供载体，该载体包括本发明的核酸序列或核酸构建体。

这种载体可以用于将核酸序列(一种或更多种)或核酸构建体(一种或更多种)引入宿主细胞中，以便其表达根据本发明的第一方面所述的一种或更多种CrGFR，以及任选地，一种或更多种其他目的蛋白(POI)，例如TCR或CAR。

所述载体可以是，例如，质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成mRNA。衍生自逆转录病毒例如慢病毒的载体是实现长期基因转移的适合工具，因为它们允许长期稳定地整合一个或多个转基因及其在子细胞中繁殖。

所述载体可以能够转染或转导包括T细胞或NK细胞的淋巴细胞。

本发明还提供载体，在所述载体中插入本发明的核酸。

编码CrGFR以及任选地TCR或CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CrGFR和TCR/CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至一个或更多个启动子并且将该构建体并入表达载体中来实现。所述载体可以适合于在真核细胞中复制和整合。典型的克隆载体包含用于调节期望的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列，以及启动子。

病毒载体技术是本领域中熟知的，并且在例如Sambrook等人，(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)，以及其他病毒学和分子生物学手册(还参见，WO 01/96584；WO 01/29058和美国专利号6,326,193)中有述。

在一些实施方案中，所述核酸构建体如本文的附图中所示。在一些实施方案中，所述核酸是多顺反子构建体，其允许在单启动子的控制下表达多个转基因(例如CrGFR和TCR和/或CAR等)。在一些实施方案中，转基因(例如CrGFR和TCR和/或CAR等)被自切割2A肽分离。用于本发明的核酸构建体的2A肽的实例包括F2A、P2A、T2A和E2A。在本发明的其他实施方案中，本发明的核酸构建体是包括两个启动子的多顺反子构建体；一个启动子驱动CrGFR的表达而另一个启动子驱动TCR或CAR的表达。在一些实施方案中，本发明的双启动子构建体是单向的。在其他实施方案中，本发明的双启动子构建体是双向的。

为了评估CrGFR多肽或其部分的表达，待被引入细胞中的表达载体还可以包含可选择的标记基因或报道基因或二者以促进从试图通过病毒载体进行转染或转导的细胞群中识别和选择表达细胞。该CrGFR多肽可以包含标记例如CD34，作为EC结构域的部分。

药物组合物

本发明还涉及药物组合物，该药物组合物包含本发明的载体或表达CrGFR的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，以及任选地一种或更多种其他药学上活性的多肽和/或化合物。这种制剂可以是例如适合于静脉输注的形式。

治疗方法

用于本发明的方法中的表达CrGFR的细胞(包括T细胞和NK细胞)可以在离体从患者自己的外周血(自体)产生，或者来自供体外周血或来自不相关供体的外周血(同种异体)的造血干细胞移植的情况下产生。或者，T-细胞或NK细胞可以衍生自可诱导的祖细胞或胚胎祖细胞在离体分化成T-细胞或NK细胞。在这些情形中，表达CrGFR以及任选地CAR和/或TCR的T-细胞是通过包括用病毒载体转导、用DNA或RNA转染在内的许多方法之一来引入编码CrGFR以及任选地CAR和/或TCR的DNA或RNA而产生。

表达本发明的CrGFR以及任选地表达CAR和/或TCR的T-细胞或NK细胞可以用于治疗血癌或实体瘤。

用于治疗疾病的方法涉及本发明的载体或细胞包括T细胞或NK细胞的治疗用途。在此方面中，所述载体或T细胞或NK细胞可以被施用给患有现有疾病或病症的受试者，以便减缓、减轻或改善与该疾病相关联的至少一种症状和/或放缓、减缓或阻止该疾病的进程。本发明的方法可以导致或促进T-细胞介导的杀死癌细胞。

根据本发明所述的载体或T细胞或NK细胞可以与一种或更多种另外的治疗剂一起向患者施用。所述一种或更多种另外的治疗剂可以合并施用给患者。“合并施用”表示在足够接近的时间施用一种或更多种另外的治疗剂和本发明的载体或T细胞或NK细胞，从而所述载体或T细胞或NK细胞可以增强一种或更多种另外的治疗剂的效果，反之亦然。就此而言，所述载体或细胞可以首先被施用，而所述一种或更多种另外的治疗剂可以其次被施用，反之亦然。或者，所述载体或细胞与所述一种或更多种另外的治疗剂可以同时被施用。可以与本发明的载体或细胞一起合并施用的适合的治疗剂包括激活CrGFR的任何生长因子受体激动剂，例如，艾曲波帕(rINN,代号SB-497115-GR)、鲁索曲波帕和阿伐曲泊帕或罗米司亭(Romiplostim)。

艾曲波帕在本发明的方法中可以特别有用，因为其毒性特征是已知的。在临床前研究中，该化合物表现出与血小板生成素受体选择性地相互作用，导致激活JAK-STAT信号传导通路并且增加巨核细胞的增殖和分化。动物研究证实施用可以增加血小板计数。在73名健康志愿者中，更高剂量的艾曲波帕造成循环血小板数量的更大增加而没有耐受性问题，参见，例如，Jenkins JM,Williams D,Deng Y,Uhl J,Kitchen V,Collins D,Erickson-Miller CL(Jun 2007)."Phase 1clinical study of eltrombopag,an oral,nonpeptidethrombopoietin receptor agonist".Blood 109(11):4739–41。因此，在本发明的方法中，艾曲波帕的适合的剂量可以基于先前发表的临床研究和本文中所述的体外测定进行确定。

可以使用的另一种治疗剂是IL-2，因为这目前用于现有的细胞疗法中以增强被施用的细胞的活性。然而，如上文所述，IL-2治疗与毒性和耐受性问题相关联。因此，本发明的目的是利用与CrGFR结合的激动剂来刺激细胞增殖，并且因此将必须施用的IL-2的量降低(例如至较低毒性的水平)或者甚至消除对IL-2施用的需求。

为了本发明的方法，其中细胞被施用给患者，所述细胞可以是对该患者而言同种异体的或自体的细胞。

基于本公开，本发明的各种其他方面和实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。

本说明书中提及的全部文件通过援引而整体并入本文中。

在本文中使用的“和/或”应被视为具体公开了两个指定的特征或组分中的每一个，在有或无另一个的情况下。例如“A和/或B”应被视为具体公开了(i)A、(ii)B以及(iii)A和B中的每一个，正如同在本文中单独地列出每一个。

除非上下文另外说明，对上述特征的描述和定义不限于本发明的任何具体的方面或实施方案，并且同等地适用于描述的全部的方面和实施方案。

现在将通过实施例并且参考上述附图和下述表来说明本发明的某些方面和实施方案。

实施例

实施例1–表达CrGFR的T-细胞的产生和评价

材料和方法

质粒

pSF.Lenti.EF1α质粒由Oxford Genetics产生，是通过用延伸因子(EF)1α启动子置换pSF.Lenti.CMV.PGK.puro中现有的CMV启动子而产生pSF.Lenti.EF1α.PGK.puro。将PGK.Puro片段随后除去并且经由XbaI/NheI消化(NheI位点在嘌呤霉素抗性基因的下游)克隆TpoR构建体。包装质粒pVSVg、pCgpV和pRSV.Rev(ViraSafe慢病毒包装系统–Pantropic)从Cell Biolabs(VPK-206)获得。

试剂

以下试剂从以下生产商获得：

Abcam–DRAQ7(AB109202-1ml)

Miltenyi Biotec–抗-黑色素瘤(MCSP)-PE(130-099-413)；抗-CD34-APC(130-090-954)、抗-CD45-FITC(130-080-202)、抗-CD71-APC(130-099-239)、抗-CD110-PE

BD Biosciences–抗-CD34-PE(555822)；

E-Biosciences–可固定的活力染料eFlor 450(65-0863-18)、可固定的活力染料eFlor780(65-0865-18),

细胞系

将Jurkat E6.1细胞系和Ba/F3细胞系在补加有10％FCS(F9665-500ml:Sigma)、1％1M HEPES(H0887-100ml)和1％青霉素/链霉素(P0781-100ml)的RPMI(T-细胞培养基：TCM)中进行培养。将细胞系293T常规地在补加有10％FCS和1％青霉素/链霉素(P0781-100ml)(D10)的DMEM中进行培养。

T-细胞分离

将T-细胞从PBMC从血液黄层(buffy coat)分离。简言之，血液黄层从NHSBT获得，并且将PBMC通过Ficoll-介导的密度离心进行分离。利用顺磁性珠，对未受影响的T-细胞进行分离(参见以下)。将T-细胞在补加有10％FCS(F9665-500ml:Sigma)、1％1M HEPES(H0887-100ml)和1％青霉素/链霉素(P0781-100ml)的RPMI(T-细胞培养基：TCM)中进行培养。

慢病毒产生

在聚-d-赖氨酸涂布的T75烧瓶(Greiner)中转染之前的一天，将6×10⁶293T细胞在10ml D10中培养。在转染的当天，配制了0.025M HEPES缓冲的无血清的DMEM(pH7.1)和0.025M HEPES缓冲的D10(pH 7.9)。利用10μg慢病毒转移质粒(pSF.Lenti)和10μg的每种pVSVg、pCgpV和pRSV.Rev以及CaCl₂，每个烧瓶，将1.5ml转染混合物在pH7.1培养基中配制成0.05M的最终浓度。转染复合物在被逐滴加到包含6ml pH7.9培养基的烧瓶中之前在30min期间得以形成。24h后，将培养基更换成10ml新鲜D10。24和48h后，将培养基收集、合并并且利用Lenti-X浓缩器(Clontech-Takara:631232)进行浓缩。将浓缩的慢病毒颗粒重新悬浮于10x初始上清液体积中并且储藏在-80℃下直到使用。

T-细胞转导

将1x10⁵ T-细胞添加到平底96-孔板的每个孔中。在将补加有4μg/ml凝聚胺(海美溴铵-Sigma:H9268-5G)和指示浓度的IL-2的慢病毒上清液50-100μl添加之前，将该板离心并且将上清液抽吸。在一些情形中，以生产商推荐的浓度加入激活试剂：Dynabeads^TM人T-激活剂CD3/CD28(Thermo Fisher:11131D)、Dynabeads^TM人T-激活剂CD3/CD28/CD137(ThermoFisher 11162D)。

顺磁性珠分类

顺磁性珠分类是根据生产商的说明利用抗-PE微珠(Miltenyi Biotec或StemCellTechnologies)或T-细胞分离珠(17951:StemCell Technologies)进行

快速扩增操作方案(REP)

T-细胞是利用经辐照的血液黄层饲养层进行扩增。简言之，从NHSBT获得了10份经辐照的血液黄层，将PBMC通过Ficoll-介导的密度离心进行分离，混合和冷冻保存。在T25培养瓶中，将解冻的血液黄层饲养层以1:20–1:100比例以在TCM+200IU/ml IL-2和1μg/ml植物血凝素中1x10⁶细胞/ml的最终浓度与T-细胞进行混合。在最初五天期间，将直立的烧瓶定位在45°角，其后将该烧瓶恢复成直立，并进行培养基半换液。每2-3天更换培养基，添加新鲜的IL-2至200IU/ml的最终浓度，持续14天，其后将细胞冷冻保存或者直接进行测定。

构建体设计

先前我们已经验证，TpoR可以在原代人T-细胞中具有活性。然而，修饰该受体的尝试并非总是简单的。例如，TpoR Ec结构域和GCSF IC结构域之间的融合体没有在细胞表面表达。此外，催乳素受体融合体没有表现出完全地表面稳定。此外，我们意识到我们可以通过包括激活JAK3(参与IL-2信号传导但不参与TpoR信号传导的信号分子)的信号组分而改善在T-细胞中基于TpoR的受体的信号传导能力，并且因此更可能在工程细胞中驱动IL-2相似的信号。

因此，我们目的在于产生融合受体，其中另外的结构域被直接地融合至TpoR IC结构域的C-末端。我们首先产生TpoR和IL2rβ信号结构域之间的融合体。先前尝试通过完全除去TpoR细胞内结构域来产生TpoR和IL2rβ之间的融合体获得了受体，该受体未充分表达。因此，我们采取替代方法，其中产生了杂交TpoR-IL2rβ信号结构域，由此Il2rβ信号区以N-末端或C-末端融合至TpoR信号结构域。接着，我们产生了受体，其中TIAF1、TLR1、CD150、IL2rγ、CD40、LMP1以及来自CD3ζ的ITAM1的胞质结构域以C-末端融合至TpoR信号结构域。选择这些受体的原因如下：TIAF1–有证据表明TIAF1结合JAK3(Ji等人，2000)；TLR1/CD40–TLR和CD40之间的协同已经表明诱导T-细胞扩增(Ahonen等人，2004)，此外，CD40已经呈现出与JAK3结合并且在B-细胞中信号传导需要JAK3(Hanissian&Geha 1997)；CD150–有证据表明CD150可以保护T-细胞免于IL-2剥夺(Aversa等人，1997)；ITAM1–我们决定将来自CD3ζ的单个ITAM融合到TpoR的C-末端上以试图诱导促有丝分裂的应答；LMP1–来自EBV病毒的LMP1已经表现出与JAK3相互作用(Gires等人，1999)，另外，我们还将LMP1直接地融合至TpoR跨膜结构域，因为我们认识到TpoR胞质结构域融合体将相当大并且可能无法充分表达。我们还产生了由与CD28和CD137的胞质结构域融合的TpoR细胞外和跨膜结构域组成的CrGFR，因为我们认识到这些将在艾曲波帕给药时提供共刺激生长信号，这些构建体的序列如下所示。

将所述构建体经由XbaI和NheI位点克隆到pSF.Lenti(Oxford Genetics)中。所有的片段和构建体通过Genewiz进行密码子优化、基因合成和克隆。

慢病毒产生–慢病毒产生是利用三质粒包装系统(Cell Biolabs,圣地亚哥,美国)通过在包含50mM CaCl2的无血清RPMI中将10μg的每种质粒、加10μg的包含转基因的pSF.Lenti慢病毒质粒混合在一起来执行。在75cm2烧瓶中，将该混合物逐滴地添加到293T细胞的50％汇合的单层。将病毒上清液在转染后48h和72h时收集，合并，并且利用LentiPac慢病毒上清液浓缩(GeneCopoeia,罗克维尔,马里兰州,美国)方案根据该生产商的说明进行浓缩。将慢病毒上清液浓缩10倍并且在4μg/ml凝聚胺(Sigma-Aldrich,多塞特,英国)存在下直接用于感染原代人T-细胞。

在添加慢病毒上清液之前，在利用T-细胞激活和扩增珠(Invitrogen)根据该生产商的说明在24小时期间进行激活之前，将外周血单核细胞从正常健康的供体分离。

在扩增后，将细胞过度地洗涤以除去任何外源性IL2并且置于96-孔U形底板中。细胞补加IL2(Proleukin)或艾曲波帕(Stratech Scientific,Suffolk,英国)。其后在多个时间点，将细胞用1:400稀释的eFlor-450可固定的活力染料(eBioscience,英国)进行染色并且利用MACSQuant细胞计直接从孔进行计数，或者用DRAQ7活力染料加藻红蛋白缀合的抗-CD110抗体(Miltenyi Biotec,英国)进行染色并且利用MACSQuant细胞计进行分析。然后，利用MACSQuantify软件(Miltenyi Biotec,英国)，对细胞活力和/或转导水平进行分析。

结果

我们最初在Jurkat E6.1和Ba/F3细胞(分别是人T-细胞淋巴瘤和IL-3依赖性鼠B-细胞系)中与wt受体对比检测CrGFR的功能性和表达谱。虽然Ba/F3既不是人的，也不是T-细胞，但是它们将至少表明受体是否可以适当地折叠和表达，以及它们是否能够传递信号。制备慢病毒颗粒并且直接用于感染Jurkat E6.1和Ba/F3细胞。在表达48h之后，通过使用PE缀合的抗-CD110抗体，对Jurkat细胞进行分析。将Ba/F3细胞与艾曲波帕或鼠IL-3一起孵育，并且在多天期间通过流式细胞术分析CD110表达来评估CrGFR的表达。图4示出全部所述受体都可以成功地在Jurkat E6.1细胞中被检测到，但是三种受体(TpoR.SLAM、TpoR.TIAF1和TpoR.IL2rβ-cyt.TpoR-cyt)具有低表达谱，表明它们在表面表达得不是特别好。在Ba/F3细胞中，所有的所述受体都被表达，并且可以通过添加艾曲波帕而非预料的IL-3而在细胞群中进行富集(图5)。然而，这两种IL2rβ融合受体–虽然能够在细胞群中被富集–但是在Ba/F3中具有较差的存活曲线，并且对于这些受体，由于缺少可存活的细胞，所以测定必须缩短。

接着，我们获取这些受体，并且使它们在原代人T-细胞中得以表达，并且使这些细胞暴露于IL-2或艾曲波帕。将三种供体原代人T-细胞群从血液黄层分离，并且在CD3/CD28Dynabead的存在下用指示的慢病毒构建体进行转导。在扩增之后，将细胞与IL-2或艾曲波帕一起孵育。结果示于图6、7和8中(x3供体)。我们观察到在一些供体中具有一些所述受体的T-细胞的扩增/存活增高。在21天之后，我们总体地通过查看细胞的比例来分析此数据集，对于明显的CD110+细胞群，显示出相当高比例的可存活的细胞。这将我们要分析的受体组进一步缩窄至：TpoR.CD40、TpOR.IL2rγ、TpoR.ITAM1、TpOR.LMP1-cyt和TpoR.TpoR-cyt-LMP1-cyt。虽然TpoR.Δ60也显得良好，但是最初基于这可以随后被并入下一代融合受体中的想法，对此我们没有继续探讨。

接着，我们重复实验，但是利用从第一轮选择确定的受体，利用CD110+选择通过顺磁性珠选择来分选CrGFR+细胞(图10、11和12)。我们观察到，在所有三种供体中，移植大部分CrGFR的T-细胞的存活增强。具体地，我们观察到，在第二供体中，WT-TpoR、TpOR.CD40、TpOR.IL2rγ和TpoR.LMP1-cyto细胞的扩增(图12)高于仅在培养基情况下的扩增。

我们接着在过继性细胞疗法的模型中通过工程改造肿瘤浸润淋巴细胞来评估这些受体促进存活/扩增的能力。将来自患者TIL042(Uveal黑色素瘤)的TIL用变体或wtCrGFR进行工程改造并且与患者匹配的肿瘤细胞(CTUM42.1)混合。在第4天和第7天，对总体细胞以及CD110+细胞进行计数。我们观察到细胞数量的初始下降，大概由AICD或内在抑制因子所致。然而，在第4天和第7天之间，我们观察到，对于用艾曲波帕或艾曲波帕+低剂量IL-2检测的所有受体，CD110+细胞的数量增高。TpoR.CD40的效应特别令人鼓舞，因为它在单独IL2中没有表现出非特异性富集，在检测的其他受体的情况下观察到非特异性富集的效应。

我们在卵巢TIL中进一步评价CrGFR的效果。将三种卵巢TIL细胞群工程改造为表达WT或TpoR.CD40、TpoR.IL2rγ或TpoR.LMP1-Cyt变体受体，并且在存在或不存在艾曲波帕下与患者匹配的肿瘤细胞混合。在第4天和第7天之后，对总体细胞和CD110+细胞进行计数。我们观察到，对于所有受体除了TpOR.LMP1.cyt之外，在供体2和供体3中，在第4天和第7天之间，在肿瘤存在下，CrGFR+细胞的特异性扩增。在供体1中，我们观察到，虽然没有CrGFR+细胞的特异性扩增，艾曲波帕的添加表现出保护细胞免于AICD(激活诱导的细胞死亡)。重要地，我们观察到，在所有三种供体中，TpoR.IL2rγ和TpoR.CD40变体的活性都优异于WT受体的活性(图13)。

最后，在表达CrGFR的T-细胞与培养基、细胞因子或药物一起进行治疗时，我们通过进行磷酸化STAT分析来验证新型CrGFR的信号传导可能性。为此，将来自4个供体的T-细胞用wt TpoR、TpoR.CD40或TpoR.IL2rγ转导，利用顺磁性珠选择操作方案对CrGFR表达进行富集，然后利用多克隆刺激进行扩增。在甲醇固定、透化和利用pSTAT特异性抗体分析之前，将细胞用单独的培养基(RPMI)、IL-2、Tpo或艾曲波帕(Elt)处理4小时。STAT分子是在细胞因子激活细胞时细胞信号传导的关键驱动因素，具体而言，pSTAT5对IL-2活性是关键的。实际上，在IL-2而非培养基孵育时，我们观察到pSTAT5的诱导。IL-12作为对照不能够诱导STAT5激活，如在此实验中观察到的。Tpo和艾曲波帕特别表现出STAT5活性的诱导。这对于TpoR.IL2rγCrGFR最明显可见，表明在用艾曲波帕刺激时对正确的STAT5激活通路具有明显激活。

结论

响应于临床上可用的药物的生长因子受体可以通过基因转移技术转移至T-细胞，并且在其中维持它们的功能性能以递送细胞生长/存活信号。重要地，我们示出，作为实施例，基于TpoR-的CrGFR移植的原代人T-细胞响应于临床上可用的药物艾曲波帕并且在通常优化T-细胞生长所需的IL-2不存在下扩增并且存活。

在此，我们检测了多种功能性变体；基于TpoR融合到来自多种共刺激或共信号分子或其他生长因子受体的信号结构域。我们已经示出，在原代人T-细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中，在TpoR激动剂艾曲波帕存在下，这些受体致使IL-2非依赖性生长和存活。具体地，我们观察到，TpoR.CD40融合CrGFR致使TIL的极特异性艾曲波帕介导的存活/扩增，并且在原代人T-细胞中表现出最佳活性。

本发明的方面和实施方案还在以下条款中阐述：

1.T细胞或NK细胞，包含嵌合重组生长因子受体(CrGFR)，所述嵌合重组生长因子受体包括：

(i)细胞外(EC)结构域；

(ii)血小板生成素跨膜(TM)结构域；和

(iii)嵌合生长因子受体细胞内(IC)结构域。

2.根据条款1所述的T细胞或NK细胞，其中配体与所述CrGFR的结合诱导所述T细胞或NK细胞的增殖。

3.根据条款2所述的T细胞或NK细胞，其中所述配体是人血小板生成素、血小板生成素受体激动剂，或肿瘤相关抗原。

4.根据条款3所述的T细胞或NK细胞，其中所述血小板生成素受体激动剂与所述TM结构域结合。

5.根据条款3或4所述的T细胞或NK细胞，其中所述血小板生成素受体激动剂选自艾曲波帕和罗米司亭。

6.根据在前条款所述的T细胞或NK细胞，其中所述EC结构域包括人c-mpl EC结构域。

7.根据在前条款所述的T细胞或NK细胞，其中所述EC结构域包括i)截短的EC结构域、ii)截短的c-mpl EC结构域、iii)与肿瘤相关抗原结合的结构域、iv)与肿瘤相关抗原结合的抗体或抗体片段，以及v)选择标记中的一种或更多种。

8.根据在前条款所述的T细胞或NK细胞，其中所述IC结构域包括共刺激、共抑制或共信号结构域，其衍生自任何共刺激、共抑制或共信号分子，例如，但不限于，CD2、CD27、CD28、CD29、CD134、CD137、CD150、PD1等。

9.根据在前条款所述的T细胞或NK细胞，其中第一IC结构域选自：人生长激素受体、人催乳素受体、人血小板生成素受体(c-mpl)、G-CSF受体或GM-CSF受体。

10.根据在前条款所述的T细胞或NK细胞，其中另外的IC结构域选自：人生长激素受体、人催乳素受体、人血小板生成素受体(c-mpl)、G-CSF受体或GM-CSF受体，或者共刺激或共信号受体。此外，该IC结构域还包括第二结构域，该第二结构域衍生自(但不限于)以下之一：细胞因子受体信号结构域(例如IL2受体)、共信号结构域(例如CD40)、病毒致癌性蛋白(例如LMP1)、共刺激结构域(例如CD28、CD137、CD150等)或其他促有丝分裂的结构域(例如Toll样受体、免疫受体酪氨酸激活基序、CD3信号结构域等)。此第二结构域直接地或经由接头结构域而融合至TpoR IC结构域的C-末端或N-末端。

10.根据在前条款所述的T细胞或NK细胞，具有人血小板生成素受体TM结构域，或其具有至少80％序列同一性的变体，其结合人血小板生成素或血小板生成素受体激动剂。

11.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 3所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

12.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 4所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

13.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 5所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

14.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 6所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

15.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 7所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

16.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 8所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

17.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 9所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

18.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 10所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

19.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 11所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

20.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 12所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或在C-末端处截短多达79个氨基酸的TpoR IC结构域，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

21.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 13所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

22.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，其中所述CrGFR包括SEQ ID N^o 14所示的序列，或其在蛋白水平上具有至少80％序列同一性的变体，或对合成激动剂药物例如艾曲波帕维持应答能力的可替代的EC结构域，

23.根据在前权利要求所述的T细胞或NK细胞，包括SEQ ID N^o 3至14中的任一个所示的序列，或其变体，所述变体具有至少80％序列同一性但保留i)与人血小板生成素或人血小板生成素受体激动剂结合；和ii)诱导细胞增殖或存活的能力

24.根据任一在前条款所述的T细胞或NK细胞，其与艾曲波帕结合。

25.根据任一在前条款所述的T细胞或NK细胞，其中所述T细胞选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、调节性T细胞(Treg)或原代T细胞。

26.根据任一在前条款所述的T细胞或NK细胞，进一步包括重组T-细胞受体(TCR)和/或嵌合抗原受体(CAR)。

27.核酸序列，编码任一在前条款中定义的CrGFR。

28.根据条款27所述的核酸序列，包括SEQ ID N^o 17至28所示的序列，或其变体，所述变体没有改变翻译的蛋白序列。

29.根据条款27所述的核酸序列，包括SEQ ID 3-12所示的序列但具有SEQ ID N^o2中所示的IC结构域。

30.载体，包括根据条款27-29所述的核酸序列，或其不改变翻译的蛋白序列的任何变体

31.制备根据条款1-26中的任一项所述的T细胞或NK细胞的方法，所述方法包括将根据条款27-29所述的核酸或根据条款19-28所述的载体引入T细胞或NK细胞中的步骤。

32.药物组合物，包括根据条款30所述的载体或根据条款1-26所述的T细胞或NK细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

33.体内细胞扩增的方法，包括向受试者施用根据条款1-26所述的细胞或根据条款32所述的药物组合物。

34.根据条款33所述的体内细胞扩增的方法，包括向受试者施用血小板生成素或血小板生成素受体激动剂例如艾曲波帕或罗米司亭。

35.根据条款1-26中的任一项所述的T细胞或NK细胞，或根据条款30所述的载体，用于过继性细胞疗法。

36.根据条款1-26中的任一项所述的T细胞或NK细胞，或根据条款30所述的载体，用于治疗癌症的方法中。

37.治疗癌症的方法，包括向受试者施用根据条款1-26中的任一项所述的T细胞或NK细胞的步骤。

38.根据条款30所述的载体或根据条款1-26中的任一项所述的T细胞或NK细胞在生产用于治疗癌症的药物中的用途。

39.艾曲波帕，用于过继性细胞疗法中。

40.艾曲波帕，用于根据条款1-26中的任一项所述的T细胞或NK细胞的体外或体内扩增。

41.组合物，包含根据条款1-26所述的T细胞或NK细胞，与血小板生成素或血小板生成素受体激动剂联合用于癌症的治疗中。

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序列

在以下氨基酸序列中，粗体表示TpoR衍生的序列。

在以下核苷酸序列中，利用标准IUPAC密码表示简并碱基：

**表示终止密码子

跨膜结构域加有下划线(在SEQ ID No 1至15中)

SEQ ID N^o 1:野生型TpoR。

635个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域。

SEQ ID N^o 15:野生型TpoR

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytn wsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccntrrtrr

SEQ ID N^o 2:TpoR.Δ60

580个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-580个氨基酸(粗体，斜体)：C-末端截短的TpoR胞质结构域。

SEQ ID N^o 16:TpoR.Δ60

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytntrrtrr

SEQ ID N^o 3:TpoR.TpoR-cyt.IL2rβ-cyt

626个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-538个氨基酸(粗体，斜体)：C-末端截短的TpoR胞质结构域、第539-626个氨基酸(无格式)：IL2rβ胞质结构域。

SEQ ID N^o 17:TpoR.TpoR-cyt.IL2rβ-cyt

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnccnmgngaytgggayccncarccnytnggnccnccnacnccnggngtnccngayytngtngayttycarccnccnccngarytngtnytnmgngargcnggngargargtnccngaygcnggnccnmgngarggngtnwsnttyccntggwsnmgnccnccnggncarggngarttymgngcnytnaaygcnmgnytnccnytnaayacngaygcntayytnwsnytncargarytncarggncargayccnacncayytngtntrrtrr

SEQ ID N^o 4:TpoR.IL2rB-cyt.TpoR-cyt

808个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-709个氨基酸(无格式)：IL2rB胞质结构域、第710-808个氨基酸(粗体，斜体)：N-末端截短的TpoR胞质结构域。

SEQ ID N^o 18:TpoR.IL2rB-cyt.TpoR-cyt

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnaaytgymgnaayacnggnccntggytnaaraargtnytnaartgyaayacnccngayccnwsnaarttyttywsncarytnwsnwsngarcayggnggngaygtncaraartggytnwsnwsnccnttyccnwsnwsnwsnttywsnccnggnggnytngcnccngarathwsnccnytngargtnytngarmgngayaargtnacncarytnytnytncarcargayaargtnccngarccngcnwsnytnwsnwsnaaycaywsnytnacnwsntgyttyacnaaycarggntayttyttyttycayytnccngaygcnytngarathgargcntgycargtntayttyacntaygayccntaywsngargargayccngaygarggngtngcnggngcnccnacnggnwsnwsnccncarccnytncarccnytnwsnggngargaygaygcntaytgyacnttyccnwsnmgngaygayytnytnytnttywsnccnwsnytnytnggnggnccnwsnccnccnwsnacngcnccnggnggnwsnggngcnggngargarmgnatgccnccnwsnytncargarmgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccntrrtrr

SEQ ID N^o 5:TpoR.SLAM

710个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域、第636-710个氨基酸(无格式)：SLAM胞质结构域。

SEQ ID N^o 19:TpoR.SLAM

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccnmgnmgnmgnggnaaracnaaycaytaycaracnacngtngaraaraarwsnytnacnathtaygcncargtncaraarccnggnccnytncaraaraarytngaywsnttyccngcncargayccntgyacnacnathtaygtngcngcnacngarccngtnccngarwsngtncargaracnaaywsnathacngtntaygcnwsngtnacnytnccngarwsntrrtrr

SEQ ID N^o 6:TpoR.IL2rγ

721个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域、第636-721个氨基酸(无格式)：IL2rγ胞质结构域。

SEQ ID N^o 20:TpoR.IL2rγ

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccngarmgnacnatgccnmgnathccnacnytnaaraayytngargayytngtnacngartaycayggnaayttywsngcntggwsnggngtnwsnaarggnytngcngarwsnytncarccngaytaywsngarmgnytntgyytngtnwsngarathccnccnaarggnggngcnytnggngarggnccnggngcnwsnccntgyaaycarcaywsnccntaytgggcnccnccntgytayacnytnaarccngaracntrrtrr

SEQ ID N^o 7:TpoR-TLR1

817个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域、第636-817个氨基酸(无格式)：TLR1胞质结构域。

SEQ ID N^o 21:TpoR-TLR1

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccngayytnccntggtayytnmgnatggtntgycartggacncaracnmgnmgnmgngcnmgnaayathccnytngargarytncarmgnaayytncarttycaygcnttyathwsntaywsnggncaygaywsnttytgggtnaaraaygarytnytnccnaayytngaraargarggnatgcarathtgyytncaygarmgnaayttygtnccnggnaarwsnathgtngaraayathathacntgyathgaraarwsntayaarwsnathttygtnytnwsnccnaayttygtncarwsngartggtgycaytaygarytntayttygcncaycayaayytnttycaygarggnwsnaaywsnytnathytnathytnytngarccnathccncartaywsnathccnwsnwsntaycayaarytnaarwsnytnatggcnmgnmgnacntayytngartggccnaargaraarwsnaarmgnggnytnttytgggcnaayytnmgngcngcnathaayathaarytnacngarcargcnaaraartrrtrr

SEQ ID N^o 8:TpoR-TIAF1

750个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域、第636-750个氨基酸(无格式)：TIAF1胞质结构域。

SEQ ID N^o 22:TpoR-TIAF1

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccnatgwsnwsnccnwsnwsnccnttymgngarcarwsnttyytntgygcngcnggngaygcnggngargarwsnmgngtncargtnytnaaraaygargtnmgnmgnggnwsnccngtnytnytnggntgggtngarcargcntaygcngayaartgygtntgyggnccnwsngcnccnccngcnccnacnccnccnwsnytnwsncarmgngtnatgtgyaaygayytnttyaargtnaayccnttycarytncarcarttymgngcngayccnwsnacngcnwsnytnytnytntgyccnggnggnytngaycayaarytnaayytnmgnggnaargcntggggntrrtrr

SEQ ID N^o 9:TpoR-CD40

697个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域、第636-697个氨基酸(无格式)：CD40胞质结构域。

SEQ ID N^o 23:TpoR-CD40

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccnaaraargtngcnaaraarccnacnaayaargcnccncayccnaarcargarccncargarathaayttyccngaygayytnccnggnwsnaayacngcngcnccngtncargaracnytncayggntgycarccngtnacncargargayggnaargarwsnmgnathwsngtncargarmgncartrrtrr

SEQ ID N^o 10:TpoR-ITAM1

676个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域、第636-676个氨基酸(无格式)：ITAM1胞质结构域。

SEQ ID N^o 24:TpoR-ITAM1

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccnmgngtnaarttywsnmgnwsngcngaygcnccngcntaycarcarggncaraaycarytntayaaygarytnaayytnggnmgnmgngargartaygaygtnytngayaarmgnmgnggnmgntrrtrr

SEQ ID N^o 11:TpoR.TpoR-cyt.LMP1-cyt

836个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-635个氨基酸(粗体，斜体)：TpoR胞质结构域、第636-836个氨基酸(无格式)：LMP-1胞质结构域。

SEQ ID N^o 25:TpoR.TpoR-cyt.LMP1-cyt

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgntggcarttyccngcncaytaymgnmgnytnmgncaygcnytntggccnwsnytnccngayytncaymgngtnytnggncartayytnmgngayacngcngcnytnwsnccnccnaargcnacngtnwsngayacntgygargargtngarccnwsnytnytngarathytnccnaarwsnwsngarmgnacnccnytnccnytntgywsnwsncargcncaratggaytaymgnmgnytncarccnwsntgyytnggnacnatgccnytnwsngtntgyccnccnatggcngarwsnggnwsntgytgyacnacncayathgcnaaycaywsntayytnccnytnwsntaytggcarcarccntaycayggncarmgncaywsngaygarcaycaycaygaygaywsnytnccncayccncarcargcnacngaygaywsnggncaygarwsngaywsnaaywsnaaygarggnmgncaycayytnytngtnwsnggngcnggngayggnccnccnytntgywsncaraayytnggngcnccnggnggnggnccngayaayggnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncaygayccnytnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncaygayccnytnccncaywsnccnwsngaywsngcnggnaaygayggnggnccnccncarytnacngargargtngaraayaarggnggngaycarggnccnccnytnatgacngayggnggnggnggncaywsncaygaywsnggncayggnggnggngayccncayytnccnacnytnytnytnggnwsnwsnggnwsnggnggngaygaygaygayccncayggnccngtncarytnwsntaytaygaytrrtrr

SEQ ID N^o 12:TpoR.LMP1-cyt

714个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-714个氨基酸(无格式)：LMP-1胞质结构域。

SEQ ID N^o 26:TpoR.LMP1-cyt

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytntaycayggncarmgncaywsngaygarcaycaycaygaygaywsnytnccncayccncarcargcnacngaygaywsnggncaygarwsngaywsnaaywsnaaygarggnmgncaycayytnytngtnwsnggngcnggn

gayggnccnccnytntgywsncaraayytnggngcnccnggnggnggnccngayaayggnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncaygayccnytnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncargayccngayaayacngaygayaayggnccncaygayccnytnccncaywsnccnwsngaywsngcnggnaaygayggnggnccnccncarytnacngargargtngaraayaarggnggngaycarggnccnccnytnatgacngayggnggnggnggncaywsncaygaywsnggncayggnggnggngayccncayytnccnacnytnytnytnggnwsnwsnggnwsnggnggngaygaygaygayccncayggnccngtncarytnwsntaytaygaytrrtrr

SEQ ID N^o 13:TpoRec.TpoRtm.CD137cyto

555个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-555个氨基酸(无格式)：CD137胞质结构域。

SEQ ID N^o 27:TpoRec.TpoRtm.CD137cyto

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnaarmgnggnmgnaaraarytnytntayathttyaarcarccnttyatgmgnccngtncaracnacncargargargayggntgywsntgymgnttyccngargargargarggnggntgygarytntrrtrr

SEQ ID N^o 14:TpoRec.TpoRtm.CD28cyto

554个氨基酸以N-末端至C-末端方向显示，其中第1-491个氨基酸(粗体)：TpoR细胞外结构域、第492-513个氨基酸(粗体，加下划线)：TpoR TM结构域、第514-554个氨基酸(无格式)：CD28胞质结构域。

SEQ ID N^o 28:TpoRec.TpoRtm.CD28cyto

atgccnwsntgggcnytnttyatggtnacnwsntgyytnytnytngcnccncaraayytngcncargtnwsnwsncargaygtnwsnytnytngcnwsngaywsngarccnytnaartgyttywsnmgnacnttygargayytnacntgyttytgggaygargargargcngcnccnwsnggnacntaycarytnytntaygcntayccnmgngaraarccnmgngcntgyccnytnwsnwsncarwsnatgccncayttyggnacnmgntaygtntgycarttyccngaycargargargtnmgnytnttyttyccnytncayytntgggtnaaraaygtnttyytnaaycaracnmgnacncarmgngtnytnttygtngaywsngtnggnytnccngcnccnccnwsnathathaargcnatgggnggnwsncarccnggngarytncarathwsntgggargarccngcnccngarathwsngayttyytnmgntaygarytnmgntayggnccnmgngayccnaaraaywsnacnggnccnacngtnathcarytnathgcnacngaracntgytgyccngcnytncarmgnccncaywsngcnwsngcnytngaycarwsnccntgygcncarccnacnatgccntggcargayggnccnaarcaracnwsnccnwsnmgngargcnwsngcnytnacngcngarggnggnwsntgyytnathwsnggnytncarccnggnaaywsntaytggytncarytnmgnwsngarccngayggnathwsnytnggnggnwsntggggnwsntggwsnytnccngtnacngtngayytnccnggngaygcngtngcnytnggnytncartgyttyacnytngayytnaaraaygtnacntgycartggcarcarcargaycaygcnwsnwsncarggnttyttytaycaywsnmgngcnmgntgytgyccnmgngaymgntayccnathtgggaraaytgygargargargaraaracnaayccnggnytncaracnccncarttywsnmgntgycayttyaarwsnmgnaaygaywsnathathcayathytngtngargtnacnacngcnccnggnacngtncaywsntayytnggnwsnccnttytggathcaycargcngtnmgnytnccnacnccnaayytncaytggmgngarathwsnwsnggncayytngarytngartggcarcayccnwsnwsntgggcngcncargaracntgytaycarytnmgntayacnggngarggncaycargaytggaargtnytngarccnccnytnggngcnmgnggnggnacnytngarytnmgnccnmgnwsnmgntaymgnytncarytnmgngcnmgnytnaayggnccnacntaycarggnccntggwsnwsntggwsngayccnacnmgngtngaracngcnacngaracngcntggathwsnytngtnacngcnytncayytngtnytnggnytnwsngcngtnytnggnytnytnytnytnmgnwsnaarmgnwsnmgnytnytncaywsngaytayatgaayatgacnccnmgnmgnccnggnccnacnmgnaarcaytaycarccntaygcnccnccnmgngayttygcngcntaymgnwsntrrtrr