用于模拟人系统生物学和关于药剂对心脏的肌力作用进行筛选的生物反应器筛选平台
阅读说明：本技术 用于模拟人系统生物学和关于药剂对心脏的肌力作用进行筛选的生物反应器筛选平台 (Bioreactor screening platform for modeling human system biology and screening for agents acting on muscle force of heart ) 是由 D·D·特兰 K·D·科斯塔 李登伟 于 2018-11-29 设计创作，主要内容包括：公开了针对肌力作用快速筛选化合物的两级或两层系统和方法。该系统包含在第一层中的工程化心脏组织条(CTS),该CTS包含包埋于生物相容性凝胶中的心肌细胞,例如人心室心肌细胞,其中凝胶包含至少两个生物相容性结构支撑物,例如用于升高凝胶的聚二甲基硅氧烷柱。该系统还包含在第二层中的设备,该设备包含至少一个类器官模块,其包含至少一个类器官盒和镜布置,其中每个类器官盒包含类器官。该系统还包含至少一个检测装置,例如高速照相机,用于检测该系统第一层中CTS凝胶的挠曲和/或用于检测该系统第二层的一个或多个类器官盒中组织或类器官的行为。该方法包含将化合物施加至心脏组织条并检测凝胶响应于该化合物的施加而发生的任何挠曲,以检测表现出可能的肌力作用的化合物,并将该化合物引入类器官模块,其中该类器官模块中心脏组织或类器官的收缩性改变鉴定出具有肌力作用的化合物。还提供了一种制造心脏组织条的方法。第二层系统也可用于离体制造和监测、表征、操纵或测试一种或多种类器官(例如人的类器官)的方法中。该系统、方法、设备和组合物可用于多种情况,包括评估潜在治疗剂的功效和/或毒性。(A two-stage or two-layer system and method for rapid screening of compounds for muscle strength effects is disclosed. The system comprises an engineered Cardiac Tissue Strip (CTS) in a first layer, the CTS comprising cardiomyocytes, such as human ventricular cardiomyocytes, embedded in a biocompatible gel, wherein the gel comprises at least two biocompatible structural supports, such as polydimethylsiloxane columns for elevating the gel. The system also includes a device in the second layer, the device comprising at least one organoid module comprising at least one organoid cassette and a mirror arrangement, wherein each organoid cassette comprises an organoid. The system also includes at least one detection device, such as a high speed camera, for detecting the flexing of the CTS gel in the first layer of the system and/or for detecting the behavior of tissue or organoids in one or more organoid cassettes in the second layer of the system. The method comprises applying a compound to a strip of cardiac tissue and detecting any deflection of the gel in response to the application of the compound to detect the compound exhibiting a possible inotropic effect, and introducing the compound into an organoid module, wherein a change in contractility of the cardiac tissue or organoid in the organoid module identifies the compound having the inotropic effect. A method of manufacturing a strip of cardiac tissue is also provided. The second layer system may also be used in methods of manufacturing and monitoring, characterizing, manipulating or testing one or more organoids ex vivo (e.g., human organoids). The systems, methods, devices, and compositions can be used in a variety of contexts, including assessing the efficacy and/or toxicity of potential therapeutic agents.)
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月29日提交的临时美国专利申请第62/592,083号和2018年1月12日提交的临时美国专利申请第62/616,812号的优先权，各案通过引用并入本文中。
技术领域
本公开大体上涉及医疗健康和心脏生理学领域，更具体地说，涉及医疗装置领域，该医疗装置提供了监测人体组织工程化类器官的功能的通用生物反应器平台，以及涉及医学治疗领域，该医学治疗提供了生物活性化合物，例如对心脏具有肌力作用的化合物或药剂的方法和筛选。
背景技术
用于心脏病的新药和治疗剂的传统发现和开发一直是一个低效且昂贵的过程。由于缺乏合适的人体模型，心脏毒性成为了导致停药的常见主要原因，甚至是对于非心血管(例如癌症)药物来说也是如此。尽管可以使用啮齿动物、狗和猪之类传统动物模型，但在解剖学和功能上都存在较多的物种差异。已经提出了人多能干细胞(hPSC)来填补这一空白，但是常规的二维培养和用单细胞或无序簇进行的实验不能充分地重现人心脏的表型。因此，以前基于hPSC的药物筛选模型关注的是单细胞活力和电生理作用等模式，使其成为用于心脏毒性筛选的有用工具。较新的二维模型也主要是关注电生理学和致心律失常作用，以此评估心脏毒性。迄今为止，仅开发出几种基于hPSC的药物筛选系统来研究药物对心脏收缩性的影响，但是已经开发出收缩性的替代指标，用于在单细胞水平上量化收缩力。这些基于hPSC的药物筛选系统包括包埋有应变计的2D肌肉薄膜、心脏微组织、心脏微线(microwire)或生物线(biowire)、微型心肌(μHM)和产生力的工程化心脏组织(EHT)，尽管其生理功能不如天然听觉组织，但这是迄今为止开发的所有工程化组织系统所共有的局限。
开发并获批销售可用于治疗人或其他动物的疾病或病症的治疗剂的过程是一个漫长、昂贵且不确定的过程。尽管在将新的治疗剂引入临床或兽医环境治疗患病个体方面存在一定延误，但公众认识到确保新的治疗剂有效且不良副作用最小的重要性。目前，临床前药物测试依靠实验动物来确定新药物的安全性和有效性。动物药物测试是人类患者安全服用药物的缓慢、昂贵且不可靠的指标。在认识到不良作用是在用于治疗疾病和病症的候选治疗剂的临床试验中导致药物失败的主要原因时，这是显而易见的。因此，迫切需要开发用于临床前药物测试的补充方法，用以评估实验治疗剂的安全性和有效性。
人多能干细胞(hPSC)技术为体外治疗剂筛选平台提供了令人振奋的新机会。这些细胞相对于动物模型具有许多优势，包括人体来源、培养的适应性以及针对遗传性病症(例如长QT综合征)产生患者特异性细胞系的能力。来源于hPSC的分化细胞(例如心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、***、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛或皮肤)已与组织工程化方法一起使用，以重现天然组织的三维环境的各个方面，以便更好地模拟人体功能。采用这些新的预测性平台进行治疗剂筛选的主要瓶颈是缺乏能够培养和监测此类组织模型的功能的工具。
为了进一步增强体外治疗剂筛选的预测能力，需要支持模块化系统生物学方法预测多器官或完整“身体”反应的工具。当前体外筛选平台的一个缺点是它们通常评估单个器官的反应。相比之下，身体是由多个器官组成的复杂而动态的系统，具有复杂的相互作用。例如，某些药物作为代谢产物衍生物更具活性(例如阿霉素与阿霉素醇相比)，而简单的筛选平台可能无法正确复制临床药理学途径。一些研究已开始连接不同的器官测试平台(例如器官芯片)，但仅在微观水平上(例如微流体装置)进行了连接，不适用于大型组织工程化类器官的系统生物学方法。
因此，仍然迫切需要开发新的治疗剂测试平台，该平台能够较好地预测候选治疗剂对体外组织工程化类器官的作用，并且需要开发新工具以允许“器官”与“器官”相互作用来分析整体功能反应(即全身反应)。此外，还需要准确且有效地筛选对使用体外组织工程化类器官或组织有效模拟的器官具有所需作用的化合物或药剂。
尽管已花费很多努力来推进心脏护理，但是在本领域中仍然需要更快速且更可靠地鉴定具有肌力作用的心脏药物。正性肌力剂是增强心脏收缩力的药剂，通常被规定用于患有充血性心力衰竭或心肌病的患者，或在某些情况下用于近期有过心脏病发作的患者。负性肌力剂减弱心脏收缩，用于治疗高血压和心绞痛。这些肌力作用在应用于适当病况时可能是有效的，但对其他患者也可能具有毒性。因此，对于任何心脏功效/毒性筛查，灵敏地检测到这些作用的能力是非常宝贵的。
发明内容
本公开提供了一种三层系统和相关方法，以促进在第一层筛选中使用工程化的人心室心脏组织条(hvCTS)进行药物发现/筛选，其可用于快速测定具有肌力作用的化合物并适合于大通量筛选格式。使用本文所公开的人心室心脏类器官室(hvCOC)，通常将该第一层筛选与化合物的第二层筛选组合。对具有肌力作用的化合物的两层筛选允许分级关注感兴趣的化合物，同时获得使用hvCTS在第一层筛选中获得的有关化合物对细胞(例如心肌细胞，例如人心室心肌细胞)作用的数据，并将该数据与化合物对相关类器官(例如心脏类器官)的高级生物结构的作用相结合，以确认第一层筛选的结果并揭示从第一层筛选中使用的细胞不明显的任何类器官或器官水平的作用。该方法不仅允许迅速、渐进地关注具有肌力作用的化合物，而且还评估了化合物在两种不同但相关的环境(即基于细胞的环境和基于类器官或器官的环境)中的作用。使用这种方法，结果在比使用任何单级筛选(例如当前使用的化合物筛选系统和方法)获得的结果更准确，更可重复的方面更可靠。本公开进一步提供了第三层筛选与第一层和第二层筛选最佳组合的可能性。在第三层筛选中，使用多类器官hvCOC系统将hvCOC类器官筛选扩展为多个类器官。第三层筛选产生的数据甚至比从两层筛选获得的数据更加可靠。此外，多类器官hvCOC格式允许在筛选中使用相同类型的多个类器官，例如心脏类器官，和/或在第三层筛选中同时使用不同的类器官，使用本文公开的通用多类器官hvCOC系统。(如本文所用，“类器官”通常是指器官样生物材料，但该术语也可以指可以被视为器官样生物材料的组织。本文所用术语的含义将从其使用的上下文中显而易见。)该技术在适用于鉴定具有正性肌力作用的化合物和具有负性肌力作用的化合物方面是通用的。在一些实施例中，人心室心脏组织包含hPSC源性心室心肌细胞(VCM)。这种细胞的单细胞特性，例如电生理学(动作电位、Ca2+处理)、转录组、蛋白质组等已得到广泛表征。如本文所公开的，各种细胞，例如人心室心肌细胞，可以用于开发用于第二层hvCOC系统的类器官和用于开发用于第三层多类器官hvCOC系统的类器官。
在本公开的多层系统和方法的第二层和第三层中使用的hvCOC系统是第一平台，其同时表征多个体外组织工程化的组织或类器官，包括镜布置以及单个检测装置。配备了流体交换网络，类器官在此平台上相互连接，以建立一个“迷你人体”系统，该系统模拟人类患者的全身药物反应，可用于替代动物试验作为默认的体内模型。半自动化平台包括多个特征，以帮助调查对已递送药物的功能响应，例如环境控制(例如温度和C02)、高速照相机、同步的压力-体积记录、互连的流体交换系统、药物灌注、类器官内压力控制、机械刺激和电刺激。这些特征被设计成改善培养操作，允许检查组织或类器官的长期药物暴露，并允许同时进行多组织和/或多器官药物反应。当前的体外治疗剂筛选通常仅评估单个组织或类器官的急性反应，这使挑战性扩大且成本高昂。通过使用带有镜布置的单个照相机进行多类器官成像，此系统比当前可用的设计更具可扩展性。
为了开发下一代体外人体模型，生物反应器平台包括模块化的类器官盒系统和流体交换网络，可实现灵活的系统生物学方法。“即插即用型”类器官盒加快对生物反应器内感兴趣的各种组织和/或类器官组合成像的过程。另外，组织或类器官之间的培养基循环和交换可以重现人的循环系统。信号传导因子和代谢产物可以在组织或类器官之间自由交换，并且可以影响一种或多种组织或类器官的药物反应。例如，已知代谢产物阿霉素醇比化学治疗剂阿霉素本身具有更强的心脏毒性。这种“罐中身体(body-in-a-jar)”技术促进药物发现和精确度或个性化的医学研究，并且优于由于缺乏三维组织而常常无法完全重现器官功能的器官芯片技术。
使用临床相关的终点(例如心脏组织中的射血分数、肺组织中的通透性)对新的分子实体进行表征，然后使用经过训练以检测生物活性和毒性模式的自动计算机算法(例如机器学***台增加了通量，并且可用于更高含量的筛选。通过提高通量，该系统变得更易于临床前药物筛选。该平台还用于探测组织工程化人类构建体中的基本生物学。
除了一层hvCTS系统和方法之外，本公开提供了用于开发工程化类器官组织的通用生物反应器平台，其更紧密地模拟相应人体器官的体内结构和功能。生物反应器平台允许控制各种环境变量，并允许使用各种探针和监测器来实时或终点监测组织或类器官功能。另外，本公开提供了改进的环境控制，以实现温度控制和各种气体例如C02和氧气的控制。良好控制的环境允许稳定培养细胞，因此可以长期采集用于药物筛选。利用高速照相机和压力传感器的组合，本公开提供了一种将移位组织或类器官(例如收缩心脏类器官)的时空运动与压力记录相结合以测量压力-体积关系的方法。另外，与使用简单的静水压力系统的一些系统相反，本公开提供了一种用于通过协同使用流体泵、三通阀和流体箱在生物反应器平台内进行流体交换的复杂系统。流体交换系统还提供了生物反应器内任意数量的类器官的连接。本公开的流体交换系统提供了控制培养基递送的附加功能，用于进料、抽吸培养基、混合生物活性组分(即，治疗剂)以及按急性时间表(例如，推注)或慢性时间表(例如，灌注)注射生物活性剂。生物活性组分可包括但不限于药物化合物、病毒载体、条件培养基、祖细胞和细胞外囊泡。流体交换系统还提供了对流体管线的清洁、漂洗或冲洗。另外，本公开通过将用于机械拉伸的方法应用于具有腔室的组织或类器官来提供对发育中的组织或类器官的机械刺激。通过施加机械拉伸，本公开提供了一种用于操纵组织或类器官的手段，只要机械拉伸可以充当机械转导信号即可。与经由场刺激对人心脏类器官的电起搏相反，本公开提供了对此类类器官的点刺激，从而导致对类器官组织的更精确和细化的刺激。利用点刺激，可以例如通过使用光学标测技术来完成组织或类器官(例如，脑、心脏)内的电导率测量。此外，根据本公开，机器学习原理在组织或类器官行为分析中的应用有望通过全面分析和理解高维参数空间来改善对治疗反应结果的评估。本公开以集成包装提供所有益处，这代表了治疗剂筛选领域的重大进步，包括新方法，即预期将改进预防、治疗和/或改善各种疾病和病况的症状的实验测定。
一方面，本公开提供了一种针对肌收缩力变化筛选化合物的系统，其包含：(a)第一级筛选设备，包含：(i)包含多个心肌细胞的生物相容性凝胶；(ii)用于悬浮生物相容性凝胶的生物相容性支撑设备，其中生物相容性凝胶和生物相容性支撑设备形成心脏组织条；(iii)用于检测生物相容性凝胶的运动的检测装置；以及(iv)用于对生物相容性凝胶施加电起搏刺激的电源；和(b)第二级筛选设备，包含：(v)至少一个类器官模块，其包含至少一个类器官盒，其中类器官盒包含培养基入口、培养基出口和至少一个与外部检测装置相容的壁，其中每个类器官盒包含生物材料，该生物材料包含至少一种人体细胞，该人体细胞是人胚胎干细胞、人成体干细胞、人诱导性多能干细胞、源自人体组织的细胞或人体组织的祖细胞，其中至少一个类器官盒包含心脏生物材料；(vi)用于同时监测每个类器官盒中生物材料的任何生物发育的镜布置；以及(vii)用于观察每个类器官盒中生物材料的监测的生物发育的检测装置。在一些实施例中，心肌细胞是人心肌细胞，例如人心室心肌细胞。在一些实施例中，人心肌细胞来源于至少一种人多能干细胞。在一些实施例中，心肌细胞以至少106个细胞/毫升的浓度存在。在一些实施例中，生物相容性凝胶包含基质胶，例如其中基质胶以至少0.5mg/ml或1mg/ml的浓度存在的生物相容性凝胶。基质胶可以从含有例如至少5mg/ml或至少10mg/ml基质胶的储备溶液中获得。在一些实施例中，生物相容性凝胶还包含胶原蛋白。本公开还提供了其中胶原蛋白是I型人胶原蛋白的实施例。一些实施例包含生物相容性凝胶，其中胶原蛋白以至少1mg/ml的浓度，例如约2mg/ml的浓度存在。在一些实施例中，相同的生物相容性凝胶组合物用于在第一级筛选中形成心脏组织条和在第二级筛选中形成心脏类器官。在一些实施例中，支撑设备是至少两个竖直支撑构件(例如其中存在两个竖直支撑构件的实施例)，并且那些竖直支撑构件可以由聚二甲基硅氧烷制成。在一些实施例中，竖直支撑构件(例如两个竖直支撑构件)的横截面是近似圆形的，直径为约0.5mm。在一些实施例中，心脏组织条是约26.5mm长度×约16mm宽度×约6mm高度，例如26.5mm长度×16mm宽度×6mm高度的心脏组织条。在一些实施例中，检测装置是高速照相机。
在该系统的一些实施例中，第二级筛选设备的镜布置包含至少一个角锥镜。本公开还设想了其中生物材料是至少一种心脏组织或至少一种心脏类器官的实施例。在一些实施例中，心脏类器官与其他类器官在相同的系统中培养。因此，一些实施例还包含另一种类器官，其是心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、***、子宫、肿瘤、眼睛、皮肤、血液或血管类器官，例如其中另一种类器官是心脏类器官。在一些实施例中，第二级筛选设备还包含与至少一个类器官盒中的组织或类器官具有可调关系的电极。在一些实施例中，第二级筛选设备还包含温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合。在一些实施例中，该系统还包含与检测装置、温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合电子通信的数据处理器。还理解了其中检测装置是数字照相机、至少一个压力传感器或数字照相机和至少一个压力传感器的组合的实施例。在一些实施例中，该系统还包含具有至少一种人体细胞的组织。在一些实施例中，该系统还包含监测器。该系统的实施例还包含多个类器官模块。在一些实施例中，该系统还包含互连的流体交换网络，其中该网络包含多个流体管线、多个阀、至少一个泵和至少一个流体箱。还考虑了其中该系统还包含用于引入化合物的端口的实施例。在一些实施例中，互连的流体交换网络包含至少两个类器官盒之间的流体连通。在一些实施例中，流体是培养基。在一些实施例中，流体交换网络提供自动化培养基交换。该系统的一些实施例还包含气压控制器。在一些实施例中，气压控制器控制至少一个模块中或一个或多个类器官盒中的02和C02中的至少一种的浓度。在一些实施例中，该系统还包含用于将化合物递送至细胞、组织或类器官的药物灌注设备。
本公开的另一方面涉及一种制造心脏组织条的方法，其包含：(a)提供约26.5mm长度×约16mm宽度×约6mm高度的生物相容性模具；(b)形成与模具相符合的生物相容性凝胶，其中该生物相容性凝胶包含基质胶、胶原蛋白和多个心肌细胞；以及(c)将至少两个竖直支撑构件固定到生物相容性凝胶，从而形成心脏组织条。在该方法的一些实施例中，竖直支撑构件是通过在凝胶化之前，将竖直支撑构件包埋于生物相容性凝胶制剂中而固定到生物相容性凝胶。在一些实施例中，竖直支撑构件是通过粘附或通过机械附接而固定到生物相容性凝胶。
本公开的另一方面涉及一种筛选具有肌力作用的化合物的方法，其包含：(a)以特定浓度(或等效体积的媒剂)将测试化合物施用于心脏组织条；(b)在没有电起搏的情况下测量心脏组织条的自发收缩；(c)用电刺激以0.5Hz、1.0Hz、1.5Hz或2.0Hz的起搏频率对本文公开的心脏组织条起搏，并测量心脏组织条的收缩；(d)以增加的测试化合物的浓度重复上述步骤；(e)在不进行处理的情况下，消除从收缩力低(例如0.01mN)的心脏组织条获得的数据；(f)绘制剂量-反应曲线(收缩力对剂量)，并比较化合物和媒剂处理的剂量-反应曲线，以确定是否存在肌力活性(通过将测试化合物的真实药理作用与媒剂处理的假象作用区分开)；以及(g)在本文公开的第二级筛选设备中向组织或类器官施用潜在的肌力化合物，并监测心脏组织或类器官对化合物的反应，其中收缩性(例如，在心脏类器官中的发展压、心搏量和搏出功)的改变将潜在的肌力化合物鉴定为肌力化合物。本公开还提供了一种筛选具有肌力作用的化合物的方法，其包含：(a)在存在或不存在候选肌力化合物的情况下，用电刺激以0.5Hz、1.0Hz、1.5Hz或2.0Hz的起搏频率对根据权利要求1所述的心脏组织条进行起搏；(b)在存在或不存在候选肌力化合物的情况下，检测起搏的心脏组织条的任何运动；(c)将在存在候选肌力化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动与在不存在候选肌力化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动相比较；(d)当在存在化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动与在不存在化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动不同时，确定候选肌力化合物是潜在的肌力化合物；以及(e)将潜在的肌力化合物施用于本文公开的第二级筛选设备中的组织或类器官，并监测组织或类肌力对化合物的反应，其中收缩性的改变将潜在的肌力化合物鉴定为肌力化合物。
以下公开的实施例描述了上述每种筛选方法的实施例。在一些实施例中，起搏频率是1.0Hz。在一些实施例中，当在存在肌力化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动比在不存在肌力化合物的情况下的运动要少时，将肌力化合物鉴定为潜在的负性肌力化合物。在一些实施例中，当(a)在存在肌力化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动比在不存在肌力化合物的情况下的运动要少；和(b)与不存在肌力化合物的情况相比，在存在肌力化合物的情况下，第二级筛选设备中的组织或类器官表现出收缩性降低时，将肌力化合物鉴定为负性肌力化合物。在一些实施例中，当在存在肌力化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动比在不存在肌力化合物的情况下的运动要大时，将肌力化合物鉴定为潜在的正性肌力化合物。在一些实施例中，当(a)在存在肌力化合物的情况下起搏的心脏组织条的运动比在不存在肌力化合物的情况下的运动要多；和(b)与不存在肌力化合物的情况相比，在存在肌力化合物的情况下，第二级筛选设备中的组织或类器官表现出收缩性增加时，将肌力化合物鉴定为正性肌力化合物。在本公开的这一方面的一些实施例中，化合物是药物、病毒载体、条件培养基、细胞外囊泡、其他细胞或其任何组合。在一些实施例中，心脏组织或类器官被连接到其他类器官，例如肝脏(即与其流体连通)，以检测对测试化合物的系统级反应。
在其他方面，本公开提供了一种涉及本文所述的多层系统和方法的第二层或第三层的hvCOC的系统和方法。这些方面中的一个涉及组织监测系统，其包含(a)至少一个类器官模块，其包含多个类器官盒，其中每个类器官盒包含流体(例如培养基)入口、流体(例如培养基)出口以及至少一个与外部检测装置相容的壁，其中多个类器官盒各自包含生物材料，该生物材料包含至少一种人体细胞，其中该细胞是人胚胎干细胞、人成体干细胞、人诱导性多能干细胞、源自人体组织的细胞或人体组织的祖细胞；(b)用于同时监测至少两个类器官盒中的每一个中的生物材料的任何生物发育的镜布置；以及(c)用于观察至少两个类器官盒中的每一个中所监测的生物材料的生物发育的检测装置。与外部检测装置相容的壁是在类器官盒的***的大致平坦、大致竖直的物理屏障，有效防止流体(例如培养基)由于从类器官盒泄漏而损失，同时有效地允许外部检测装置(例如数字照相机)可检测到的任何波长的电磁辐射通过。与外部检测装置相容的示例性壁是玻璃或任何有效透明的热固性或热塑性塑料。生物材料是任何细胞或一组相似或不同的细胞、组织、类器官、器官系统，并且通常是人体来源的。生物材料的生物发育是指生物材料相对于其在先前时间点的状态的细胞或多细胞结构数量或大小的任何增长、结构(例如大小、形状、颜色、拓扑)或功能/行为(例如节律性或心律失常性收缩)的分化或变化。本文公开的组织监测系统提供了一种包含例如在组织或器官中发现的更高阶的多个生物细胞的系统。因此，组织监测系统包括用于监测组织、类器官或器官的系统。在一些实施例中，该系统包含组织工程化的类器官，例如三维组织工程化的类器官，或组织，例如离体组织。类器官包含器官的细胞和组织特征，使得类器官表现出相应器官的至少一种生物学功能。镜布置可以是一个或多个镜的任何布置，其使用比类器官盒少的检测装置提供用于多个类器官盒中的一个或多个细胞、组织、类器官或器官形式的生物材料的监测，以改进监测效率和降低监测成本。在此段落中描述的用于组织监测的系统也可以用作本文中描述为可用于针对肌力活性筛选化合物的多层系统的第二层和第三层的hvCOC系统。
在一些实施例中，镜布置包含至少一个角锥镜。在一些实施例中，生物材料是至少一种组织或至少一种类器官，例如其中类器官是心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、***、子宫、肿瘤、眼睛、皮肤、血液或血管类器官的实施例。在一些实施例中，类器官是心脏类器官。在一些实施例中，该系统还包含与至少一个类器官盒中的细胞、组织或类器官具有可调关系的电极，例如用于点刺激(例如点电刺激)和/或点监测组织或类器官的至少一个细胞的行为。在一些实施例中，检测装置是记录装置，例如照相机。在一些实施例中，记录装置是数字照相机、至少一个压力传感器或数字照相机和至少一个压力传感器的组合。在其中记录装置是至少一个压力传感器的典型实施例中，压力传感器与类器官盒之间存在1:1的对应关系，即，每个包含被监测的细胞、组织或类器官的类器官盒一个压力传感器。在一些实施例中，该系统还包含温度控制元件(例如加热器)、光源(例如LED灯或灯)、模块接入端口或其任何组合。在一些实施例中，该系统还包含与检测装置、温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合电子通信的数据处理器。电子处理器提供对系统和装置的元件的基于软件和/或硬件的控制以控制环境，例如通过控制互连的流体交换网络中的泵和阀来控制流体(例如培养基)流量，和/或控制加热器、灯、检测装置(例如照相机)，以及处理结果以生成可用于操作员分析的表格(图16)。
本文公开的hvCOC系统还可以包含具有至少一种人体细胞的组织。在一些实施例中，该系统还包含监测器。在一些实施例中，该系统包含多个类器官模块。在一些实施例中，该系统还包含培养基混合器，例如磁力搅拌设备或转盘。
在一些实施例中，本文公开的hvCOC系统还包含互连的流体交换网络，其中该网络包含多个流体管线、多个阀、至少一个泵和至少一个流体箱。互连的流体交换网络包括如本文所公开的流体管线、阀、泵、箱和/或类器官盒的任何组合，其能够共同地使流体移动通过一条以上的路径，并且优选地在多个类器官盒之间或之中。包含互连的流体交换网络的hvCOC系统的典型实施例使用数据处理器控制至少一个阀和至少一个泵来控制流体流量。在一些实施例中，hvCOC系统还包含用于引入化合物例如治疗剂、候选治疗剂、药物或候选药物的端口。在一些实施例中，互连的流体交换网络包含至少两个类器官盒之间的流体连通，并且在典型的实施例中，流体连通由控制至少一个阀和至少一个泵的数据处理器控制。在一些实施例中，互连的流体交换网络提供了用于至少两个类器官盒的部分共用的流体递送路径、用于至少两个类器官盒的部分共用的流体排出路径，或用于至少两个类器官盒的部分共用的流体递送路径和部分共用的流体排出路径。在典型的实施例中，流体是培养基。在一些实施例中，流体交换网络提供自动化培养基交换，例如通过使用数据处理器控制至少一个阀和至少一个泵从而控制流体(例如培养基)交换。在一些实施例中，hvCOC系统还包含气压控制器，例如控制至少一个模块中或一个或多个类器官盒中02和C02中的至少一种的浓度的气压控制器。在一些实施例中，hvCOC系统还包含多个模块接入端口。还考虑了本文公开的hvCOC系统的实施例，其还包含用于将治疗剂递送至细胞、组织或类器官的药物灌注设备。在典型的实施例中，药物灌注设备包含用于引入化合物的端口、至少一个阀和至少一个泵，该端口与至少一个流体管线相结合，该流体管线延伸到包含欲暴露于该化合物的组织、类器官或器官的类器官盒中。可选地，药物灌注设备还包含流体管线，以及可选地，至少一个阀和至少一个泵，以从类器官盒中去除流体，例如培养基。
本公开的另一方面涉及用于测定化合物的生物活性的方法，其包含将化合物施用于本文公开的hvCOC系统中的细胞、组织或类器官，并监测细胞、组织或类器官对化合物的反应。在一些实施例中，化合物是药物、病毒载体、条件培养基、细胞外囊泡、其他细胞或其任何组合。在若干实施例中，将化合物与已知对提供化合物的类器官盒中的生物材料有影响的化学或生物制剂一起递送。在这样的实施例中，监测化合物对由化学或生物制剂引起的变化的影响。在这些实施例中，化合物和化学或生物制剂可以共同施用或施用可以在时间上偏移。在一些实施例中，生物活性是对细胞、组织或类器官的功能的调节，从而将该化合物鉴定为用于治疗细胞、组织或类器官的器官同源性病症的治疗剂。在一些实施例中，该测定测量化合物的毒性。
本公开的相关方面涉及用于测定化合物的生物活性的方法，其包含通过互连的流体交换网络将化合物施用于本文公开的hvCOC系统中的多个细胞、组织或类器官，并监测细胞、组织或类器官对化合物的反应。在一些实施例中，化合物是药物、病毒载体、条件培养基、细胞外囊泡、其他细胞或其任何组合。可以在有或没有对接收化合物的类器官盒中的生物材料具有已知作用的化学或生物制剂的情况下递送化合物。在一些实施例中，生物活性是对细胞、组织或类器官的功能的调节，从而将该化合物鉴定为用于治疗细胞、组织或类器官的器官同源性病症的治疗剂。在一些实施例中，该测定测量化合物的毒性。
本公开的另一方面是一种用于监测类器官功能的设备，其包含至少一个类器官模块，该类器官模块包含(a)多个类器官盒，其中每个类器官盒包含流体(例如培养基)入口、流体(例如培养基)出口以及至少一个与外部检测装置兼容的壁；(b)用于同时监测至少两个类器官盒的镜布置；以及(c)检测装置。在一些实施例中，检测装置是记录装置。在一些实施例中，hvCOC系统还包含温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合。在一些实施例中，hvCOC系统还包含与检测装置、温度控制元件、光源、模块接入端口或其任何组合电子通信的数据处理器。
本公开的另一方面涉及使用本文公开的hvCOC系统产生的类器官，其中该类器官包含多个分化的细胞。在一些实施例中，类器官是心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、***、子宫、血液、肿瘤、眼睛或皮肤类器官。
根据包括附图的以下详细描述，所公开的主题的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应理解，详细说明和具体实例虽然指示了优选实施例，但是仅用于说明，因为根据详细说明在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
图1.药剂对人心脏的肌力作用的筛选平台。在筛选负性和/或正性肌力剂的方法中，使用包含筛选平台的系统的三层流程图。第一阶段涉及hvCTS(人心室心脏组织条)筛选。最初，化合物是在hvCTS系统中使用一定范围的剂量和不同的起搏频率(例如，自发、0.5、1、1.5和2Hz)(n≧5)进行测试的。接着，对于确定为负性肌力剂的化合物，测定IC50，而对确定为正性肌力剂的化合物或未显示肌力作用的化合物进行第二层筛选。第二层筛选涉及hvCOC(人心室心脏类器官腔室)筛选。最初，使用hvCOC在第一层筛选所告知的剂量范围和第一层筛选所告知的起搏频率下测试化合物(n≧4)。针对发展压、搏出功和心输出量分析了剂量-反应关系。在此第二层筛选中，使用hvCOC筛选确认在第一层筛选中被确定为正性肌力剂的化合物。测定确认为正性肌力剂的化合物的EC50。也可以使用第三层筛选。第三层筛选是具有多个类器官的hvCOC筛选。在此第三层筛选中，使用多类器官hvCOC在第一层筛选所告知的剂量范围和第一层筛选所告知的起搏频率下测试化合物(n≧4)。针对发展压、搏出功和心输出量分析了剂量-反应关系。由此在存在其他类器官的情况下确认了给定化合物表现出的肌力作用，表明该化合物在一个或多个器官或器官系统中的行为。与流程图一致，人心室心脏组织条(hvCTS)筛选以hvCTS系统中在剂量范围和不同起搏频率下(例如，自发、0.5、1、1.5和2Hz)测试化合物的结果为例(n>5)。基于hvCTS结果和拟合的剂量-反应曲线确定的IC50，确定化合物为负性肌力剂。基于hvCTS结果和使用人心室心脏类器官筛选进行的第二层筛选，确认化合物为正性肌力剂，如USSN 62/592,083中所述，其通过引用并入本文中。在使用hvCTS进行的第一层筛选中显示无肌力作用的化合物，可以通过使用人心室心脏类器官筛选进行的第二层筛选来确认。在本文公开的第一层hvCTS筛选所告知的剂量范围和起搏频率下，对经受第二层人心脏类器官筛选的化合物进行了分析。针对发展压、搏出功和心输出量分析了剂量-反应关系。结果可用于确认化合物为正性肌力剂，然后对此类化合物进行EC50测定。
图2.工程化人心室心脏组织条(hvCTS)和力测量。A.工程化人心室心脏组织条(hvCTS)和力测量。定制设计的PDMS生物反应器模具中的hvCTS构造示意图。每个组织一百万个hPSC-CM与冰冷的I型牛胶原蛋白和Matrigel混合，聚合生成自组装的hvCTS，该hvCTS固定在直径为0.5mm的柔性端柱之间。培养7天后，将hvCTS保持在原始模具中，进行测试化合物筛选，其中在对收缩组织进行电场刺激和递增测试化合物的剂量时，通过实时追踪端柱挠曲来测量颤搐力。使用保持在原始模具中的hvCTS，并通过应用基于弹性理论的梁弯曲方程(F＝{(3πER4)1\2a2(3L-a)]}δ，其中F为组织收缩力；E、R和L分别代表PDMS柱的杨氏模量(Young’s modulus)、半径和长度；a是组织在柱上的高度；δ是测得的尖端挠度)计算力来获得力测量结果。B.代表性轨迹显示硝苯地平(nifedipine)、异丙肾上腺素和妥卡尼(tocainide)在0Hz至2Hz电起搏下的收缩概况。C.针对不同的起搏频率拟合每种药物的剂量-反应曲线。负性肌力剂硝苯地平显示随着起搏频率从0.5Hz增加至2Hz，EC50从2.27μM降低至0.544μM。正性肌力剂异丙肾上腺素随着起搏频率在0.031pM至0.059pM范围内增加显示一致的EC50。在所有测试频率下，妥卡尼对收缩力均无剂量依赖性作用。D.力频率分析表明，在所有起搏频率下，硝苯地平均会随着浓度的增加而引起收缩力的降低。在所有测试的起搏频率下，异丙肾上腺素均会随着浓度的增加而引起收缩力的增加。妥卡尼没有观察到相关的剂量依赖性作用。
图3.相对于在无药物基线条件下在0.5Hz(30bpm)下产生的力进行标准化，力-频率分析显示，已知的肌力剂在所有起搏频率下均在有效浓度范围内随着剂量的增加而引起收缩力的变化。负性肌力剂包括钙通道阻滞剂和4种I类抗心律失常药物中的2种，在所有4个频率下均显示出收缩力随着化合物浓度的增加而降低。正性肌力剂在所有4个频率下均显示出收缩力随着药物浓度的增加而增加。数据显示n＝4-8的平均值+SEM。
图4.相对于在无药物基线条件下在0.5Hz(30bpm)下产生的力进行标准化，力-频率分析显示在所有起搏频率下，收缩力响应于在有效浓度范围内剂量递增的17种未知化合物。根据力-频率分析，将未知化合物分类为正性肌力剂、负性肌力剂和无肌力反应的化合物。在17种化合物中，有两(2)种被鉴定错。数据显示n＝3-8的平均值+SEM。
图5.用hvCTS筛选已知的肌力药物。A.代表性轨迹显示已知正性肌力剂、负性肌力剂和没有已知肌力作用的药物的收缩概况。B.在1Hz起搏频率下拟合的药物剂量-反应曲线显示出正性、负性和无肌力作用。C.在1Hz起搏频率下计算的表现出负性肌力作用的药物的IC50和表现出正性肌力作用的药物的EC50比较。左图，从左到右：阿米替林(Amitryptyline)、硝苯地平、奎尼丁(Quinidine)、利多卡因(Lidocaine)和氟卡尼(Flecainide)。中图，从左到右：赖诺普利(Lisinopril)、格列本脲(Gilbenclamide)、去甲肾上腺素(Norepinephrine)、多巴酚丁胺(Dobutamine)、咖啡因(Caffeine)、米力农(Milrinone)和地高辛(Digoxin)。D.通过对肌力剂的盲法和非盲法筛选确定的EC50/IC50的比较。
图6.在盲法研究中筛选的17种化合物的代表性hvCTS颤搐力轨迹。根据力-频率分析，将未知化合物分类为正性肌力剂、负性肌力剂和无肌力反应的化合物。在17种化合物中，有两(2)种被鉴定错。
图7.用hvCTS进行化合物的盲法筛选。A.代表性轨迹显示在数据分析后分类为具有负性肌力、正性肌力和无作用的药物的收缩概况。B.在1Hz起搏频率下拟合的药物剂量-反应曲线显示出正性、负性和无肌力作用。C.在1Hz起搏频率下计算的表现出负性肌力作用的药物的IC50和表现出正性肌力作用的药物的EC50比较。左图，从左到右：阿米替林、硝苯地平、奎尼丁、利多卡因和氟卡尼。中图，从左到右：赖诺普利、格列本脲、去甲肾上腺素、多巴酚丁胺、咖啡因、米力农和地高辛。D.通过对肌力剂的盲法和非盲法筛选确定的EC50/IC50的比较。
图8.hvCTS和hvCOC中药物作用的比较。异丙肾上腺素对人心室心脏类器官腔室(hvCOC，一种3D心脏类器官)功能的影响显示出搏出功、心输出量和压力体积环的增加。相对于在hvCTS中观察到的响应于异丙肾上腺素的收缩力的增加，观察到hvCOC心脏类器官中压力有更强劲的增加。
图9.A)生物反应器系统的示意图，该系统包含类器官模块10、计算机控制的检测/记录装置2(例如照相机)，用于通过角锥反射镜13同时对多达四个类器官盒20进行成像(并可选地保存图像)，每个类器官盒都含有类器官1(其中至少一个是心脏，而其他则可以是任何类器官，例如心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、***、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛或皮肤)。类器官模块10可以含有多个相同类型的类器官1或多种类器官1类型。B)由计算机或数据处理器5组成的成像生物反应器平台的示意图，该计算机或数据处理器控制类器官模块10的阵列。
图10.具有四个类器官盒20的类器官模块10的三维渲染图。示出了等轴测图和侧视图。还显示了类器官1、连接到透镜3的检测/记录装置2、灯12(例如LED灯)、角锥镜13、类器官盒20、温度控制元件4(例如加热器)以及混合器19，例如搅拌棒。
图11.A)用于类器官盒的流体交换系统的示意图，包括流体管线、泵、阀、压力传感器和流体箱。根据功能使用阀和泵的特定配置，例如B)抽吸或C)向培养基槽中添加新鲜培养基。实例6中提供对生物反应器系统的图示实施方案的详细描述。
图12.A)流体交换系统的图形表示，该流体交换系统由在模块内的多个类器官盒之间引导培养基的流体管线、泵和阀组成。可以连接多种类器官类型来模拟“罐中身体”。B)具有足够泵送能力的心脏类器官可以用作唯一的生物泵，以形成自动力的“罐中身体”。实例6提供了生物反应器系统的这些实施方案的附加描述。
图13.A)示出了生物反应器系统的一个实施例，其显示了用于通过由阀控制的类器官1的培养基交换的入口和出口路径(左窗格：心脏类器官；右窗格：肝脏类器官)。B)机械刺激系统的示意图，其中可逆流体泵连接到类器官1以进行充气和放气。基于刺激系统传递的压力变化和类器官1的柔韧性，类器官1受到拉伸。
图14.用于操作生物反应器平台或系统的LabVIEW前面板的示意图。A)多个类器官的采集预览窗口。B)环境控制面板。C)电刺激参数。用户可以选择控制电压功率、更改频率、选择要刺激的腔室并决定发送连续刺激或单个脉冲。D)四个不同类器官的实时压力、体积数据。压力用灰线表示，而类器官体积用黑线表示。E)记录参数。
图15.MATLAB分析以从采集中生成平均P-V环。A)计算组织的平均体积收缩曲线。将跳动的每个体积收缩绘制为散点图，最大收缩时间设置为t＝0秒。平均曲线表示为红色实线。B)总结多个收缩的平均P-V环线图。红色圆圈表示采样时间点的值。
图16.LabVIEW软件的流程图，该软件用于监测本文公开的系统和设备中的细胞、组织和类器官。流程图示意性地例示了基于软件控制环境变量，例如温度和C02水平，以及基于软件控制系统和装置的特征，例如透镜控制、照明控制和系统或设备中包含的细胞、组织和/或类器官的电刺激控制。
图17.用hvCTS筛选已知的肌力药物。A.代表性轨迹显示已知正性肌力剂、负性肌力剂和没有已知肌力作用的药物的收缩概况。B.在1Hz起搏频率下拟合的正性和负性肌力剂的剂量-反应曲线。没有已知肌力作用的药物的剂量-反应关系不相关。C.在1Hz起搏频率下计算得出的负性肌力剂的IC50比较和正性肌力剂的EC50比较。
具体实施方式
本公开提供了用于针对肌力作用筛选化合物的多层系统和相关方法，并且还可以用于评估其他化合物对生物细胞、组织和/或器官的作用，例如毒性。该系统和方法有效地鉴定和表征正性肌力剂和/或负性肌力剂。典型的配置涉及两层系统和相关方法，其中第一层被设计成提供准确而快速、通用且有成本效益的化合物肌力作用初始筛选。第一层系统包含心脏组织条(CTS)，例如以允许凝胶运动显著灵活性的方式支撑的人心室心脏组织条(hvCTS)，以及在存在或不存在测试化合物的情况下捕捉凝胶运动的相关检测(例如记录)装置。CTS易于制备，并且以简单方法用于筛选化合物诱导包埋细胞的凝胶运动的能力。第一层系统和方法适用于高通量格式以及常规格式。第二层筛选系统和方法涉及组织和类器官，该组织或类器官被开发并维持在通常位于类器官模块中的类器官盒中，如本文所述。第二层筛选涉及在置于检测(例如记录)装置可监测类器官行为的环境中的盒中，将组织或类器官暴露于化合物，优选地表现出肌力作用的化合物。该环境通常还提供在受控条件下递送和除去流体，例如培养基和含化合物的流体，需要各种控制来维持与组织或类器官生存力相容的环境。该两层系统用于两层方法中，该方法揭示了在细胞、组织和/或类器官或器官水平具有肌力作用的化合物，从而提高了在具有肌力作用的化合物的筛选中获得的结果的准确性和可靠性。此外，本公开提供了三层系统和方法，其涉及上述两层系统和方法并补充了涉及多类器官(或多组织或混合组织和类器官)模块系统和相关方法的第三层系统和方法。在此第三层中，将多种组织和/或类器官开发并维持在可以方便地位于单个类器官模块中的不同类器官盒中(应理解，类器官盒类器官模块可以含有组织或类器官)，这些组织和/或类器官可以是相同类型(例如心脏)或不同类型(例如心脏和肝脏)。这种典型的布置方便地允许将单个镜系统(例如角锥镜系统)与单个检测(例如记录)装置结合使用。在使化合物经历三层系统和方法时，获得有关化合物对细胞的肌力作用以及化合物对一种或多种同源组织、类器官或器官，或多个不同的组织、类器官或器官的作用(包括肌力作用)的信息。三层筛选系统和方法进一步增强了在准确性、可靠性和可重复性方面获得的数据，并在金钱和时间方面增加了可管理的成本。
在药物筛选方法中，三维(3D)工程化组织具有优于二维(2D)制备物的优势，因为当与2D单层相比时，3D表现出更大的生理学相关性，包括基因表达和电生理学。与此观点一致，本文证明了以下事实：较高阶的3D组织在功能上更加成熟，并且在暴露于已知的药剂时更精确地显示收缩反应。
本文公开的筛选系统的第一层中的hvCTS的一个优势在于，在PDMS模具中完整地测量了收缩特性，而无需将hvCTS转移到另一个容器中，从而在保留长期实验的可能性的同时实现了更高的标准化程度和更高的通量。已经认识到，组织的批次之间可能存在变化，并且可能产生大约10倍的变化。不希望受到理论的束缚，这种变化可能是由于人工制造的PDMS柱的几何形状的变化和弹性的变化所致，从而导致力计算的变化。已基于约200个hvCTS引入了纳入和排除标准，已对其进行分析以客观和系统地识别异常值，这些异常值小于为研究制作的hvCTS的2％。特别是，那些在基线、无药物条件下以1Hz起搏时发展力为cO.OlmN(<10％百分位数)的hvCTS被排除在研究之外。
hvCTS系统包含生物相容性凝胶。凝胶可以由(例如Cultrex)或能够形成凝胶并提供环境的任何生物相容性化合物或混合物形成，其中凝胶中所含的细胞能够以与其天然生理学功能相一致的方式起作用。生物相容性凝胶可以由琼脂糖、明胶和本领域已知的其他化合物及化合物混合物形成，其中
hvCTS系统的实施例包含生物相容性凝胶，其包含心肌细胞，例如人心肌细胞(例如人心室心肌细胞)。心肌细胞可以来源于心脏组织、心脏器官，或者可以来源于人多能干细胞。心肌细胞可以一定浓度范围存在于生物相容性凝胶中，例如104-109个细胞/毫升，例如106个细胞/毫升生物相容性凝胶的浓度。所公开的系统和方法的主要焦点是心肌细胞行为和心脏生理学，以所公开的系统的名义产生“hvCTS”，本公开设想了包含肌细胞(例如骨骼肌和平滑肌肌细胞)和其他适合于使用所公开的系统进行生理监测的细胞的生物相容性凝胶。相同的生物相容性凝胶也适用于制备第二层筛选中使用的心脏类器官，从而允许直接比较两层筛查中获得的结果。
在包含心肌细胞的hvCTS系统的实施例中，凝胶的生物相容性允许心肌细胞以一定方式相互作用，从而在体内引起收缩和放松行为的条件下产生收缩和放松的集体能力。特别地，生物相容性凝胶中所含的心肌细胞在电刺激下以本文公开的起搏频率共同收缩，并且收缩力可以通过已知的肌力剂改变，其中已知的正性肌力剂增加给定电脉冲引起的收缩力并且已知的负性肌力剂降低给定电脉冲引起的收缩力。电脉冲可以由任何合适的电源提供，该电源能够以0.1-10Hz的递送或起搏频率，例如通过提供0.5、1.0、1.5和/或2.0Hz的起搏频率递送10V、持续时间为5毫秒的电脉冲。
生物相容性凝胶的形成是使用任何合适维度集的模具来实现的，并且由与生物相容性凝胶材料的凝胶化相容的任何材料制成，例如包含人心室心肌细胞的在一些实施例中，模具由与凝胶化和心肌细胞相容的聚二甲基硅氧烷形成。模腔的典型形状是矩形棱柱(即三维矩形)，其深度(即高度或厚度)不小于将在模具中形成的生物相容性凝胶的预期厚度。如实例1中所公开的，典型的模腔可以具有大约或恰好26.5mm×16mm×6mm的尺寸，但是可以理解的是，生物相容性凝胶的尺寸以及用于其形成的模具可以按比例放大或缩小，并且可能与所公开的示例性尺寸有很大不同。
本文公开的hvCTS系统还提供了用于生物相容性凝胶的生物相容性支撑设备。生物相容性支撑设备允许将生物相容性凝胶放置在空气中，远离除生物相容性支撑设备之外的任何固体表面支撑物。生物相容性支撑设备允许生物相容性凝胶具有更大的运动自由度，特别是在竖直平面上的运动。更大的运动自由度的结果是，可以检测到由于收缩引起的生物相容性凝胶的任何运动，同时减少或最小化来自支撑结构的干扰。因此，用于生物相容性凝胶的生物相容性支撑结构是至少两个竖直支撑构件，并且通常是两个竖直支撑构件(例如腿或柱)。竖直支撑构件可以由能够稳定地支撑生物相容性凝胶的重量的任何生物相容性材料构成。用于支撑设备(例如竖直支撑构件)的示例性材料是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。考虑了与支撑设备在稳定地支撑生物相容性凝胶中的功能兼容的任何形状，示例性形状是至少一个具有圆形、卵形、矩形、三角形或至少五边几何平面形式的横截面形状的支柱。在包含至少两个竖直支撑构件作为生物相容性支撑设备的实施例中，竖直支撑构件的形状可以相同或不同。一种示例性的生物相容性支撑设备是由PDMS制成的两个直径约为0.5mm的近似圆形的柱。通常，竖直支撑构件的高度是相似的或相同的，从而导致生物相容性凝胶基本上是水平的，包括与肉眼水平的外观。支撑设备，例如一些实施例的至少两个竖直支撑构件，通过粘附或机械附接或表面张力固定到生物相容性凝胶，或者可以通过在凝胶形成期间将支撑设备包埋于生物相容性凝胶制剂(即生物相容性凝胶材料)中而将支撑设备集成到生物相容性凝胶中。生物相容性凝胶和生物相容性支撑设备组合形成组织条，并且当生物相容性凝胶中所含的细胞是心肌细胞时，组织条是心脏组织条。
hvCTS系统还包含检测装置，它是能够检测生物相容性凝胶瞬态运动的任何照相机、便携式摄像机、胶片记录器或数字记录装置。示例性记录装置是高速照相机，如实例1中所述，其中照相机每秒可以记录约100帧。在一些实施例中，检测装置与计算能力源(例如计算机)进行电子通信，该计算能力源可以记录并任选地分析装置检测到的任何运动。能够在例如计算机上赋予记录和/或分析功能的软件包括运动检测/分析软件，该软件足够稳健以处理由检测装置检测到的运动数据。示例性软件是LabView软件。
本公开还提供了一种通过提供生物相容性模具(例如PDMS模具)来制造心脏组织条的方法，该生物相容性模具具有形状和大小合适的腔以形成期望的生物相容性凝胶。将生物相容性凝胶材料(例如和I型人胶原蛋白)与多个细胞(例如人心室心肌细胞)混合，并在凝胶材料将发生凝胶化的条件下将混合物添加到模腔中。将足够量的凝胶材料添加到模具中，以覆盖腔体的底部，并将腔体填充至生物相容性凝胶所需的高度。对于包含
hvCTS系统还可以用于筛选肌力剂或改变心脏收缩力的化合物。该系统可用于筛选正性肌力剂，即诱导收缩力增加的化合物，以及筛选降低收缩力的负性肌力剂。在实践中，具有包含感兴趣的细胞(例如人心室心肌细胞)的生物相容性凝胶的hvCTS系统以0.1-10Hz(例如0.5Hz、1.0Hz、1.5Hz或2.0Hz)的起搏频率暴露于供应10V、持续时间为5毫秒的电源的引线。将脉冲施加到生物相容性凝胶，使生物相容性凝胶与候选肌力剂接触或不接触，并且检测装置可操作。在典型的实施例中，使用与检测装置电子通信的计算能力源(例如计算机)来检测和分析生物相容性凝胶的任何运动，该检测装置通常是高速照相机，但也可以是能够检测生物相容性凝胶运动的便携式摄像机、胶片记录器或数字检测和可选地记录装置。如果化合物导致生物相容性凝胶的运动相对于不存在该化合物时凝胶的运动发生了改变，则该化合物被鉴定为肌力剂。如果运动在存在化合物的情况下相对于不存在的情况较小，则该化合物被鉴定为负性肌力剂；并且如果生物相容性凝胶运动在存在化合物的情况下相对于不存在的情况较大，则该化合物被鉴定为正性肌力剂。使用公开的hvCTS系统的筛选方法为能够调节心脏收缩力的生物活性化合物提供了快速的初始筛选。所公开的方法适用于化合物的高通量筛选，并提供对潜在治疗剂的快速、有成本效益和准确的初步评估。预期本文公开的方法和系统将用作多级开发工作的一级，以鉴定心脏治疗剂，例如通过使用例如心脏类器官对公开方法中鉴定为正性或负性肌力剂的化合物进行二阶筛选，心脏类器官将在工程化用于筛选生物活性化合物的系统中的心脏类器官腔室中找到。
为了确认hvCTS和hvCOC系统作为用于鉴定对多种药理化合物的收缩反应的体外筛选系统的有效性和可靠性，在盲法和非盲法环境下对主要药物类别的药理化合物进行了筛选。在本文所含的实例中公开的盲法筛选中，所有负性肌力剂均通过在人心室组织制剂的报道范围内的EC50估算值正确鉴定。此外，所公开的hvCTS系统足够灵敏以准确辨别同类药物之间效力的差异，如在L型钙通道阻滞剂的情况下所证明的。与以前报道的其他工程化心脏组织一样，hvCTS系统对正性肌力剂(包括异丙肾上腺素和地高辛)的反应很小[3，4]。在增加的浓度下在起搏频率范围内对药物反应的分析使我们能够准确地鉴定出具有所报道的正性肌力作用的那些药理化合物。尽管在成功测定时大多数正性肌力剂对hvCTS的作用很小，但发现EC50测定值与已知文献值相符，发现8种测试化合物中只有1种超出范围。因此，本文报道的实验结果证实，简单而快速的hvCTS筛选系统减少假阳性和假阴性。在盲法筛选中进一步评估了hvCTS筛选系统的预测能力，发现负性、正性和无效肌力作用的准确度分别为100％、86％和80％。有趣的是，本文公开的适用于两层或三层系统第二层的hvCOC筛选系统是一种具有早熟环境的筛选系统，其产生生理学上复杂的参数，显示出增强的正性肌力。基于这些结果，两层筛选系统特别适用于避免假阳性和假阴性。使用这样的筛选系统将通过导致更好的总体成功来促进药物发现，从而弥合不准确的动物模型和人类患者之间的长期差距。因此，预期本文公开的筛选系统将导致更好的总体筛选成功和药物开发流水线的复兴。
各种心脏活性药物报道的大多数EC50值是从体外分离的心肌条获得的，并且所公开的hvCTS系统与这种分离的肌条相当。还对分离的小鼠或大鼠心脏进行了研究，测量具有心血管作用的各种药物的心脏功能。然而，即使对于这些动物模型，也很少报道具有EC50估算值的剂量范围。本文公开的实验结果提供了基于人心脏组织的测定系统中多种药理化合物的第一个EC50值。
盲法研究表明，第一级筛选在检测化合物的正性肌力作用方面存在局限性，具有假阳性(赖诺普利)和假阴性(多巴胺)结果。随着心脏类器官更加成熟，预期正性肌力作用将取决于更完善的肾上腺素信号传导和钙处理，从而可以更准确、更灵敏地检测到。第二级筛选设备提供了一个平台，用于同时监测一个或多个人类器官(包括至少一个心脏类器官)，并为潜在肌力化合物的高含量、物种特异性的体外筛选提供自动化培养、调节、多个类器官之间的信号传导以及功能性人体替代品的评估，以增强新治疗剂功效和毒性的临床前测试，作为动物测试的优选替代方案。使用二级筛选系统有望使用快速且有成本效益的筛选方法以可靠的方式准确鉴别肌力化合物。预计同时记录多种类器官的数据将大大提高一致性和通量，特别是对于分析长期药物反应(即超过24小时且长达数周)的实验而言。当前的体外治疗剂筛选方法中尚存在缺口，无法解释罕见的不良反应。治疗剂筛选通常以急性方式进行(即在药物暴露后5-30分钟之内，具有短暂的数据采集时间)，并且可能不准确地预测长期作用或错过罕见事件。二级平台还提供了筛选系统所需的许多特征，例如1级的快速、高通量初始筛选，以及系统第二级设备中的潜在肌力化合物灌注、电点刺激、机械刺激、“即插即用”可更换的类器官盒和多类器官成像。类器官模型的电点刺激可以表征传导特性，这不同于典型的电场刺激可以一次激活所有细胞。这项创新技术有望弥合治疗剂开发途径中的长期障碍，从而彻底改变治疗剂发现过程。
人干细胞及其衍生物为体外治疗剂筛选平台的开发提供了令人振奋的机会，因为它们是人体来源的并且功能与分化后的天然人体细胞相似。但是，标准的二维(2D)细胞培养物或三维(3D)胚状体不能复制实际人体器官组织的基本特征。研究人员在使用组织工程技术对预测类器官模型进行工程设计时已经重现了人体组织的特征。将生物相容性凝胶中所含的细胞的快速初始筛选与可用于单个药物筛选平台中的第二级筛选的多种类器官相结合，可以并且有望进一步改善人体功能的重建，因此，提高了我们预测对人类的治疗效果的能力，从而为动物测试提供了更有效和更道德的替代方案。
本公开提供了一种模块化成像平台，其中数据处理器(例如计算机)同时控制至少一个或多个记录装置(例如照相机)，其中每个图像可以记录包含心肌细胞的凝胶的行为或可以记录多个类器官的行为(图9)。图16示出了实现这种控制的软件图。第二级设备的类器官模块被描述为用于多个类器官盒的单个生物反应器外壳，其特征有助于治疗剂筛选(图10)。这些特征包括(a)使用单个记录装置进行多类器官采集的镜布置(例如角锥镜)，(b)用于自动化培养基交换的流体交换系统(图11)以及(c)培养基在类器官之间的受控交换(图12)。其他特征包括(d)混合器(例如磁力搅拌器)，用于有效混合培养基溶液；(e)温度控制元件和C02控制元件，用于控制生理环境条件以进行长期培养和采集；(f)压力控制，用于组织形成和培养期间的机械刺激(图13B)；(g)电点刺激，用于控制跳动速率；(h)灌注，用于自动递送治疗剂；以及(i)阀，用于引导流体通过类器官(图13A)。
实例
实例1
在本实例中，描述了用于进行以下实例中公开的研究的方法。
从人多能干细胞衍生心肌细胞。所有实验均使用源自人胚胎干细胞系(hESC系)hES2(ES02,Wicell,Madison,WI,ETSA)的细胞，该细胞在Matrigel上的mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies)中以无饲养层培养的方式繁殖。使用先前开发[1]并通过引用并入本文的方案，使用小分子Wnt抑制剂IWR-1，实现定向心脏分化。第8天后，将分化的心肌细胞维持在无补充剂的分化培养基(StemPro-34基础培养基(Gibco)、StemPro-34营养补充剂(Gibco)、IX青霉素-链霉素(ThermoFisher)、IX GlutaMAX(ThermoFisher))中，直至将其用于hvCTS或人心室心脏类器官腔室(hvCOC)的产生。
hvCTS构建体的产生。在分化的第14天，用胰蛋白酶/EDTA溶液(0.025％胰蛋白酶/EDTA；Invitrogen)将细胞簇酶解成单个细胞，保持20分钟，然后使其再悬浮于分化培养基中。48小时后，通过离心(300g，5分钟)收集细胞，将其以1×108个细胞/毫升的浓度再悬浮于培养基[补充有10％新生小牛血清(Gibco)、IX青霉素-链霉素和25μg/ml两性霉素B(Sigma-Aldrich)的DMEM(Gibco)]中，并以1:8:1(v/v/v)的细胞/胶原蛋白/Matrigel比率与冰冷的2mg/ml I型牛胶原蛋白(Sigma-Aldrich)于0.6X PBS(Sigma)、IOμM NaOH(Sigma)、0.8X MEM(Sigma)和16μM HEPES中的混合物，以及Matrigel(BD Biosciences,SanJose,CA,USA；约10mg/ml储备液浓度)组合，另外添加1×106个细胞/毫升人皮肤成纤维细胞以帮助组织紧实。为有效产生收缩力，对该比率进行优化，而且可以调节浓度以模拟疾病状态，例如纤维化。然后，将细胞/胶原蛋白/Matrigel混合物吸移到由聚二甲基硅氧烷(PDMS)(L×W×H＝26.5mm×16mm×6mm)弹性体制成的定制模具中，用100μl填充矩形孔(长1cm)(106个细胞/孔)，然后在37℃、5％C02下培育2小时，以使胶原蛋白聚合。本领域普通技术人员将认识到，凝胶可以形成为多种大小和形状中的任一种，并且用于形成这种凝胶的模具也可以形成为多种大小和形状中的任一种，这取决于模制凝胶的预期用途。然后，将模制的混合物用培养基(补充有10％新生小牛血清的DMEM)浸泡，并且每天更换一半培养基以维持培养。在48小时的时候，将铸模中的***物取出，得到自组装的hvCTS，该hvCTS的每一端保持在0.5mm直径的圆形PDMS柱之间。显然，这些柱可以由适于至少一种灭菌形式的任何柔性材料形成，这是合适的。如上所述，整个模具可以根据应用按比例放大或缩小，柱也可以按比例放大或缩小。通常，柱的高度将类似于孔的高度(例如，在一个示例性实施例中是约6mm)。预期多种横截面形状中的任一种都适合用于根据本公开的系统、设备和方法中。产生hvCTS后7天，将hvCTS用于药物筛选。
用hvCTS进行药物筛选。首先，准备用于筛选的药理化合物。从Sigma购买用于非盲法“开放标记”筛选的化合物，并根据产品信息以最高可能的浓度制备储备溶液。为每种药物准备在5-对数范围内的工作浓度。
在本文所述的一种盲法筛选中(参见例如实例4)，将17种化合物的粉末在DMSO中复原并根据供应商提供的信息进行制备。根据供应商提供的剂量范围建议，为每种药物准备在5-对数范围内的工作浓度。
剂量反应和力测量。用含HEPES但无酚红的DMEM高葡萄糖培养基替换含有新生小牛血清的培养基，用于对hvCTS中产生的力进行光学测量。确定这些实验的最佳体积是5mL。使用集成的柔性PDMS柱作为力传感器，通过高速照相机(100帧/秒)和LabView软件(National Instruments,Austin,TX,USA)实时捕捉柱的挠曲，应用由弹性理论得出的梁弯曲方程计算颤搐力，该方程如先前所述并通过引用并入本文。这些测量结果是通过将hvCTS维持在产生该hvCTS的原始模具中并且hvCTS浸泡在37℃培养基中而获得的。对于每种药物，通过累积方式，将药物以半对数增量添加到hvCTS中，测量响应于9种剂量产生的力。对于每种剂量，均测量了使用场电极在0Hz、0.5Hz、1Hz、1.5Hz和2Hz电起搏下产生的力。
数据分析。通过定制的MatLab程序计算和分析数据。通过绘制在不同浓度下在0.5Hz、1Hz、1.5Hz和2Hz下产生的力生成每种药物的力频率曲线。所有力都相对于在无药物基线条件下在0.5Hz下产生的力(100％)进行标准化。
通过绘制在1Hz下产生的力与药物浓度的对数的函数关系图来构建剂量-反应曲线。在无药物基线条件下产生的力定义为100％。然后，将在每种药物浓度下产生的力相对于在相关的无药物基线条件下产生的力标准化。使用商业软件(GraphPad SoftwareInc.)，通过拟合至如下所示的四参数剂量-反应方程来估算每种测试药物的EC50：Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(l+1O(LogEC50-X)*希尔斜率)。X是药物浓度的对数；Y是在1Hz起搏频率下产生的标准化力；Top和Bottom是曲线本身顶部和底部平线区的Y值；基线是定义0％(标准药物引起的最大抑制作用)的Y值。希尔斜率(Hill Slope)量化剂量-反应曲线的陡度(希尔斜率越高，曲线越陡)。
人心室心脏类器官腔室(hvCOC)的产生。hvCOC制造的初始步骤，从细胞簇的解离到制备具有1×106个细胞/毫升人皮肤成纤维细胞的细胞/胶原蛋白/Matrigel混合物，都与以上关于hvCTS产生所描述的步骤相同。
为了产生腔室，我们遵循与通过引用并入本文中的公开的程序29相似的程序。简而言之，对3×3×6cm聚苯乙烯生物反应器的顶部进行修改，以允许9号皮下管(Small Parts)穿过中心以及直径为4mm的石墨电极(GraphiteStore)在生物反应器的边缘侧接腔室。将一根6-Fr的硅橡胶球囊Foley导管(Cook Medical)切掉尖端，并用硅橡胶填缝剂密封，通过该9号管穿入生物反应器的中心。将由亲水性多孔聚乙烯(Fisher Scientific)切下的小环放在该皮下管上的球囊的正上方。
用蒸馏水填充球囊至所需的腔室大小，并同心放置在2％琼脂糖模具中，该模具是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中产生并通过将13mm直径的试管(VWR)***琼脂糖的中心制成。琼脂糖模具形成外部模具边界，而导管球囊形成内部边界。将导管轻轻地拉向皮下管，并用尼龙螺旋压缩机管夹(Fisher Scientific)夹在该皮下管上方，以确保球囊不在模具内移动。将1mL冰冷的无菌组织混合物转移到模具中，以确保完全覆盖多孔聚乙烯环。将整个装置在37℃和5％C02下培育2小时以引发凝胶聚合，然后将其浸入NCS培养基中。24小时后，将带有皮下管、导管和组织的生物反应器的顶部从琼脂糖取出，并转移到含有20mL NCS培养基的另一个聚苯乙烯生物反应器中。在此环境中，在37℃和5％C02下将组织维持10天，每日更换一半培养基，在此期间，组织在球囊核周围压紧，形成人为工程化的心脏类器官。
hvCOC收缩功能的表征。培养10-12天后，将硅橡胶球囊放气并从类器官内部小心地取出。将高灵敏度的差压传感器(Millar)通过与大型培养基储集器相连的闭环流体系统***腔室的内腔。安装在生物反应器外部的数字照相机(PixelLINK)允许以43帧/秒采集图像进行直接组织监测。使用LAB VIEW(National Instruments)中内置的自定义采集程序同时采集腔室压力和数字视频，并使用MATLAB(MathWorks)中的自定义脚本从视频中提取腔室横截面积。通过假设具有相同横截面积的等效球体来估算腔室体积。使用GRASS S88x刺激器(Astro-Med)以指定的频率在63mV/mm的场刺激下进行功能泵分析。刺激脉冲长度是50毫秒。在进行数据分析之前，压力信号和视频信号都要通过MATLAB中具有13Hz截止频率的数字低通滤波器。
实例2
开发基于hvCTS的药物筛选方案。为了验证hvCTS作为药物筛选模型，对hvCTS进行0Hz、0.5Hz、1Hz、1.5Hz和2Hz电起搏。结果显示从0.5Hz到1Hz的平坦至正向力-频率关系和从1Hz到2Hz的负向力-频率关系，随着起搏频率的增加，产生的收缩力减小(图2和3)。当将负性肌力剂硝苯地平施用于hvCTS时，在所有测试的起搏频率下，观察到产生的收缩力呈剂量依赖性降低(图2C、2D和3)。在0.5Hz、1Hz、1.5Hz和2Hz下确定的IC50分别为2.3μM、0.62μM、0.61pM和0.54pM。当将正性肌力剂异丙肾上腺素施用于hvCTS时，在所有测试的起搏频率下，观察到产生的收缩力呈剂量依赖性增加(图2C和2D)。在0.5Hz、1Hz、1.5Hz和2Hz下确定的EC50分别为0.039pM、0.059pM、0.054pM和0.031pM。在测试妥卡尼的不同频率下，未观察到产生的收缩力的一致变化。由于在不同的起搏频率下测得的EC/IC50没有显著差异，并且仅在0.5Hz至1Hz下观察到正向力-频率关系，因此在分析针对药物测试的所有浓度的力-频率关系，以确定对测试的hvCTS中产生的收缩力的剂量依赖性作用后，在1Hz的起搏频率下确定EC/IC50用于后续筛选。
实例3
筛选影响心脏收缩性的已知药剂。作为下一个验证步骤，测试了对心脏收缩性具有已知作用的药物。总共测试了13种已知对心脏收缩性具有正性作用、负性作用或无作用的药物。用于制造研究中所用的hvCTS的hPSC-CM具有80±2.2％cTnT+细胞的平均纯度。在基线时，65.7％(n＝70)的hvCTS发生自发性收缩。所有hvCTS在电刺激下都会产生收缩力。当以1Hz电起搏时，平均产生的收缩力为0.076+0.025mN(n＝70)。那些在基线无药物条件下以1Hz起搏时产生的力小于O.OlmN(小于10％百分位数)的hvCTS(参见表1)被排除在研究之外。
钙通道阻滞剂，包括维拉帕米(verapamil)、硝苯地平、苄普地尔(bepridil)和米贝地尔(mibefradil)，在所测试的hvCTS中均显示出产生的收缩力的剂量依赖性降低，在1Hz起搏频率下暴露于钙通道阻滞剂计算的IC50分别为0.078μM、4.2pM、3.3pM和38pM(图3、17B和17C)。两种I类抗心律失常药，即丙吡胺(disopyramide)和氟卡尼(flecainide)，也显示出产生的收缩力的剂量依赖性降低，EC50显著较高，分别为80pM和75pM(图3、17B和17C)，而其他两种I类抗心律失常药，即普鲁卡因胺(procainamide)和妥卡尼，在所测试的所有浓度和起搏频率下均未显示对产生的收缩力的任何影响(图17B)。β激动剂，包括异丙肾上腺素和多巴酚丁胺，是已知的正性肌力剂，在所有测试的起搏频率下显示出产生的收缩力很小但不变的剂量依赖性增加，EC50分别为0.15pM和0.015pM，其中收缩力使用1Hz起搏频率进行测量(图17B和17C)。其他已知的正性肌力剂，包括钙敏化剂左西孟旦(levosimendan)、KATP通道抑制剂格列本脲和磷酸二酯酶抑制剂米力农，在所有起搏频率下产生的收缩力也均显示出剂量依赖性增加，EC50在亚微摩尔范围内(左西孟旦＝0.15pM；格列本脲＝0.93pM；米力农＝0.41pM)(图17B和17C)。
表1：用hvCTS测定测量并如文献报道的测试化合物的EC50/IC50值的比较。
表2总结了从开放标记、非盲法药物筛选测定中获得的基线数据的分析。
表2：用于开放标记非盲法药物筛选测定的hvCTS中所用的hPSC-CM的发展力、自发频率和纯度的基线数据
实例4
盲法筛选影响心脏收缩性的药理化合物。进行药物的盲法筛选以研究药物对心脏收缩性的影响。使用如上所述的hvCTS筛选方案，对总共17种对心脏收缩性具有正性作用、负性作用或无作用但在测试时未知身份的药物进行了测试。当以1Hz电起搏时，平均产生的收缩力为0.060+0.005mN(n＝128)。在对药物身份未知时，发现在所筛选的17种药物中，阿米替林、硝苯地平、奎尼丁、利多卡因和氟卡尼在所有测试的起搏频率下产生的收缩力均显示出的剂量依赖性降低，因此被正确鉴定为具有负性肌力作用(图7B；另外参见图4、5和6)。在1Hz下确定的IC50值分别为0.45mM、0.15μM、0.20mM、0.44μM和15pM(图5C和7C)。基于所有浓度下的力-频率分析，正确鉴定出格列本脲、去甲肾上腺素、多巴酚丁胺、咖啡因、米力农和地高辛对心脏收缩具有正性肌力作用(图4、5B、6和7B)。在1Hz起搏频率下确定的EC50值分别为3.2μM、0.35pM、0.25pM、0.29pM、2.8pM和3.7pM(图5C和7C)。多巴胺，一种儿茶酚胺，它也是一种β-激动剂，因此具有正性肌力作用，对我们的hvCTS系统中产生的收缩力没有明显影响。其他四种药物，包括阿司匹林、普伐他汀、甲苯磺丁脲和雷米普利，均不具有已知的肌力作用，在所测试的hvCTS中对收缩性没有显示出任何剂量依赖性作用(图4、6和7B)。有趣的是，对收缩性没有已知作用的赖诺普利，随着浓度的增加，显示出产生的收缩力略有增加，因此被分类为具有正性肌力作用。总体而言，使用本文公开的hvCTS筛选方案和系统进行的盲法筛选产生的总体预测能力为0.76，灵敏度为0.78，特异性为0.76。
表3总结了从盲法药物筛选测定中获得的基线数据的分析。
表3：用于盲法药物筛选测定的hvCTS中所用的hPSC-CM的发展力和纯度的基线数据
在1HZ下的发展力
％CTNT+(按批次)
值数
128
30
最小值
0.0020
38.60
25％百分位数
0.01869
61.30
中值
0.0445
73.45
75％百分位数
0.0875
85.83
最大值
0.2700
92.20
10％百分位数
0.007918
42.19
90％百分位数
0.1338
87.88
平均值
0.05951
71.46
标准差
0.05326
16.68
平均值的标准误
0.004707
3.045
实例5
使用hvCOC的第二层药物筛选方案。由于hvCTS响应于已知具有正性肌力作用的化合物所产生的收缩力的增加很小，因此在高阶三维(3D)构建体(即hvCOC)中研究了这些正性肌力剂的作用，该构建体与本文公开的hvCTS相比大小明显更大(例如，1千万对1百万个心肌细胞)，并且具有与hvCTS的小梁肌样构型相反的泵样构型。接受异丙肾上腺素处理的hvCOC构建体引起心搏量、心输出量和发展压的浓度依赖性增加(图8)。当比较在10pM异丙肾上腺素下获得的最大效果时，hvCOC引起基线压力的132％，对比hvCTS引起基线压力的113％(图8)。
实例6
生物反应器。本公开提供了用于培养至少一种，并且在一些情况下，培养多种组织工程化的人类器官的定制生物反应器。在一些实施例中，如本文所公开的，生物反应器被用作第二层筛选设备。该装置被设计成允许互连和同时测量多个类器官，并具有通过使操作员能够以最少操纵或干预而在同一生物反应器中进行后续表征来增强类器官功能测试的重现性和效率的特征。
图9提供了高级示意图，说明所公开的生物反应器系统的多功能性。图9A显示了一个类器官模块10，该模块含有至少一个类器官盒20。类器官盒含有任何类型的单个类器官1(例如心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、***、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛或皮肤等)。类器官模块10可以含有多个类器官盒20，因此可以含有多个单一类型的类器官1或多种类器官1。类器官模块10被定向成使得检测/记录装置2(例如照相机)可以检测和记录类器官模块10的内容，例如通过使类器官模块10最靠近检测/记录装置2并且优选地垂直于该装置的表面对检测/记录装置2所检测的电磁频谱的至少一个波长基本上或完全透明来进行该检测和记录。图9B示出了与至少一个类器官模块10连接的数据处理器5，例如计算机。类器官模块10通常与检测/记录装置2呈1:1对应，并且检测/记录装置2通过通信路径7，例如常规的电线或无线通信与数据处理器5进行电子通信。视频监视器6也可以通过通信路径7连接到数据处理器5。
图10示出了类器官模块10的透视图。至少一个类器官盒20位于类器官模块10内。安置于类器官模块10之内或之外(未示出)以及安置于类器官盒20之内(未示出)或之外的是混合器19，例如上面放置类器官模块10的可移动平台(例如振动器或旋转平台)或位于类器官盒20内部或外部的磁力搅拌装置(例如搅拌棒)。在一些实施例中，至少一个光源12位于类器官模块10内，用于照亮类器官1。同样位于类器官模块10内的是至少一个镜13，用于以直射和/或反射光图像的形式将电磁辐射从类器官1引导至检测/记录装置2。在一些实施例中，镜13是角锥镜13，用于将图像从多个类器官盒20引导至单个检测/记录装置2。角锥镜13可以将多个类器官盒20的图像汇合成单个聚集的视点以使图像分辨率最大，同时允许各个类器官盒20以物理方式彼此间隔开。
图11示出了生物反应器系统的一个实施例的元件，该元件涉及流体移动，例如培养基流动，特别是涉及添加或供给新鲜培养基以及去除或抽吸用过或废弃的培养基所涉及的流体移动。图11A示出了用于类器官模块10中的单个类器官盒20的整个流体交换系统，图11B提供了用于抽吸的激活阀和泵的组合，而图11C提供了用于供给新鲜培养基的组合。该系统中涉及流体(例如培养基)运动的组件可以位于类器官模块10之内或之外。在描述如图11所示的提供流体运动的生物反应器系统的一个实施例时，注意力将集中在用于培养基抽吸的图11B以及用于将培养基供给至本公开的细胞、组织和类器官的图11C。应理解，抽吸和供给的组合描述将提供对生物反应器系统的一个实施例中的完整流体连通的描述，如图11A所示。在图11的其余描述中，附件应理解为在附接的组件之间提供流体连通。
现转到生物反应器系统的一个实施例中涉及用于抽吸培养基的图11B的特征，培养基93与盒培养基-接头D管道86接触，该管道附接到接头D阀67。类器官-接头D管道85也附接到接头D阀67。此外，接头D阀67附接到接头D-泵C管道87，该管道附接到泵C 72。泵C 72附接到泵C-接头C管道88，该管道附接到接头C阀66。接头C阀66附接到接头C-混合/再循环箱管道89，该管道又附接到混合/再循环箱73。在一些实施例中，培养基93再循环并被导向混合/再循环箱73。接头C阀66还附接到从接头C阀66通向废料的接头C-废料管道90。
在操作中，类器官中细胞的供给涉及图11C中突出显示的组件，包括新鲜培养基箱60，其附接到新鲜培养基-接头B管道78，该管道又附接到接头B阀65。接头B阀65附接到接头B-泵B管道79，该管道附接到泵B 71。泵B 71又附接到泵B-接头E管道80，该管道附接到接头E阀68。接头E阀68还附接到接头E-接头F管道82，该管道附接到接头F阀69。盒培养基-接头F管道83也附接到接头F阀69，该管道也接触盒培养基93。
描述了附加的附接组件，其在系统内提供流体连通并允许附加的功能，包括但不限于治疗性添加剂稀释、治疗剂的灌注、类器官的治疗性清洗、流体管线的冲洗等。新鲜培养基箱60附接到新鲜培养基-接头A管道74并与之流体连通，该管道又附接到接头A阀64，例如三通流体控制器或阀并与之流体连通。添加剂容器62(例如治疗剂容器)用于将至少一种治疗剂递送至添加剂箱63，该添加剂箱附接到添加剂箱-接头A管道75，该管道又附接到接头A阀64。接头A阀64还附接到接头A-泵A管道76，该管道附接到泵A 70。泵A 70附接到泵A-混合/再循环箱管道77，该管道又附接到混合/再循环箱73。在一些实施例中，来自新鲜培养基箱60的培养基用于稀释来自混合/再循环箱73内的添加剂箱63的治疗剂。混合/再循环箱73还附接到混合/再循环箱-接头B管道92，该管道又附接到接头B阀65。接头E阀68附接到接头E-类器官盒管道81。在一些实施例中，培养基可以通过接头E-类器官盒管道81进行递送，以增加类器官1内的压力。压力探针，即压力传感器95，检测类器官1内的压力和压力变化，并将压力转换为模拟电信号，该信号通常会传输到数据处理器，从而允许压力由系统监测和调整。另外，该装置提供了对流体管线的清洗或冲洗。特别地，接头F阀69附接到接头F-废料管道84，该管道又从接头F阀69引导至废料。在一些实施例中，通过经由接头F-废料管道84排出到废料，可以在不与类器官盒20接触的情况下从流体交换系统中除去流体。
图12示出了类器官模块10内的流体交换的高级示意图，以说明“罐中身体”的形成。图12A示出了流体交换系统，该流体交换系统在类器官模块10内的至少两个类器官盒20之间转移培养基。流体通过一系列的阀和泵被引导通过该系统。图12B示出了流体交换系统，其中流体由阀引导并且仅由生物泵(例如心脏类器官1)泵送，从而提供自供能的“罐中身体”。
图13示出了使流体流入和流出类器官1的方法。图13A示出了类器官1(左图：心脏类器官；右图：肝脏类器官)，其连接至培养基入口管26和培养基出口管28，从而允许流体被引导到类器官1的空隙中并通过培养基出口管28流出至废料路径。流经类器官1的流体的方向由入口阀27和出口阀29控制。图13B表示了向类器官1(例如肺类器官1)施加机械压力的方法。流体泵控制流体流动(例如气体或液体)到类器官1并调节类器官腔的压力以控制类器官1的大小。绝对压力值取决于类器官1的材料特性和给定应用所需的膜尺寸。调整施加的相对压力以使机械应变至多25％。
如对本领域技术人员显而易见的，生物反应器的一些特征是可选的，并且大多数特征存在于各种实施例中。在一些实施例中，细胞可以源自任何哺乳动物物种或被工程化为来自细胞和/或细胞外基质的类器官1。任何器官组织类型均适用于所公开的系统、组合物和方法。例如，组织可以充当任何器官的替代物，包括但不限于心脏、脑、神经、肝脏、肾脏、肾上腺、胃、胰腺、胆囊、肺、小肠、结肠、膀胱、***、子宫、血液、血管、肿瘤、眼睛和皮 肤。
含有类器官1的类器官盒20通常是由透明固体制成的立方体，其可以是一次性的或可灭菌的，具有至少两个接入端口，例如门。合适的透明固体包括玻璃和透明塑料，例如聚苯乙烯、丙烯酸和聚碳酸酯。只要检测/记录装置2可以检测和记录类器官盒20内的类器官1中的细胞的行为，类器官盒20也可以是任何多边形。假定类器官盒20的结构受到允许检测/记录装置2检测细胞行为的需求所限制，很明显可以在构造类器官盒20中使用各种透明和半透明的材料。在检测/记录装置2不检测来自类器官1的可见光的透射的实施例中，甚至设想了不透明的材料。类器官盒20也被构造成不透流体的，从而允许类器官盒20容纳盒培养基93以供给类器官1的细胞。此外，盒盖可以提供用于穿透至少一个电极或压力探针(即压力传感器95)的孔。
在类器官模块10中含有至少一个类器官盒20，该模块由与用于类器官盒20的材料相似的材料形成。类器官模块10在平面图中通常为正方形或矩形，并且除了底部外还含有顶部。类器官模块10的尺寸可容纳至少1、2、3、4、5、6、8、10或更多个类器官盒20。类器官模块10的壁、顶部和底部通常由透明固体形成，例如玻璃或透明塑料(例如丙烯酸或聚碳酸酯)，但也可以由半透明或不透明的材料制成，只要检测/记录设备2可以检测和记录细胞行为即可。类器官模块10通常还含有一个或多个光源12，以及一个或多个镜13，例如角锥镜13。在若干实施例中，对于类器官模块10中所含的每个类器官盒20，存在至少一个光源12和镜13的至少一个表面。
该系统的其余组件包括诸如新鲜培养基箱60、混合/再循环箱73和添加剂箱63之类的箱，它们是用于容纳生物反应器中使用的流体的容器。这样的箱可以是任何各种尺寸，并且可以由多种材料制成，只要所构造的箱可以在设计用于最小化生物污染的环境(例如无菌环境)中使用，并且只要所使用的材料与形成一个或多个流体移动端口兼容即可。生物反应器的实施例还可以涉及一个或多个泵，例如泵A 70、泵B 71和泵C 72，这些泵可以相同或不同，并且可以按照已知的任何提供流体(例如通过管的空气和/或培养基)移动的原理进行操作。示例性的泵包括蠕动泵、与无菌环境兼容的虹吸泵、诸如活塞驱动泵的正排量泵和诸如离心泵的非正排量泵。在一些实施例中，重力被用于使流体移动，而没有泵被用于使例如培养基移动。
类器官模块10还可以与各种管接口以使用于提供压力的气体(例如空气)移动，例如使类器官膨胀，该类器官可以是球囊(例如6-Fr硅Foley导管球囊)或用于使流体移动。压力变化足以控制球囊的充气或使流体在系统中移动，这是在与多种管类型的使用兼容的压力下实现的，而不仅仅是经认证处理高压的管道。例如，适合使用透明的塑料柔性管道，例如管道。此外，如上所述，可以将各种管子组合成单程管道，并且这种组合的管道特别适合与蠕动泵一起使用。另外，在给定实施例中使用的管道可以在组成、内径和外径上变化。该系统的另一个特征是接头。接头通常连接或附接到两个或三个管子上，它们的直径和组成可能会有所不同，如上所述。这些接头可以仅仅是导管，或更典型地，是能够将诸如培养基之类的流体从任何附接的管引向任何其他一个或两个附接的管的阀。根据本文提供的全部公开内容，其附加特征及其变化形式将变得显而易见。
在一些实施例中，类器官模型具有流入和流出的流体路径(图13A)。阀(例如止回阀、电磁阀)控制流体移动进出带有腔的类器官的方向。在一些实施例中，考虑了用于流入和流出的单个轴或管(图13B)。流体泵控制流入和流出类器官的流体流动速率。在一些实施例中，不相等的流入和流出流体速率用于控制类器官内的流体量。调节类器官腔内的体积会导致柔韧性类器官的机械拉伸。在一些实施例中，以阶跃函数(被动拉伸)或S形函数(循环拉伸)形式施加拉伸。在许多类器官类型中，机械拉伸被认为是机械转导信号。在一些实施例中，机械刺激和电刺激的组合为治疗筛选提供了更稳健的反应。
流体交换系统自动进行常规培养基更换，调节腔内压力，在筛选过程中对治疗剂进行灌注并在类器官之间交换培养基(图11和12)。流体系统由一系列微流体泵、由数字输出板控制的三通阀和培养基储集器组成。更改阀配置会改变培养基的行进方向。在一些实施例中，可以将流体添加到中空的竖直安装轴中或从中去除，该轴连接有类器官，从而调节静水压力。压力传感器95和信号调节器(例如OPP-M和LifeSens)感测类器官内的平均压力，并通过Lab VIEW与泵通信以调节所需的腔内压力。另外，流体交换系统用于将化合物混合和灌注至类器官。从添加剂箱中泵吸出溶液，并与循环培养基混合。然后该化合物灌注到类器官盒20中并通过类器官1，类似于经由人类血流的药物递送。在一些实施例中，泵和阀的流体系统连接类器官模块10内的至少两个类器官盒20，以允许在类器官1之间或当中进行培养基和/或治疗剂的交换。另外，在一些实施例中，类器官盒20之间的流体交换系统由类器官1形式的生物泵(例如心脏类器官1)提供动力。
实例7
生物反应器控件。自定义LabVIEW代码自动执行该过程的很大一部分，包括硬件和软件。每个类器官模块10通过一台由LabVIEW驱动的计算机(即数据处理器5)进行离散控制。有关示例性软件流程图，参见图16。因此，在或可以在不同条件下同时监测多个类器官1和多个类器官模块10(图14)。LabVIEW代码控制相关的硬件，例如数据采集装置、多通道数字输出源、阀、泵和照相机捕获卡。因此，该代码以电子方式控制生物反应器平台或系统的多种功能，例如自动药物灌注和混合、腔内压力控制、电刺激、C02和温度控制以及具有同步图像捕获功能的压力传导。该计算机配备有足够的内存和存储空间来连续捕获数据(例如，足以进行至少24小时的连续数据收集)。图像采集与生物反应器的其他采集模式(例如类器官内压力测量)同步，以实现临床上相关的终点测量(例如压力-体积环)。LabVIEW代码中的几种分析功能可以增强和简化生物反应器的用户功能。阈值数字图像的粒子分析例如通过角锥镜13量化多个离散类器官1的实时体积，其可用于实时计算相关类器官1的收缩特征。这些功能与或可以与电刺激器的控制组合，用于自动最大捕获频率分析和相关的电生理测试方案。例如，对于心脏类器官1，LabVIEW代码通过向心脏类器官1发送0.5Hz的双相电刺激脉冲开始，并监测该类器官1是否捕获了当前频率。该代码会自动增加电刺激的速率，直到丢失1:1捕获为止，此时心脏类器官1的跳动频率不再与刺激速率匹配。记录日期、药物干预时间、电起搏方案以及所探测到的每个类器官1的其他信息都保存为元数据，以用于存档和质量控制目的。
实例8
数据捕获。同时记录来自生物反应器的压力和体积数据，以在相关的收缩类器官中生成压力-体积曲线。高速数字照相机(Allied Vision)获取高达100帧/秒的图像。通过假设具有相同横截面积的等效球体来估算类器官体积。单次采集通常包含多次收缩。为了表征类器官的平均收缩特征，MATLAB代码首先将曲线分成离散的收缩。然后将每次收缩的数据对齐并取平均值(图15A)。然后可以将平均压力曲线和平均体积曲线绘制为平均P-V环(图15B)。
分析记录的高速明场视频(例如光流)以表征收缩类器官的运动模式。分析收缩概况的变化以确认对类器官收缩性能的治疗作用。为了处理大量的多维数据采集，机器学习算法确定与治疗反应相关的关键参数，并最终将未知的治疗剂分类为感兴趣的类别。此外，机器学习可以与长期数据采集同时执行，以鉴定罕见的异常事件并最小化数据存储。例如，长期数据采集可以分为一系列连续的采集。随着进一步的采集继续，已完成的采集被发送到缓冲区进行分析。机器学习(例如二进制支持向量机)会根据缓冲区内的数据评估功能中的任何异常，例如罕见的异常事件。如果检测到异常，则将相关数据永久存储，而将正常功能数据丢弃。
实例9
类器官模块。在本文公开的生物反应器的一些实施例中，外壳(约25x25x15 cm)由可灭菌材料与检测/记录装置2(例如照相机)和温度控制元件4(例如加热单元)制成，附接到类器官模块10的顶部。在一些实施例中，例如加热器形式的温度控制元件4被放置在外壳内。竖直照相机聚焦到四边形的45度角锥镜13上，其将一个或多个类器官1的侧面轮廓向上反射到照相机。倾斜的LED灯12均匀地照亮每个类器官1的侧面轮廓。接入门允许将可更换的类器官盒20简单地***到类器官模块10中以进行监测，然后取出进行其他实验分析(例如光学标测)。在对类器官1进行治疗性给药后，使用微型磁力搅拌器(例如ThermoSciMicro Stirrer)形式的混合器19混合培养基93，该混合器可以使用软件控制来打开和关闭。使用包括恒温器、加热器和风扇(例如IncuKit Mini)的温度控制元件4对每个类器官模块10进行温度控制。为了细胞培养缓冲，C02水平也单独控制在5％。平台的C02控制系统包含连接至压力调节器的单箱，该箱在连接至每个类器官模块10之前先连接至电磁阀歧管(例如Takasago CTV-2-4MIC)，最后又连接至流量计(Dwyer微型主流量计)。每个阀通过多通道数字输出模块(例如NI-9472)进行单独控制。外壳内的C02传感器(例如SprintIR)测量C02水平并控制阀在打开和关闭状态之间切换。考虑并入其他传感器(例如02传感器)以进一步控制封闭环境内的特定分压。
由于微组织缺少较大器官的关键特征(例如较厚组织的扩散限制)，因此它们不是模拟人体器官反应的理想选择。允许在多个宏观类器官之间进行流体交换的生物反应器概括了人体的关键生理和药理特征。在简化的人体仿生模型中测量多个功能特性的能力为弥合传统细胞培养系统、体内动物模型和临床试验之间的长期差距提供了新途径。结合诱导的hPSC的体细胞重编程，“罐中人体”系统有望成为下一代药物发现、心脏毒性筛选、疾病模型化以及其他种族、性别和患者特异性应用的通用平台。
参考文献
1.Weng,Z.,et al.,A simple,cost-effective but highly efficient systemfor deriving ventricular cardiomyocytes from human pluripotent stemcells.Stem Cells Dev,2014.23(14):p.1704-16.
2.Serrao,G.W.,et al.,Myocyte-depleted engineered cardiac tissuessupport therapeutic potential of mesenchymal stem cells.Tissue Eng Part A,2012.18(13-14):p.1322-33.
3.Mannhardt,L,et al.,Blinded Contractility Analysis in hiPSC-Cardiomyocytes in Engineered Heart Tissue Format:Comparison With Human AtrialTrabeculae.Toxicol Sci,2017.158(1):p.164-175.
4.Mannhardt,L,et al.,Human Engineered Heart Tissue:Analysis ofContractile Force.Stem Cell Reports,2016.7(1):p.29-42.
5.Brinkschulte,M.,et al.,Plasma protein binding ofperazine andamitriptyline in psychiatric patients.Eur J Clin Pharmacol,1982.22(4):p.367-73.
6.Heard,K.,et al.,Tricyclic antidepressants directly depress humanmyocardial mechanical function independent of effects on the conductionsystem.Acad Emerg Med,2001.8(12):p.1122-7.
7.Ronnevik,P.K.,et al.,Increased occurrence of exercise-inducedsilent ischemia after treatment with aspirin in patients admitted forsuspected acute myocardial infarction.Int J Cardiol,1991.33(3):p.413-7.
8.Piroddi,N.,et al.,Tension generation and relaxation in singlemyofibrils from human atrial and ventricular myocardium.Pflugers Arch,2007.454(1):p.63-73.
9.Rasmussen,C.A.,Jr.,J.L.Sutko,and W.H.Barry,Effects of ryanodine andcaffeine on contractility,membrane voltage,and calcium exchange in culturedheart cells.Circ Res,1987.60(4):p.495-504.
10.Hansen,P.B.,et al.,Influence of atenolol and nifedipine ondigoxin-induced inotropism in humans.Br J Clin Pharmacol,1984.18(6):p.817-22.
11.Sugiyama,A.,et al.,Negative chronotropic and inotropic effects ofclass I antiarrhythmic drugs assessed in isolated canine blood-perfusedsinoatrial node and papillary muscle preparations.Heart Vessels,1999.14(2):p.96-103.
12.Ahonen,J.,et al.,Pharmacokinetic-pharmacodynamic relationship ofdobutamine and heart rate,stroke volume and cardiac output in healthyvolunteers.Clin Drug Investig,2008.28(2):p.121-7.
13.Usta,C.,et al.,Comparision of the inotropic effects oflevosimendan,rolipram,and dobutamine on human atrial trabeculae.J CardiovascPharmacol,2004.44(5):p.622-5.
14.Zhao,H.,et al.,Effects of dopamine on L-type Ca2+current in singleatrial and ventricular myocytes of the rat.Br J Pharmacol,1997.121(7):p.1247-54.
15.Holtzman,J.L.,et al.,The pharmacodynamic and pharmacokineticinteraction between single doses of flecainide acetate and verapamil:effectson cardiac function and drug clearance.Clin Pharmacol Ther,1989.46(1):p.26-32.
16.Johnston,A.,S.Warrington,and P.Turner,Flecainide pharmacokineticsin healthy volunteers:the influence of urinary pH.Br J Clin Pharmacol,1985.20(4):p.333-8.
17.Rothschild,M.A.,A.H.Rothschild,andM.A.Pfeifer,The inotropic actionof tolbutamide and glyburide.Clin Pharmacol Ther,1989.45(6):p.642-9.
18.Hasenfuss,G.,et a.,Influence of isoproterenol on contractileprotein function,excitation-contraction coupling,and energy turnover ofisolated nonfailing human myocardium.JMol Cell Cardiol,1994.26(11):p.1461-9.
19.Sheu,S.S.and W.J.Lederer,Lidocaine's negative inotropic andantiarrhythmic actions.Dependence on shortening of action potential durationand reduction of intracellular sodium activity.Circ Res,1985.57(4):p.578-90.
20.Nicolosi,G.L.,et a.,The prognostic value of predischargequantitative two-dimensional echocardiographic measurements and the effectsof early lisinopril treatment on left ventricular structure and functionafter acute myocardial infarction in the GISSI-3 Trial.Gruppo Italiano per loStudio della Sopravvivenza nell'Infarto Miocardico.Eur Heart J,1996.17(11):p.1646-56.
21.Sarsero,D.,et al.,Human vascular to cardiac tissue selectivity ofL-and T-type calcium channel antagonists.Br J Pharmacol,1998.125(1):p.109-19.
22.Baruch,L.,et al.,Pharmacodynamic effects of milrinone with andwithout a bolus loading infusion.Am Heart J,2001.141(2):p.266-73.
23.Rumiantsev,D.O.,etal.,Serum binding of nifedipine and verapamilinpatients with ischaemic heart disease on monotherapy.Br J Clin Pharmacol,1989.28(3):p.357-61.
24.Leenen,F.H.,et al.,Epinephrine and left ventricular function inhumans:effects of beta-l vs nonselective beta-blockade.Clin Pharmacol Ther,1988.43(5):p.519-28.
25.Kool,M.,et al.,Does lowering of cholesterol levels influencefunctional properties of large arteries？Eur J Clin Pharmacol,1995.48(3-4):p.217-23.
26.Ochs,H.R.,et al.,Single and multiple dose pharmacokinetics of oralquinidine sulfate and gluconate.Am J Cardiol,1978.41(4):p.770-7.
27.Johnson,D.B.,et al.,Angiotensin-converting enzyme inhibitortherapy affects left ventricular mass inpatients with ejection fraction>40％after acute myocardial infarction.J Am Coll Cardiol,1997.29(1):p.49-54.
28.Turnbull,I.C.,et al.,Advancing functional engineered cardiactissues toward a preclinical model of human myocardium.FASEB J,2014.28(2):p.644-54.
29.Lee,E.J.,et al.Engineered cardiac organoid chambers:toward afunctional biological model ventricle.Tissue Eng Part A.2008；14:215-25.
从引用的上下文中显而易见的是，在此引用的每个参考文献都以全文或相关部分引用的方式并入本文中。
应理解，尽管所要求保护的主题已经结合其详细描述加以描述，但是前面的描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围限定的所要求保护的主题的范围。其他方面、优点和修改在所公开主题的精神和范围内。