阅读说明：本技术 桦木醇衍生物及其亲水性修饰产物，纳米溶液及其制备方法 (Betulin derivative and hydrophilic modification product thereof, nano solution and preparation method thereof ) 是由 朱水芳 田志清 王晨光 姜帆 于 2020-04-17 设计创作，主要内容包括：本发明“桦木醇衍生物及其亲水性修饰产物,纳米溶液及其制备方法”,特征在于,是桦木醇或其衍生物在其3位羟基与苯甲酸衍生物中的羧基发生酯化反应的产物；将所述亲水性修饰产物分散于水中,并加入氢氧化金属盐,在25-90℃条件下搅拌30-300分钟,自然冷却至室温,使化合物形成羧基金属盐；加入反应体系体积的0.1％-10％的表面活性剂,使用超声波处理0-60min,即得桦木醇及其衍生物的亲水性修饰产物的纳米胶体水溶液,其分散性好,粒径范围理想,易于被生物体吸收。(The invention relates to a betulin derivative and its hydrophilic modification product, nanometer solution and its preparation method, characterized by, it is the product that its 3-position hydroxyl and carboxyl in the benzoic acid derivative take esterification reaction in betulin or its derivative; dispersing the hydrophilic modification product in water, adding metal hydroxide salt, stirring at 25-90 ℃ for 30-300 minutes, and naturally cooling to room temperature to enable the compound to form carboxyl metal salt; adding surfactant 0.1-10% of the volume of the reaction system, and treating with ultrasonic for 0-60min to obtain nanometer colloid water solution of hydrophilic modification product of betulin and its derivatives, which has good dispersibility, ideal particle size range, and easy absorption by organism.)

桦木醇衍生物及其亲水性修饰产物，纳米溶液及其制备方法

技术领域

本发明涉及化学制药方法，特别是一种桦木醇衍生物及其亲水性修饰产物，纳米溶液及制备方法。

背景技术

桦木醇(如式1)，又称白桦酯醇、桦木脑、白桦脂醇，是一种丰富的天然存在的三萜烯，广泛存在于桦木、石榴树皮和叶、酸枣仁、天门冬等植物中。它具有抗病毒、消炎、抑制头发纤维中蛋白质溶解、促进头发生长、改善受损头发光泽等活性。

然而，由于分子中五环三萜结构的存在，桦木醇的水溶性普遍较差，因此生物体吸收困难，影响其生物活性发挥，因而其应用受到限制。

发明内容

基于上述领域的需求，本发明提供了一种亲水性良好，易于制成纳米溶液的桦木醇衍生物及其亲水化修饰物及制备方法：。

本发明请求保护的技术方案如下：

如式3至7所示的桦木醇衍生物：

其中R选自C1-6烷基、芳基、杂芳基、芳基-C1-2烷基、杂芳基-C1-2烷基、C3-10环烷基、C3-10环烷基-C1-2烷基、乙炔基、氨基或乙烯基，其各自任选地被1-3个R_a基团取代；并且每个R_a基团独立地为卤素、C1-6烷基、氟取代的C1-6烷基、氟取代的C1-6烷氧基、芳基、杂芳基、C1-6烷氧基、-CN、-NO₂、-OH、＝O、NH₂、-C(O)-O-C1-6烷基或-SiMe3，其中 R_a的脂族部分或芳族部分进一步任选地被1-3个R_b基团取代，其中每个R_b基团独立地为卤素、 C1-6烷基、C1-6烷氧基、-CN、-NO₂或–OH；

所述苯甲酸衍生物选自：邻位苯二甲酸，间位苯二甲酸，对位苯二甲酸，邻苯二甲酸酐， 1,2,4-苯三甲酸，1,3,5-苯三甲酸，苯四甲酸，均苯四甲酸酐，苯五甲酸，苯六甲酸，苯六甲酸酐。

优选地，其中R为或苯基；

式3所示桦木醇衍生物的结构如式3a，

式4所示桦木醇衍生物如式4a，

式7示桦木醇衍生物如式7a,

式3a所示桦木醇衍生物的合成方法，其特征在于，

向烧瓶中加入二氯甲烷和桦木酸，待桦木酸溶解后加入将2-溴乙基甲基醚和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，室温条件下搅拌反应2天后,以甲苯为展开剂通过硅胶柱色谱分离得到产物如式3a。

式4a所示桦木醇衍生物的合成方法，其特征在于，

向烧瓶中加入二氯甲烷和桦木酸，待桦木酸溶解后加入将2-甲氧基乙胺和4-二甲氨基吡啶，40℃条件下搅拌反应8-12h后,以甲苯为展开剂通过硅胶柱色谱分离得到产物如式4a。

式5所示桦木醇衍生物的合成方法，其特征在于，

在反应瓶中，将白桦醇溶于二氯甲烷中，加入三氟甲烷磺酸铋(Bi(OTf)₃)，50℃回流反应4小时；反应结束后，冷却，饱和碳酸氢钠洗3次，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发后得产物如式5所示；

式6所示桦木醇衍生物的合成方法，其特征在于：

向烧瓶中加入二氯甲烷，接着加入桦木酸和三氟甲磺酸铋，加热回流，搅拌2h；将反应体系降至室温后，加入饱和碳酸氢钠溶液洗涤，使用无水硫酸钠干燥有机相；之后过滤和减压蒸馏，以体积比1：4的石油醚二氯甲烷混合液为展开剂通过硅胶柱色谱分离得到产物。

式7所示桦木醇衍生物的合成方法，其特征在于：向烧瓶中加入吡啶和桦木醇，待桦木酸溶解后加入苯甲酸酐和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，60℃条件下搅拌反应2-4h后，分别用水和二氯甲烷洗涤，得到产物如7a。

一种桦木醇及其衍生物的亲水性修饰产物，其特征在于，是桦木醇或及其衍生物在其分子的3位羟基上与苯甲酸衍生物分子中的一个羧基发生酯化反应所得的产物；

所述桦木醇衍生物选自式2至式7所示化合物：

本发明所得上述亲水性修饰产物在分子内兼具亲水性基团和疏水性基团，具有良好的分散性，

有利于制备成分散性良好、抗病毒生物活性更高的液体制剂。

优选地，所述苯甲酸衍生物为邻苯二甲酸酐，

式5的亲水修饰产物如式8所示，

式3a的亲水性修饰产物如式9所示，

式4a的亲水性修饰产物如式10所示，

式7a的亲水性修饰产物如式11所示，

所述苯甲酸衍生物为苯四甲酸二酐，式V的修饰产物如式12所示，

上述桦木醇衍生物和/或其亲水性修饰产物在制备抗病毒药剂中的用途，其特征在于，将上述桦木醇衍生物和/或其亲水性修饰产物作为抗病毒药剂的活性成分。

优选将桦木醇衍生物的亲水性修饰产物作为所述抗病毒药剂的活性成分，所述药剂的剂型为粒径在150-400nm的纳米溶液。

一种制备抗病毒药剂的方法，其特征在于，将上述桦木醇衍生物的亲水性修饰产物作为抗病毒药剂的活性成分，通过以下步骤制成纳米溶液：

将上述桦木醇衍生物的亲水性修饰产物分散于水中，并加入1-10倍当量的氢氧化金属盐，在30-90℃条件下搅拌30-300分钟，自然冷却至室温，加入反应体系体积的0.1％-10％的表面活性剂，使用超声波处理0-60min，即得纳米胶体水溶液，

所述表面活性剂选自：聚乙二醇、烷基葡糖苷，脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦，聚山梨酯、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠和卵磷脂。

优选，所述氢氧化金属盐指氢氧化钠或氢氧化钾。

基于本发明设计和合成的亲水性修饰的桦木醇或其衍生物，由于在其分子内同时兼具亲水基团和疏水基团，因此，不需要加入复杂的高分子助剂，只需要加入氢氧化金属盐和表面活性剂，经过简单的超声或搅拌处理即可得到粒径范围理想、分散性良好、抗病毒活性显著改善的抗病毒溶液。

本发明的再一方面，提供一种桦木醇及其衍生物的亲水性修饰方法，其特征在于，使桦木醇或其衍生物在其3位羟基上与苯甲酸衍生物中的羧基发生酯化反应；

所述桦木醇衍生物选自式2-7所示化合物。

优选地，所述酯化反应的条件为：

将桦木醇或其衍生物与苯甲酸衍生物溶于溶剂中,催化剂存在下，40-130℃回流反应 8-12小时，反应结束后，进行回收和纯化得到亲水性修饰产物。

优选地，所述溶剂为吡啶和/或二氯甲烷；

所述催化剂为：二环己基碳二亚胺，N,N'-二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐，1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯，N,N-二异丙基乙胺，4-二甲氨基吡啶。

优选地，桦木醇或其衍生物与苯甲酸衍生物的摩尔比为1:1；桦木醇或其衍生物的质量与所述溶剂的体积比例为2.5-6.8g:120-220ml；桦木醇或其衍生物与所述催化剂的摩尔比为 1:1-1:5。

在一些实施方案中，所述桦木醇衍生物为式5所示的化合物，所述苯甲酸衍生物为邻苯二甲酸酐，所述酯化反应条件如下：

将式5所示的化合物，4-二甲氨基吡啶和邻苯二甲酸酐溶于吡啶中，于100-140℃回流反应8-12小时，进行回收和纯化得到式8所示化合物，反应式如下：

优选地，所述反应原料的质量之和与吡啶的体积比例为5-6.8g：120-180ml；且式5所示的化合物与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1-1：5；

优选地，反应原料的质量之和与溶剂吡啶的体积比例为5.35g：150ml；

优选地，所述回收和纯化步骤如下：

反应结束后，冷却后加入大量水，二氯甲烷萃取2-4次；10％盐酸洗2-4次，饱和食盐水洗1-3次，采用无水硫酸钠干燥；柱色谱分离得到式8所示化合物。

在一些实施方案中，所述桦木醇衍生物为式5所示的化合物，所述苯甲酸衍生物为均苯四甲酸二酐，所述酯化反应条件如下：

将式5所示的化合物溶于二氯甲烷中，加入均苯四甲酸二酐和N,N-二异丙基乙胺，40-60℃回流反应8-12小时，进行回收和纯化得到式12所示化合物，反应式如下：

反应原料式5所示的化合物与均苯四甲酸二酐的摩尔比为1:1，反应原料的质量之和与溶剂二氯甲烷的体积比例为2.5-3.5g：180～220ml；且式5所示的化合物与N,N-二异丙基乙胺的质量体积比为1.8-2.2g:1.4-18ml；

优选地，反应原料的质量之和与溶剂二氯甲烷的体积比例为2.99g：200ml；且式5所示的化合物与N,N-二异丙基乙胺的质量体积比为2g：1.6ml。

优选地，所述回收和纯化步骤如下：

将回流回收物加入到与所述二氯甲烷等体积的1mol/L稀盐酸中，搅拌至出现浑浊的沉淀，抽滤，水洗；将滤饼溶入所述二氯甲烷一半体积的醋酸溶液，加热到80-120℃后加与所述二氯甲烷等体积的水，冷却，抽滤，分别使用50％醋酸水溶液、甲醇、二氯甲烷洗涤，干燥得到式12所示化合物。

实验数据显示，本发明获得的修饰产物在水溶性、分散性性能上获得极大改善，抗病毒效果显著提高。

附图说明

图1.示例性地显示：本发明所得修饰产物(式8所示化合物)的纳米溶液的激光纳米粒度仪测试结果；

图2.示例性地显示：本发明所得修饰产物(式12所示化合物)的纳米溶液的激光纳米粒度仪测试结果。

具体实施方式

以下仅为示例性实施方案，不作为对本发明的限制。根据本发明全文的记载，结合以下实施例，本领域技术人员能够获得本发明要求保护的范围内的其它实施方案。

实验试剂：

式1所示的桦木醇，购买自“阿拉丁”；

式2为桦木酸，购自“阿拉丁”；

其它化学试剂如无特殊说明，均可商购获得。

实施例1.式3-7所示桦木醇衍生物的制备

(1)式3的示例性衍生物，如式3a，

R基团为3a结构式为

合成步骤如下：

向50ml烧瓶中加入二氯甲烷(CH₂Cl₂，10ml)和桦木酸(90mg，0.2mmol)，待桦木酸溶解后加入将2-溴乙基甲基醚(0.2ml,2.0mmol)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(0.4mmol)。

室温条件下搅拌反应2天后,以甲苯为展开剂通过硅胶柱色谱分离得到产物，产率为70％。

核磁氢谱检测结果：1H NMR(CDCl₃，δppm)：0.76(3H,s),0.84(3H,s),0.87(3H,s),0.91(3H,s),0.95(3H,s),0.97(3H,s),1.03(3H,s),3.20(1H,dd),3.38(3H,s), 3.60(2H,t),3.93(1H,s)，4.40(2H,ddt),4.60(1H,s)4.75(1H,d)。m/z＝515.4(M+H)⁺。

(2)式4的示例性衍生物，如式4a

R基团为

4a结构式为：

向50ml烧瓶中加入二氯甲烷(CH₂Cl₂，10ml)和桦木酸(90mg，0.2mmol)，待桦木酸溶解后加入将2-甲氧基乙胺(0.04ml,0.4mmol)和4-二甲氨基吡啶(48mg，0.4mmol)； 40℃条件下搅拌反应12h后,以甲苯为展开剂通过硅胶柱色谱分离得到产物，产率为90％。

核磁氢谱：

1H NMR(CDCl₃，δppm)：0.76(3H,s),0.84(3H,s),0.87(3H,s),0.91(3H,s), 0.95(3H,s),0.97(3H,s),1.03(3H,s),3.20(1H,dd),3.38(3H,s),3.42(2H,t),3.93 (1H,s)，4.40(2H,ddt),4.60(1H,s),4.75(1H,d)。m/z＝514.4(M+H)⁺。

(3)式5所示衍生物的合成

合成步骤：

取500mL的反应瓶，将5g白桦醇溶于300mL二氯甲烷中，加入三氟甲烷磺酸铋(Bi(OTf)₃) 200mg，50℃回流反应4小时；

反应结束后，冷却，饱和碳酸氢钠洗3次，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸钠干燥，旋蒸得式5所示粗品，反应式如下：

核磁氢谱检测：(设备Bruker 400MHz；溶剂CDCl₃；Me₄Si)0.76(3H,s),0.80(3H,s),0.85(3H,s),0.91(3H,s),0.93(3H,s),0.97(6H,s),3.20(1H),3.44(1 H,d),3.53(1H,s),3.78(1H,dd)；m/z 442(M+H)⁺(安捷伦6520)

(4)式6所示衍生物的合成

合成方法如下：

向50ml烧瓶中加入二氯甲烷(CH₂Cl₂，10ml)，接着加入桦木酸(45.6mg，0.10mmol)和三氟甲磺酸铋(3.28mg，0.005mmol)。

加热回流，搅拌2h，将反应体系降至室温后，加入20ml饱和碳酸氢钠溶液洗涤，使用无水硫酸钠干燥有机相。之后过滤和减压蒸馏，以石油醚(40-60℃)：二氯甲烷＝1∶4(体积比)为展开剂通过硅胶柱色谱分离得到产物。m/z＝457.6(M+H)+。1H NMR(CDCl₃，δppm)：0.76(3H,s),0.84(3H,s),0.87(3H,s),0.91(3H,s),0.95(3H,s),0.97(3H,s), 1.03(3H,s),3.20(1H,dd),3.93(1H,s).

(5)式7所示示例性衍生物7a的合成

R基团为苯基，7a结构式为

向50ml烧瓶中加入吡啶(10ml)和桦木醇(90mg，0.2mmol)，待桦木酸溶解后加入苯甲酸酐(0.43mL,2.26mmol)和DMAP(0.138g,1.13mmol)。60℃条件下搅拌反应3h 后，分别用水和二氯甲烷洗涤，得到产物，产量为90％。

产物检测：1H NMR(CDCl₃，δppm)：0.76(3H,s),0.84(3H,s),0.87(3H,s),0.91(3H,s),0.95(3H,s),0.97(3H,s),1.03(3H,s),3.20(1H,dd),3.38(3H,s),3.60(2H, t),3.93(1H,s)，4.40(2H,ddt),4.60(1H,s),4.75(1H,d),7.49-7.43(2H,m),7.60 -7.55(1H,m),8.09-8.05(2H,m)。m/z＝547.4(M+H)⁺。

实施例2.桦木醇衍生物的亲水化修饰示例

酯化反应:取500mL的反应瓶，将2g式5所示粗品、4-二甲氨基吡啶(1.4g)和邻苯二甲酸酐(3.35g)溶于150mL吡啶中，120℃回流反应10小时，

反应式如下：

回收纯化：反应结束后，冷却，加入大量水，二氯甲烷萃取三次；10％盐酸洗三次，饱和食盐水洗两次，无水硫酸钠干燥，柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝40:1)，得到化合物如式 8所示，根据产物摩尔量与起始桦木醇摩尔量比，产率85％。

核磁氢谱(设备Bruker 400MHz；溶剂CDCl₃；Me₄Si)0.76(3H,s),0.84(3H,s),0.85(3H,s),0.91(3H,s),0.95(3H,s),0.97(6H,s),3.20(1H),3.44(1H,d), 3.53(1H,s),3.78(1H,dd),7.49–7.61(2H,m),7.65–7.74(1H,m),7.83–7.93 (1H,m).m/z＝589.4(M+H)⁺。

实施例3桦木醇衍生物的亲水化修饰产物示例

酯化反应：取500mL的反应瓶，将2g式5所示粗品(4.52mmol)溶于200mL二氯甲烷中，加入0.99g均苯四甲酸二酐(4.52mmol)和1.6mL N,N-二异丙基乙胺，50℃回流反应8小时。

反应式如下：

回收纯化：回流回收物加入到200mL 1mol/L的稀盐酸中，搅拌至出现浑浊的沉淀，抽滤，水洗。将滤饼溶入100mL的醋酸溶液，加热到100℃，加入水200mL。

冷却，抽滤，分别使用50％醋酸水溶液、甲醇、二氯甲烷洗涤，干燥，得化合物12，，根据产物摩尔量与起始桦木醇摩尔量比，产率为85％。

核磁氢谱(设备Bruker 400MHz；溶剂CDCl3；Me4Si)0.76(3H,s),0.84(3H,s),0.85(3H,s),0.91(3H,s),0.95(3H,s),0.97(6H,s),3.32(1H),3.44(1H,d), 3.65(1H,s),4.66(1H,dd),7.49–7.61(2H,m),7.88(1H,s),7.98(1H,s).m/z ＝678.4(M+H)⁺。

实施例4.桦木醇及其衍生物的亲水修饰产物的纳米溶液的制备示例

纳米溶液制备步骤：准确称取亲水性修饰产物，如式化合物8所示的化合物20mg，KOH 60mg，加入圆底烧瓶，再准确加入纯水10ml，55℃度条件下加热搅拌1h，冷却至室温后，转入至密封瓶，并加入2ml司盘，超声15min，得到透明澄清的溶液，使用激光纳米粒度仪测试，如图1所示，粒径范围为360nm左右，即得到桦木醇衍生物(式8)的纳米溶液，其分散性非常好；

对照：式5所示的衍生物(未经亲水化修饰)，经过纳米溶液制备步骤处理后，无法形成透明澄清的纳米溶液，而是生成白色沉淀。

实施例5.桦木醇及其衍生物的亲水修饰产物的纳米溶液的制备示例

纳米溶液制备步骤：准确称取亲水性修饰产物，如式化合物12所示的化合物20mg，KOH 20mg，加入圆底烧瓶，再准确加入纯水10ml，55℃度条件下加热搅拌1h，冷却至室温后，转入至密封瓶，并加入2ml司盘，超声15min，得到透明澄清的溶液，使用激光纳米粒度仪测试粒径范围为230nm左右，如图2所示，即得到桦木醇衍生物9的纳米溶液。

对照：式5所示的衍生物，经过纳米溶液制备步骤的处理后，无法形成透明澄清的纳米溶液，而是生成白色沉淀。

式3，4，7所示化合物经本发明方法所得的亲水性修饰产物式9，10，11化合物，经过上述纳米溶液制备步骤得到澄清透明的纳米溶液，粒径测试显示在150-400nm之间；

未经修饰的式3，4，7所示化合物作为对照，经纳米溶液制备步骤处理后，仅仅得到白色沉淀。

实施例6.桦木醇衍生物金属盐的制备

准确称取亲水性修饰产物，如式化合物12所示的化合物6.5g，KOH 1.3g，加入圆底烧瓶，再准确加入纯水100ml，95℃搅拌1.5h后，冷却至室温。

向体系加入500ml酒精搅拌后静置析出白色沉淀，过滤干燥得到化合物12的钾盐，标记为12-K。

实施例7.桦木醇衍生物浓缩制剂的制备

为了方便运输和使用，桦木醇衍生物可制备成浓缩的水剂，使用时用水稀释搅拌后即可形成纳米溶液。制备方法为：

准确称取亲水性修饰产物，如实施例6中所得式化合物9-K 1.5g，加入圆底烧瓶，再加入纯水100ml，55℃度条件下加热搅拌1h，冷却至室温后，转入至密封瓶，并加入2ml吐温，得到乳白色的溶液，即为浓缩纳米制剂。

使用时，将浓缩纳米制剂缓慢加入100-500体积的水中，加入时不断搅拌，即得透明澄清的纳米溶液。

此纳米溶液的形成无需大量助剂和专门设备，方便在各种场合和各种人群使用。

实验例.水溶性改善对化合物抗病毒活性的影响示例

选4-5叶期，长势相近的本氏烟，用30mL双蒸水充分研磨症状明显的0.15g新鲜病叶， 0.5％病毒接种液通过硅藻土摩擦接种，每株接种2片叶。

治疗组：

150ppm纳米溶液和非纳米溶液治疗组，300ppm纳米溶液和非纳米溶液治疗组：接种后 4天、11天，喷药。

预防组：

150ppm纳米溶液和非纳米溶液预防组，300ppm纳米溶液和非纳米溶液预防组：先用药剂对植株喷药，4天后接种病毒，7天后第二次喷药

每浓度处理组设20株。接种后第7、19、15计算防治效果，调查结果见表1-4：a.CMV病情分级标准:

0级—无症状。

1级—接种叶出现轻微症状。

2级—一至两片系统叶片明脉、变形。

3级—多数上部叶片花叶、萎黄或变形。

4级—全株叶片花叶、严重变形或坏死，病株矮化严重。

b.病情指数

病情指数＝[∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶片数×9)]×100％。

c.防治效果

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％表1式亲水化修饰产物9，10，11防治CMV效果统计结果

可以看出本发明提供的亲水修饰产物的防治效果显著高于桦木醇这些亲水修饰产物在防治TBSV上显示出相同相似结果。

表2式8所示化合物防治CMV效果统计结果

表3式12所示化合物防治CMV效果统计结果

a.TBSV病情分级标准:

0级—无症状。

1级—接种叶出现轻微症状。

2级—一至两片系统叶片明脉、变形。

3级—多数上部叶片变形或主侧脉坏死，病株矮化。

4级—全株植株严重变形或坏死。

b.病情指数

病情指数＝[∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶片数×9)]×100％。

c.防治效果

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％

表4式8所示化合物防治TBSV效果统计结果

表5式12所示化合物防治TBSV效果统计结果

表1至表5的示例性实验数据显示，本发明亲水性修饰桦木醇衍生物的亲水性修饰产物对病毒具有更强的抗病毒活性；

而且通过本发明所提供的纳米溶液制备工艺所得的纳米制剂，在同浓度下，表出现显著提高的细胞内抗病毒活性。