一种荧光染料及其制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种荧光染料及其制备方法和用途 (Fluorescent dye and preparation method and application thereof ) 是由 不公告发明人 于 2020-03-23 设计创作，主要内容包括：一种荧光染料及其制备方法和用途,所述荧光染料对粘度响应敏感并且特异,本底荧光低等优点,还可以作为荧光激活点亮型探针,用于蛋白、酶或核酸的荧光标记、定量或检测。(The fluorescent dye has the advantages of sensitivity and specificity to viscosity response, low background fluorescence and the like, and can be used as a fluorescence activation lightening type probe for fluorescence labeling, quantification or detection of protein, enzyme or nucleic acid.)
技术领域
本发明涉及荧光染料技术领域，具体涉及一种粘度响应性、本底荧光低的荧 光染料及其制备方法和用途。
背景技术
荧光蛋白的生色团主要为咪唑啉酮类染料，该类染料具有较好的生物相容性， 同时具有光稳定性好、荧光性质可调等优点。研究发现该类染料是一种分子转子， 其荧光性质随粘度变化而变化，当被光照激发后，自由状态下的分子转子通过激 发态分子内扭曲将激发态能量以非辐射的形式释放出来，当分子处于粘度较大或 者较刚性的环境中，激发态分子内扭曲被限制，激发态能量主要以辐射发光的形 式释放出来，表现出荧光增强的性质，因此，分子转子常常被用于检测微环境的 变化等。
目前，基于限制分子转子的分子内扭曲发光被用于粘度检测外，还被广泛应 用于荧光传感器的构建、蛋白的标记、核酸的标记等，如，DCVJ与BSA等蛋 白结合后，分子转子的激发态分子内扭曲被限制，激发态能量以辐射发光的形式 释放，表现为荧光激活，从而用于目标蛋白的检测、定量等；噻唑橙等染料与 DNA、RNA结合后分子构象被限制，从而荧光被点亮，从而用于DNA、RNA 的免洗型标记与检测；以DHBI为靶分子，通过SELEX进行筛选得到能够与其 特异性结合的适配体，构建了荧光适配体，克服了无天然荧光RNA的难题，使 构建荧光RNA成为可能；以孔雀绿等为靶分子，通过噬菌体展示技术得到了能 够与孔雀绿衍生物特异性结合并激活荧光的单链抗体，用于细胞膜蛋白的标记； BODIPY等分子转子与淀粉样蛋白、tua蛋白结合并点亮荧光，从而用于艾滋海 默病、帕金森等病症的研究等。
然而，完全由荧光蛋白生色团而来的咪唑啉酮类分子转子种类十分有限，通 过有机合成方法对其进行改造则极大地拓展了咪唑啉酮的光谱范围，同时能够对 其它方面的性质进行有效调节，如光稳定性、油水分配系数等。然而，目前由该 方法得到的分子转子普遍存在荧光本底高的缺点，从而造成检测信噪比较低，较 难适用于样本量少、成分复杂、及底物丰度较低的样品类检测与标记，因此，发 展一类本底荧光低的咪唑啉酮类分子转子十分必要，它能够进一步拓展该类分子 转子的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有粘度响应性、本底荧光低的荧光染料，该类 分子转子的粘度响应性表现为10-5mol条件下，甘油中的荧光强度与甲醇中的荧 光强度比大于10。
本发明一方面，提供一种荧光染料，所述荧光染料如式(Ⅰ)所示：
其中：
Ar为亚芳基或亚杂芳基，Ar中的氢原子任选各自独立地被卤原子取代；D- 为HO-或N(X1)(X2)-，X1、X2各自独立地选自氢、烷基或改性烷基；X1，X2任 选相互连接，与N原子一起形成脂杂环；X1，X2任选独立地与Ar形成脂杂环；
Y为O或S；
R1为氢或烷基；
R2为卤原子、-OH或-CN；
其中：
所述“烷基”为C1-C10直链或支链烷基；可选地，为C1-C6直链或支链烷基； 可选地，为C1-C4直链或支链烷基；可选地，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基，1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基 丁基、异戊基、1-乙基丙基、新戊基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲 基戊基、异己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲 基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、2-甲基己基、 3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊 基、3-乙基戊基或2,2,3-三甲基丁基；
所述“改性烷基”各自独立地为C1-C16直链或支链烷基的任意碳原子被选自 卤原子、-OH、-CO-、-O-、-CN、-SO3H、伯氨基、仲氨基、叔氨基的一种或多 种基团置换所得的基团，或其中的碳碳单键任选独立地被碳碳双键或碳碳三键置 换；
所述的碳原子被置换，是指碳原子或碳原子与其上的氢原子一起被相应的基 团置换；
所述“卤原子”各自独立地为F、Cl、Br或I；
所述“脂杂环”为环上含有N、O、S或Si中的一种或多种杂原子的饱和或 不饱和的4～15元单环或多环脂杂环，所述脂杂环上含有S原子时，其为-S-、-SO- 或-SO2-；所述脂杂环任选被卤原子、烷基、芳基或改性烷基取代；
所述“亚芳基”各自独立地为5～13元(可选为6元或10元)单环或双环或稠 合双环或稠合多环的亚芳香基团；
所述“亚杂芳基”各自独立地为环上含有选自N、O、S或Si中的一种或多种 杂原子的5～13元(可选为6元或10元)单环或双环或稠合双环或稠合多环的亚 杂芳香基团；
所述“伯氨基”为R'NH2基团；
所述“仲氨基”为R'NHR”基团；
所述“叔氨基”为R'NR”R”'基团；
各个R'、R”、R”'各自独立地为单键、氢、烷基、亚烷基；
所述“亚烷基”为C1-C10的直链或支链的亚烷基；可选地，为C1-C7直链或支 链亚烷基；可选地，为C1-C5直链或支链亚烷基；
可选地，所述“改性烷基”为含有选自-OH、-O-、-NH2、乙二醇单元(-(CH2CH2O)n-)、-CN、-O-CO-、-NH-CO-、-SO2-O-、-SO-、Me2N-、Et2N-、 -CH＝CH-、-C≡CH、F、Cl、Br、I、氰基中的一种或多种基团；
可选地，Ar为选自下式(Ⅱ-1)～(Ⅱ-7)中的结构：
可选地，式(I)所示的化合物选自下式化合物：
本发明的第二个方面是提供制备上述的荧光染料的方法，其特征在于，包括 式(a)化合物与式(b)化合物发生羟醛缩合反应的步骤：
本发明的第三个方面是提供上述的荧光染料在粘度测试、蛋白荧光标记、核 酸荧光标记、蛋白定量或检测、或者核酸定量或检测中的用途，所述用途为非用 于疾病的诊断方法的用途。
本发明的第四个方面是提供上述的荧光染料在制备用于粘度测试、蛋白荧光 标记、核酸荧光标记、蛋白定量或检测、或者核酸定量或检测的试剂中的用途。
本发明的第五个方面是提供一种荧光激活点亮型探针，其包括上述荧光染料。
本发明的第六个方面是提供上述的荧光激活点亮型探针在蛋白荧光标记、核 酸荧光标记、蛋白定量或检测、或者核酸定量或检测中的用途，所述用途为非用 于疾病的诊断方法的用途。
本发明的第七个方面是提供上述的荧光激活点亮型探针在制备用于蛋白荧 光标记、核酸荧光标记、蛋白定量或检测、或者核酸定量或检测的试剂中的用途。
本发明所得荧光染料可用于测定样品的粘度，例如适用于微观粘度的测试。 根据另一方面的
具体实施方式
，所得荧光染料可与对应的抗体、适配体或淀粉样 蛋白等特异性结合，或者通过配体或抑制剂与蛋白标签或酶键合，获得系列荧光 激活点亮型探针，用于蛋白、酶或核酸的荧光标记、定量或监测。
附图说明
图1为分子转子IV-1(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图2为分子转子IV-2(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图3为分子转子IV-3(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图4为分子转子IV-4(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图5为分子转子IV-5(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图6为分子转子IV-6(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图7为分子转子IV-17(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图8为分子转子IV-18(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图9为分子转子IV-19(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图10为分子转子IV-20(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图11为分子转子IV-21(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图12为分子转子IV-22(1×10-5M)在不同粘度条件下荧光发射强度图；
图13为分子转子IV-39、IV-40、IV-44与IV-1、IV-2、IV-3、IV-4、IV-5、IV-6、 IV-7、IV-8(1×10-6M)在PBS中的荧光本底对比图；
图14为分子转子IV-41、IV-43与IV-17、IV-18、IV-19、IV-20、IV-21、IV-22 (1×10-6M)在PBS中的荧光本底对比图；
图15为分子转子IV-42与IV-36(1×10-6M)在PBS中的荧光本底对比图；
图16为分子转子IV-45、IV-46与IV-3(1×10-6M)在PBS中的荧光本底对 比图；
图17为分子转子IV-47、IV-48与IV-20(1×10-6M)在PBS中的荧光本底对 比图；
图18为分子转子IV-49、IV-50与IV-5(1×10-6M)在PBS中的荧光本底对 比图；
图19为分子转子IV-51与IV-1(1×10-6M)在PBS中的荧光本底对比图；
图20为分子转子IV-1、IV-2、IV-3、IV-4、IV-5、IV-6、IV-17、IV-18、IV-19、 IV-20、IV-21、IV-22用于细胞内RNA适配体的标记，其中A是表达了目标RNA 适配体的细胞，B是未表达目标RNA适配体的细胞。
图21为分子转子IV-21和IV-41标记mRNA的流式检测图。
具体实施方式：
实施例1：
化合物Ⅳ-1：
化合物1(0.504g,2mmol)、对氰基苯甲醛(0.626g,5mmol)于250ml 圆底烧瓶中，加入100ml四氢呋喃溶解，Ar保护条件下加入无水氯化锌(0.545 g,4mmol)，体系于80℃条件下油浴加热回流，TLC检测反应完毕，真空除去 溶剂，残余物经柱色谱分离得目标产物(0.292g，40％)。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ11.07(s,1H),8.10(d,J＝8.5Hz,2H),8.06(dd,J＝7.8,2.1Hz,2H), 8.03(s,1H),7.94(d,J＝8.3Hz,2H),7.44(d,J＝15.9Hz,1H),7.03(s,1H),3.29(s, 3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C20H13F2N3O2 365.0976；found 364.0902,[M-H]-.
实施例2：
化合物Ⅳ-2：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.475g，65％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.04(s,1H),8.49(d,J＝1.9Hz,1H),8.21(dt,J＝8.0,1.4Hz,1H),8.10-8.02(m, 2H),8.00(s,1H),7.88(dt,J＝7.7,1.4Hz,1H),7.67(t,J＝7.8Hz,1H),7.43(d,J＝ 16.0Hz,1H),7.01(s,1H),3.29(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C20H13F2N3O2 365.0976；found 364.0903,[M-H]-.
实施例3：
化合物Ⅳ-3：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.221g，31％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ10.94(s,1H),10.11(s,1H),8.07–8.01(m,2H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.74(d, J＝8.7Hz,2H),7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.90(s,1H),6.87–6.83(m,2H),3.26(s, 3H).MS(ESI):m/zCalcd.For C19H14F2N2O3 356.0972；found 355.0901,[M-H]-.
实施例4：
化合物Ⅳ-4：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.207g，29％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.70(s,1H),8.05(d,J＝8.9Hz,2H),7.98-7.89(m,1H),7.30(t,J＝6.2Hz,1H), 7.26(d,J＝8.9Hz,1H),7.15(d,J＝15.8Hz,1H),6.97(s,1H),6.87(d,J＝7.5Hz, 1H),3.27(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C19H14F2N2O3 356.0972；found 355.0900, [M-H]-.
实施例5：
化合物Ⅳ-5：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.186g，26％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ8.16(d,J＝8.5Hz,2H),7.99-7.86(m,3H),7.31(t,J＝8.9Hz,2H),7.18(d,J＝ 15.9Hz,1H),6.95(s,1H),6.83-6.72(m,2H),3.59(t,J＝5.9Hz,2H),3.51(t,J＝5.9 Hz,2H),3.27(s,3H),3.05(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C19H13F3N2O2 358.0929； found 357.0856,[M-H]-.
实施例6：
化合物Ⅳ-6：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.222g，31％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.02(s,1H),8.09-8.03(m,2H),8.01(d,J＝15.8Hz,1H),7.85(dt,J＝10.6,2.1 Hz,1H),7.72(d,J＝7.8Hz,1H),7.51(td,J＝8.0,6.1Hz,1H),7.34(d,J＝15.9Hz, 1H),7.28(td,J＝8.7,2.7Hz,1H),7.00(s,1H),3.28(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C19H13F3N2O2358.0929；found 357.0857,[M-H]-.
实施例7：
化合物2：
化合物Ⅳ-5(0.716g,2.0mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(0.450g,3.0mmol)、 咪唑(0.204g,3.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入50ml干燥二甲基甲酰胺 溶解，Ar保护条件下室温搅拌，TLC检测，反应完毕体系倒入150ml水中，二 氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，参与物 经柱色谱分离得化合物2(0.927g,98％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.16 (d,J＝8.5Hz,2H),7.99-7.86(m,3H),7.31(t,J＝8.9Hz,2H),7.18(d,J＝15.9Hz, 1H),6.95(s,1H),6.83-6.72(m,2H),3.59(t,J＝5.9Hz,2H),3.51(t,J＝5.9Hz,2H), 3.27(s,3H),3.05(s,3H),1.50(s,9H),0.2(s,6H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC25H28F3N2O2Si 473.2；found 473.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-7：
化合物2(0.473g,1mmol)、劳森试剂(0.808g,2mmol)于250ml三口 瓶中，加入100ml甲苯溶解，加入苯胺2滴，Ar保护条件下油浴加热回流，TLC 检测，反应完毕减压除去溶剂，残余物溶解于50ml二氯甲烷中，加入四丁基氟 化胺(0.313g,1.2mmol)，Ar保护条件下室温搅拌，TLC检测，反应完毕减压 除去溶剂，残余物经柱色谱分离得化合物Ⅳ-7(0.209g,56％)。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ8.17(d,J＝8.5Hz,2H),7.98-7.86(m,3H),7.31(t,J＝8.9Hz,2H), 7.18(d,J＝15.9Hz,1H),6.95(s,1H),6.83-6.72(m,2H),3.59(t,J＝5.9Hz,2H), 3.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.27(s,3H),3.05(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC19H13F3N2NaOS 397.0598；found 397.0597,[M+Na]+.
实施例8：
化合物3：
按照化合物2的合成步骤，(0.932g，99％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ8.10(d,J＝8.5Hz,2H),8.06(dd,J＝7.8,2.1Hz,2H),8.03(s,1H),7.94(d,J＝8.3 Hz,2H),7.44(d,J＝15.9Hz,1H),7.03(s,1H),3.29(s,3H),1.51(s,9H),0.29(s, 9H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC26H28F2N3O2Si 480.2；found 480.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-8：
按照化合物IV-7的合成步骤，(0.332g，49％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.00(s,1H),8.11(d,J＝8.5Hz,2H),8.07(dd,J＝7.8,2.1Hz,2H),8.04(s,1H), 7.94(d,J＝8.3Hz,2H),7.44(d,J＝15.9Hz,1H),7.03(s,1H),3.29(s, 3H).HMS(ESI):m/z Calcd.ForC20H13F2N3NaOS 404.0645；found 404.0646,[M+Na] +.
实施例9：
化合物5：
3-氟-4-羟基-苯甲醛(0.560g,4.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入40ml 无水乙醇溶解，加入10g无水硫酸钠、5ml 33％甲胺水溶液，Ar保护条件室温 搅拌24h，过滤，加压除去有机溶解，残余物溶解于10ml无水乙醇中，加入化 合物4(0.790g,5.0mmol)，Ar保护条件下室温搅拌过夜，次日过滤，冷乙醇 冲洗三次得化合物5(0.796g，85％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.52(s, 1H),8.19(m,1H),7.76(m,1H),6.99(t,J＝8.8Hz,1H),6.89(s,1H),3.09(s,3H), 2.34(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C12H10FN2O2 234.2；found 234.2,[M-H]-.
化合物Ⅳ-9：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.239g，21％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ10.52(s,1H),8.11(d,J＝8.5Hz,2H),8.07(d，J＝7.8Hz,2H),7.84(d,J＝8.0Hz, 1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.32(m,1H),6.99(t,J＝8.8Hz,1H),6.89(s,1H),6.78 (m,1H),2.34(s,3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C20H13FN3O2 346.0997；found 346.0998,[M-H]-.
实施例10：
化合物6：
按照化合物5的合成步骤，(0.812g，91％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ7.28(s,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),3.59(t,J＝5.6Hz,3H),3.12(s,3H),1.23(q, J＝5.6Hz,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C13H11ClFN2O2 281.0；found 281.0,[M-H]-.
化合物Ⅳ-10：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.239g，21％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ7.84(s,2H),7.28(s,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),3.12(s,3H),1.23(q,J＝5.6Hz, 3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C21H14ClFN3O2 395.0837；found394.0764, [M-H]-.
实施例11：
化合物7：
按照化合物5的合成步骤，(0.812g，91％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ7.28(s,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),3.81(s,3H),3.12(s,3H),3.12(s,3H), 1.58(m,1H),1.11(d,6H).MS(ESI):m/z Calcd.For C15H15BrFN2O2 353.0；found 3.0,[M-H]-.
化合物Ⅳ-11：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.209g，22％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ8.15(d,J＝8.8Hz,2H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.74(d,J＝8.7Hz,2H),7.28(s, 1H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.87–6.83(m,2H),3.12(s, 3H),1.58(m,1H),1.11(d,6H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C23H19BrFN3O2 467.0645；found 466.0572,[M-H]-.
实施例12：
化合物8：
按照化合物5的合成步骤，(0.812g，91％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H),6.95(s,1H),3.79(t,J＝5.2Hz,2H),3.35(s, 3H),2.39(t,J＝4.8Hz,2H),1.40(m,2H),1.20(t,J＝4.8Hz,3H).MS(ESI):m/z Calcd. For C14H214FIN2O2388.0；found 388.0,[M-H]-.
化合物Ⅳ-12：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.156g，18％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),7.98-7.86(m,3H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H),7.31(t,J＝8.9Hz,2H), 7.18(d,J＝15.9Hz,1H),6.95(s,1H),3.79(t,J＝5.2Hz,2H),3.35(s,3H),2.39(t, J＝4.8Hz,2H),1.40(m,2H),1.20(t,J＝4.8Hz,3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C21H17ClFIN2O2510.0007；found408.9936,[M-H]-.
实施例13：
化合物9：
按照化合物5的合成步骤，(0.732g，93％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H),6.95(s,1H),3.10(s,3H),2.39(s,3H). MS(ESI):m/z Calcd.ForC12H10Cl2N2O3 284.0；found 283.0,[M-H]-.
化合物Ⅳ-13：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.156g，18％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),8.07–8.01(m,2H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H), 7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.95(s,1H),6.87–6.83(m,2H),3.10(s,3H),2.39(s, 3H).HR-MS(ESI):m/zCalcd.For C19H13BrCl2N2O2 449.9537；found 448.9455, [M-H]-.
实施例14：
化合物10：
按照化合物5的合成步骤，(0.732g，93％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ10.52(s,1H),8.19(m,1H),7.76(m,1H),6.99(t,J＝8.8Hz,1H),6.89(s,1H),3.01 (q,J＝4.8Hz,2H),2.34(s,3H),1.21(t,J＝4.8Hz,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C13H13ClN2O2 264.1；found 263.1,[M-H]-.
化合物Ⅳ-13：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.156g，18％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ10.52(s,1H),8.19(m,1H),8.07–8.01(m,2H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.76(m, 1H),7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.99(t,J＝8.8Hz,1H),6.89(s,1H),6.87–6.83(m, 2H),3.01(q,J＝4.8Hz,2H),2.34(s,3H),1.21(t,J＝4.8Hz,3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C21H13ClIN2O2486.9716；found 486.9715,[M-H]-.
实施例15：
化合物11：
按照化合物5的合成步骤，(0.732g，93％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),8.19(m,1H),7.76(m,1H),6.99(t,J＝8.8Hz,1H),6.89(s,1H),3.05 (s,3H),2.34(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C12H11BrN2O2 294.0；found 293.0, [M-H]-.
化合物Ⅳ-15：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.156g，18％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),8.19(m,1H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.76(m,1H),7.49(m,1H), 7.40-7.22(m,3H),7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.99(t,J＝8.8Hz,1H),6.89(s,1H), 3.05(s,2H),2.34(s,3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C19H14BrClN2O2 415.9927； found 414.9854,[M-H]-.
实施例16：
化合物9：
按照化合物5的合成步骤，(0.732g，93％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H),6.95(s,1H),2.39(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd. For C11H8Cl2N2O2270.0；found 271.0,[M+H]-.
化合物Ⅳ-16：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.156g，18％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),8.07–8.01(m,2H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H), 7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.95(s,1H),6.87–6.83(m,2H),2.39(s,3H).HR-MS(ESI): m/z Calcd.ForC18H11BrCl2N2O2 435.9381；found 436.9459,[M+H]-.
实施例17：
化合物Ⅳ-17：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.286g，28％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.15(d,J＝8.6Hz,2H),7.82(d,J＝15.8Hz,1H),7.31–7.22(m,2H),7.21–7.17 (m,1H),7.10(d,J＝15.8Hz,1H),6.94(s,1H),6.88–6.73(m,3H),3.59(t,J＝5.8 Hz,2H),3.51(t,J＝6.0Hz,2H),3.26(s,3H),3.05(s,3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd. For C22H24N3O3 378.1818；found 378.1819,[M+H]+.
实施例18：
化合物Ⅳ-18：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.486g，60％)。1H-NMR(400MHz,DMSO- d6):δ8.43(d,J＝1.8Hz,1H),8.16(t,J＝8.5Hz,3H),7.93(d,J＝15.9Hz,1H),7.85 (dt,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.66(t,J＝7.8Hz,1H),7.40(d,J＝15.9Hz,1H),6.98(s, 1H),6.86-6.71(m,2H),3.60(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.9Hz,2H),3.28(s,3H), 3.06(s,3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C23H23N4O2 387.1821；found 387.1822, [M+H]+.
实施例19：
化合物Ⅳ-19：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.286g，38％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.17(d,J＝8.6Hz,2H),7.91(d,J＝15.8Hz,1H),7.79(dt,J＝10.6,2.1Hz,1H), 7.66(d,J＝7.8Hz,1H),7.50(td,J＝8.0,6.2Hz,1H),7.34-7.20(m,2H),6.97(s,1H), 6.84-6.73(m,2H),3.59(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.9Hz,2H),3.27(s,3H),3.06 (s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C22H23N3O3F 380.1774；found 380.1775,[M+H]+.
实施例20：
化合物Ⅳ-20：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤,(0.222g,30％).1H NMR(400MHz,DMSO-d6): 8.14(d,J＝8.5Hz,2H),7.84(d,J＝15.7Hz,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(d,J ＝15.8Hz,1H),6.88(s,1H),6.84(d,J＝8.5Hz,2H),6.79(d,J＝8.8Hz,2H),3.59 (q,J＝5.4Hz,2H),3.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.24(s,3H),3.05(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C22H24N3O3378.1818；found 378.1819,[M+H]+.
实施例21：
化合物Ⅳ-21：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤,(0.352g,56％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.18(d,J＝8.5Hz,2H),8.08-8.02(m,2H),7.98-7.90(m,3H),7.40(d,J＝15.9Hz, 1H),7.00(s,1H),6.86-6.72(m,2H),3.60(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.6Hz,2H), 3.28(s,3H),3.06(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C23H23N4O2 387.1821；found 387.1820,[M+H]+.
实施例22：
化合物Ⅳ-22：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.252g，32％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.16(d,J＝8.5Hz,2H),7.93(t,J＝4.4Hz,2H),7.90(d,J＝6.1Hz,1H),7.31(t,J ＝8.9Hz,2H),7.18(d,J＝15.9Hz,1H),6.95(s,1H),6.83-6.72(m,2H),3.59(t,J＝ 5.9Hz,2H),3.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.27(s,3H),3.05(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd. For C22H23FN3O2 380.1774；found 380.1775,[M+H]+.
实施例23：
化合物13：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.252g，32％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.43(d,J＝1.8Hz,1H),8.16(t,J＝8.5Hz,3H),7.93(d,J＝15.9Hz,1H),7.85(dt, J＝7.8,1.4Hz,1H),7.66(t,J＝7.8Hz,1H),7.40(d,J＝15.9Hz,1H),6.98(s,1H), 6.86-6.71(m,2H),3.60(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.9Hz,2H),3.28(s,3H),3.06 (s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C23H23N4O2 387.2；found 387.2,[M+H]+.
化合物14：
化合物13(0.774g,2.0mmol)、碳酸钾(0.276g,2.0mmol)于250ml圆底 烧瓶中，加入100ml乙腈溶解，Ar保护条件下加入2ml溴丙烯，油浴加热回流，TLC检测，反应完毕，过滤，减压除去溶剂，残余物经柱色谱分离得化合物18 (0.673g,79％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.43(d,J＝1.8Hz,1H),8.16(t, J＝8.5Hz,3H),7.93(d,J＝15.9Hz,1H),7.85(dt,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.66(t,J＝ 7.8Hz,1H),7.40(d,J＝15.9Hz,1H),6.98(s,1H),6.86-6.71(m,2H),3.81(s,2H), 3.60(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.9Hz,2H),3.41(s,3H),3.06(s,3H).MS(ESI): m/z Calcd.For C26H27N4O2 427.2；found 427.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-14：
按照化合物Ⅳ-7的合成步骤，(0.152g，72％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.43(d,J＝1.8Hz,1H),8.16(t,J＝8.5Hz,3H),7.93(d,J＝15.9Hz,1H),7.85(dt, J＝7.8,1.4Hz,1H),7.66(t,J＝7.8Hz,1H),7.40(d,J＝15.9Hz,1H),6.98(s,1H), 6.86-6.71(m,2H),3.81(s,2H),3.60(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.9Hz,2H),3.41 (s,3H),3.06(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C26H27N4OS 443.1906；found 443.1905,[M+H]+.
实施例24：
化合物15：
按照化合物5的合成步骤，(0.692g，82％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ＝8.02(d,J＝2.4Hz,1H),7.44(dd,J＝8.7Hz,J＝2.4Hz,1H),7.09(s,1H),6.51 (d,J＝8.7Hz,1H),3.56(t,J HH＝7.6Hz,2H),3.08(s,6H),1.66(m,2H),2.38(s, 3H),0.95(t,J＝7.6Hz,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C15H21N4O 273.2；found 273.2,[M+H]+.
化合物16：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.452g，34％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ＝8.02(d,J＝2.4Hz,1H),7.95(m,2H),7.68-7.50(m,1H),7.44(dd,J＝8.7Hz,J＝ 2.4Hz,1H),7.34-7.06(m,2H),7.09(s,1H),7.00(d,J＝15.7Hz,1H),6.51(d,J＝8.7 Hz,1H),3.56(t,J HH＝7.6Hz,2H),3.08(s,6H),1.66(m,2H),2.38(s,3H),0.95 (t,J＝7.6Hz,3H).MS(ESI):m/zCalcd.For C22H24FN4O 379.2；found 379.2, [M+H]+.
化合物Ⅳ-24：
按照化合物Ⅳ-7的合成步骤，(0.152g，72％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ＝8.02(d,J＝2.4Hz,1H),7.95(m,2H),7.68-7.50(m,1H),7.44(dd,J＝8.7Hz,J＝ 2.4Hz,1H),7.34-7.06(m,2H),7.09(s,1H),7.00(d,J＝15.7Hz,1H),6.51(d,J＝8.7 Hz,1H),3.56(t,J HH＝7.6Hz,2H),3.08(s,6H),1.66(m,2H),2.38(s,3H),0.95 (t,J＝7.6Hz,3H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C22H24FN4S 395.1706；found 395.1705,[M+H]+.
实施例25：
化合物17：
按照化合物5的合成步骤，(0.892g，80％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ8.41(d,J＝1.5Hz,1H),7.97(d,J＝1.5Hz,1H),7.31(s,1H),5.86(s,1H),3.46 (t,J＝6.6Hz,4H),3.15(s,3H),2.32(s,3H),1.61(m,4H),1.32(m,12H),0.89(t,6 H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC22H36N5O 386.3；found 386.3,[M+H]+.
化合物Ⅳ-25:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.452g，34％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ8.41(d,J＝1.5Hz,1H),7.97(d,J＝1.5Hz,1H),7.85(d,J＝15.7Hz,1H),7.49(m, 1H),7.40-7.22(m,3H),7.31(s,1H),7.01(d,J＝15.7Hz,1H),5.86(s,1H),3.46 (t,J＝6.6Hz,4H),3.15(s,3H),2.32(s,3H),1.61(m,4H),1.32(m,12H),0.89(t,6 H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC29H39ClN5O 508.2843；found 508.2842,[M+H]+.
实施例26：
化合物18：
按照化合物5的合成步骤，(0.812g，81％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.93(s,2H),7.31(s,1H),4.24(t,J＝6.8Hz,2H),3.44(s,3H)，2.82(s,2H),2.43(s,3H). MS(ESI):m/zCalcd.For C14H17N6O 285.1；found 285.1,[M+H]+.
化合物Ⅳ-25:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.312g，26％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ＝8.02(d,J＝15.7Hz,1H),7.93(m,3H),7.68-7.50(m,1H),7.31(s,1H),7.24-7.06 (m,2H),7.01(d,J＝15.7Hz,1H),4.24(t,J＝6.8Hz,2H),3.44(s,3H)，2.82(s,2H), 2.43(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C21H20lN6O 499.0743；found 499.0742, [M+H]+.
实施例27：
化合物19：
按照化合物5的合成步骤，(0.932g，85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.59 (s,2H),6.71(s,1H),3.24(t,J＝5.6Hz,4H),3.06(t,J＝8.4Hz,2H),2.67(t,J＝6.2 Hz,4H),2.29(s,3H),1.86–1.82(m,4H),1.46(m,2H),1.21(t,J＝8.4Hz,3H). MS(ESI):m/zCalcd.For C20H25N3O 323.2；found 324.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-27：
按照化合物5的合成步骤，(0.932g，85％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝ 8.31(dd,J＝8.3Hz,J＝2.1Hz,1H),8.16(s,1H),7.94(d,J＝8.3Hz,1H),7.95(d,J＝ 15.7Hz,1H),7.59(s,2H),7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.71(s,1H),3.24(t,J＝5.6Hz, 4H),3.06(t,J＝8.4Hz,2H),2.67(t,J＝6.2Hz,4H),2.29(s,3H),1.86–1.82(m, 4H),1.46(m,2H),1.21(s,J＝8.4Hz,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C28H28N4O2 436.2263；found 437.2340,[M+H]+.
实施例28：
化合物20：
化合物Ⅳ-21(0.792g,2.0mmol)、对甲苯磺酰氯(0.476g,2.5mmol)和 三乙胺(0.303g,3.0mmol)于250ml圆底烧瓶中，加入100ml干燥二氯甲烷溶 解，Ar保护条件下室温搅拌，TLC检测反应完毕，体系倒入200ml水中，二氯 甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶解，残余物经 柱色谱分离得化合物27(0.822g，76％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.18(d, J＝8.5Hz,2H),8.08-8.02(m,2H),7.98-7.90(m,3H),7.40(d,J＝15.9Hz,1H),7.18 (d,J＝8.2Hz,2H),7.00(s,1H),6.86-6.72(m,2H),6.47(d,J＝8.2Hz,2H),4.06 (t,J＝6.1Hz,2H),3.49(t,J＝6.1Hz,2H),3.28(s,3H),2.77(s,3H),2.31(s,3H). MS(ESI):m/z Calcd.For C30H29N4O4S 541.2；found 541.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-28:
化合物20(0.541g,1.0mmol)、亚硫酸钠(0.630g,5.0mmol)于100ml 圆底烧瓶中，加入20ml无水DMF，Ar保护条件下50℃油浴加热反应24h， TLC检测反应完毕，减压除去溶剂，残余物经反相色谱分离得产物(0.301g， 60％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.18(d,J＝8.5Hz,2H),8.08-8.02(m,2H), 7.98-7.90(m,3H),7.40(d,J＝15.9Hz,1H),7.00(s,1H),6.86-6.72(m,2H),3.85(m, 4H),3.60(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.6Hz,2H),3.28(s,3H),3.16(m,4H),2.77 (s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C23H21N4O4S 499.1289；found499.1288,[M-H]-.
实施例29：
化合物Ⅳ-29:
化合物Ⅳ-21(0.386g,1.0mmol)、化合物31(0.265g,1.2mmol)、EDCI (0.382g,2.0mmol)、DMAP(0.183g,1.5mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入 30ml无水DMF溶解，Ar保护条件下室温搅拌，TLC检测，反应完毕，减压除 去溶剂，残余物经柱色谱分离得产物(0.490g,83％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.18(d,J＝8.5Hz,2H),8.08-8.02(m,2H),7.98-7.90(m,3H),7.40(d,J＝15.9Hz, 1H),7.00(s,1H),6.86-6.72(m,2H),4.17(s,2H),3.75(s,3H),3.6-3.7(m,10H), 3.57(m,2H),3.52(t,J＝5.6Hz,2H),3.38(s,3H),3.28(s,3H),3.06(s,3H). MS(ESI):m/z Calcd.For C32H39N4O7S 591.2819；found 591.2820,[M+H]+.
实施例30：
化合物22：
按照化合物5的合成步骤，(0.612g，87％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.15(d,J＝9.0Hz,2H),8.14(d,J＝9.0Hz,2H),7.21(s,1H),4.23(s,2H),4.11(s,3 H),3.38(t,J＝6.4Hz,2H),3.01(s,3H),2.92(t,J＝6.4Hz,2H),2.41(s,3H). MS(ESI):m/z Calcd.ForC18H25N4O3 345.2；found 345.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-30:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.422g，36％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ8.15(d,J＝9.0Hz,2H),8.14(d,J＝9.0Hz,2H),7.95(d,J＝16.0Hz,1H),7.82(d, J＝8.4Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),7.21(s,1H),7.01(d,J＝16.0Hz,1H),4.23(s, 2H),4.11(s,3H),3.38(t,J＝6.4Hz,2H),3.01(s,3H),2.92(t,J＝6.4Hz,2 H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC25H28BrN4O3 511.1345；found 511.1344,[M+H]+.
实施例31：
化合物23：
按照化合物23的合成步骤，(0.912g，89％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.17(d,J＝8.6Hz,2H),7.91(d,J＝15.8Hz,1H),7.79(dt,J＝10.6,2.1Hz,1H), 7.66(d,J＝7.8Hz,1H),7.50(td,J＝8.0,6.2Hz,1H),7.34-7.20(m,2H),7.18 (d,J＝8.2Hz,2H),6.97(s,1H),6.84-6.73(m,2H),6.47(d,J＝8.2Hz,2H),4.06 (t,J＝6.1Hz,2H),3.49(t,J＝6.1Hz,2H),3.27(s,3H),3.06(s,3H),2.77(s,3H),2.31 (s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C29H29FN3O4S534.2；found 534.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-31:
化合物23(0.534g,1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入35ml DMF溶 解，小心加入NaN3(0.195g,3.0mmol)，Ar保护条件下50℃油浴加热过夜， 次日体系冷却至室温，倒入100ml水中，DCM萃取三次，合并有机相，饱和食 盐水洗涤两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压除去溶剂，残余物无 需纯化直接用于下一步反应。
残余物溶于30ml THF中，加入Ph3P(0.524g,2.0mmol)，2ml水，Ar 保护条件下室温搅拌过夜，次日加压除去溶剂，残余物经柱色谱分离的目标产物 (0.301g,79％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.17(d,J＝8.6Hz,2H),7.91(d, J＝15.8Hz,1H),7.79(dt,J＝10.6,2.1Hz,1H),7.66(d,J＝7.8Hz,1H),7.50(td,J＝ 8.0,6.2Hz,1H),7.34-7.20(m,2H),6.97(s,1H),6.84-6.73(m,2H),3.38(t,J＝6.4 Hz,2H),2.92(t,J＝6.4Hz,2H),3.27(s,3H),3.06(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd. For C22H24FN4O 379.1934；found 379.1935,[M+H]+.
实施例32：
化合物Ⅳ-32:
化合物24(0.534g,1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入50ml乙醇溶解， 加入33％的二甲胺溶液，Ar保护条件下90℃油浴加热回流，TLC检测，反应完 毕，体系恢复至室温，减压除去溶剂，残余物经柱色谱分离的目标产物(0.276g, 68％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.17(d,J＝8.6Hz,2H),7.91(d,J＝15.8 Hz,1H),7.79(dt,J＝10.6,2.1Hz,1H),7.66(d,J＝7.8Hz,1H),7.50(td,J＝8.0,6.2 Hz,1H),7.34-7.20(m,2H),6.97(s,1H),6.84-6.73(m,2H),3.47(t,J＝7.6Hz,2H), 2.96(s,3H),2.49(t,J＝7.6Hz,2H),2.31(s,6H).MS(ESI):m/z Calcd.For C24H28FN4O 407.2247；found 407.2246,[M+H]+.
实施例33：
化合物25：
按照化合物5的合成步骤，(0.842g，89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.97 (d,J＝8.6Hz,1H),7.88(s,1H),6.85(s,1H),6.56(d,J＝8.6Hz,1H),5.40(s,1H), 3.07(s,3H),2.84(s,3H),2.31(s,3H),1.94(s,3H),1.32(s,6H).MS(ESI):m/z Calcd.For C19H24N3O310.2；found 310.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-33:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.222g，21％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ＝7.97(d,J＝8.6Hz,1H),7.90(d,J＝16.0Hz,1H),7.88(s,1H),7.87(d,J＝4.0Hz, 2H),7.43(d,J＝4.0Hz,2H),7.01(d,J＝16.0Hz,1H),6.85(s,1H),6.56(d,J＝8.6 Hz,1H),5.40(s,1H),3.07(s,3H),2.84(s,3H),1.94(s,3H),1.32(s, 6H).MS(ESI):m/z Calcd.For C27H26N4O422.2107；found 423.2186,[M+H]+.
实施例34：
化合物26：
按照化合物5的合成步骤，(0.732g，81％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.40 (dd,J＝8.32,1.93Hz,1H),7.29(d,J＝1.89Hz,1H),7.15(s,1H),6.68(d,J＝8.35Hz, 1H),4.23-4.31(m,2H),3.40-3.49(m,2H),3.21(s,3H),3.03(s,3H),2.42(s,3 H).MS(ESI):m/zCalcd.For C15H18N3O2 227.1；found 227.1,[M+H]+.
化合物Ⅳ-34:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.222g，21％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ＝7.95(d,J＝16.0Hz,1H),7.87(d,J＝4.0Hz,2H),7.43(d,J＝4.0Hz,2H),7.40 (dd,J＝8.32,1.93Hz,1H),7.29(d,J＝1.89Hz,1H),7.15(s,1H),7.01(d,J＝16.0Hz, 1H),6.68(d,J＝8.35Hz,1H),4.23-4.31(m,2H),3.40-3.49(m,2H),3.03(s,3H), 2.42(s,3H).MS(ESI):m/zCalcd.For C22H20FN3O2 377.1540；found 378.1681, [M+H]+.
实施例35：
化合物28：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.732g，39％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ8.19(d,J＝8.5Hz,2H),8.07(m,4H),8.04(s,1H),7.94(d,J＝8.3Hz,2H),7.44(d, J＝15.9Hz,1H),7.03(s,1H),3.29(s,3H)..MS(ESI):m/z Calcd.For C20H15N4O3 359.1；found 359.1,[M+H]+.
化合物Ⅳ-35:
化合物28(0.718g,2.0mmol)、氯化亚锡(0.758g,4.0mmol)于250ml 圆底烧瓶中，加入100ml乙酸乙酯溶解，Ar保护条件下室温搅拌，TLC检测， 反应完毕，体系倒入150ml水中，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸 钠干燥，过量，减压除去溶剂，残余物经柱色谱分离纯化得目标产物(0.586g， 89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.19(d,J＝8.5Hz,2H),7.97(m,4H),8.04(s, 1H),7.94(d,J＝8.3Hz,2H),7.44(d,J＝15.9Hz,1H),7.03(s,1H),3.29(s,3H). MS(ESI):m/z Calcd.For C20H17N4O 329.1402；found 329.1403,[M+H]+.
实施例36：
化合物29：
按照化合物5的合成步骤，(0.756g，74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.15(1H,s),7.81(2H,m),7.65(1H,d,J＝9.0Hz),7.16(1H,dd,J＝9.0,J＝3.0Hz), 6.95(s,1H),6.88(1H,d,J＝3.0Hz),3.60(t,J＝5.9Hz,2H),3.52(t,J＝5.9Hz,2H),3.28 (s,3H),3.06(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C19H21N3O2 323.2；found 324.2,[M+H]+.
化合物Ⅳ-36:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.272g，24％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ8.15(1H,s),7.81(2H,m),7.65(1H,d,J＝9.0Hz),7.49(m,1H),7.40-7.22(m,3H), 7.16(1H,dd,J＝9.0,J＝3.0Hz),6.95(s,1H),6.88(1H,d,J＝3.0Hz),3.60(t,J＝5.9 Hz,2H),3.52(t,J＝5.9Hz,2H),3.28(s,3H),3.06(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C26H25N3O3 427.1896；found428.1974,[M+H]+.
实施例37：
化合物Ⅳ-37:
按照化合物13的合成步骤，(0.322g，79％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ8.16(d,J＝8.5Hz,2H),7.93(t,J＝4.4Hz,2H),7.90(d,J＝6.1Hz,1H),7.31(t,J＝8.9Hz, 2H),7.18(d,J＝15.9Hz,1H),6.95(s,1H),6.83-6.72(m,2H),4.21(s,2H),3.59(t,J＝5.9Hz, 2H),3.51(t,J＝5.9Hz,2H),3.27(s,3H),3.05(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C25H25FN3O2418.1931；found 418.1932,[M+H]+.
实施例38：
化合物30：
按照化合物5的合成步骤，(0.816g，89％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 9.02(d,1H,J＝2.1Hz),8.59(d,1H,J＝2.1Hz),7.93(d,1H,J＝9.1Hz),7.34(dd, 1H,J＝9.1,2.5Hz),7.21(s,1H),7.00(d,1H,J＝2.5Hz),3.11(s,6H),3.06(s,3H). MS(ESI):m/z Calcd.ForC17H18N4O 294.1；found 295.1,[M+H]+.
化合物Ⅳ-38
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.272g，24％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ＝9.02(d,1H,J＝2.1Hz),8.59(d,1H,J＝2.1Hz),7.95(d,J＝16.0Hz,1H), 7.93(d,1H,J＝9.1Hz),7.49(m,1H),7.40-7.22(m,3H),7.34(dd,1H,J＝9.1,2.5 Hz),7.21(s,1H),7.15(d,J＝16.0Hz,1H),7.00(d,1H,J＝2.5Hz),3.11(s,6H), 3.06(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC25H21N5O 407.1821；found 408.1825, [M+H]+.
对比例1：
化合物Ⅳ-39：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.275g，75％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.00(s,1H),8.08-8.04(m,2H),8.02(d,J＝15.9Hz,1H),7.92-7.87(m,2H), 7.49-7.45(m,2H),7.26(d,J＝15.9Hz,1H),6.98(s,1H),3.29(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C19H13F2N3O2339.0951；found 339.0950,[M-H]-.
对比例2：
化合物Ⅳ-40：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.327g，55％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.70(s,1H),8.05(d,J＝8.9Hz,2H),7.98-7.89(m,1H),7.30(t,J＝6.2Hz,1H), 7.26(d,J＝8.9Hz,1H),7.15(d,J＝15.8Hz,1H),6.97(s,1H),6.87(d,J＝7.5Hz, 1H),3.27(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C18H12F2N3O2 340.0903；found 340.090, [M-H]-.
对比例3：
化合物Ⅳ-41：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.342g，46％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ＝8.21(d,2H,J＝8.8Hz),8.00(d,1H,J＝16Hz),7.85(d,2H,J＝8.0Hz),7.50-7.43(m, 2H),7.42(d,J＝2.6Hz,1H),7.24(s,1H),7.01(s,1H),6.92(d,2H,J＝8.8Hz),3.85 (t,2H,J＝5.6Hz),3.60(t,2H,J＝5.6Hz),3.10(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C22H24N3O2362.1869；found 362.1868,[M+H]+.
对比例4：
化合物Ⅳ-42:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.312g，43％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ＝8.15(1H,s),8.00(d,1H,J＝16Hz),7.85(d,2H,J＝8.0Hz),7.81(2H,m),7.65(1H, d,J＝9.0Hz),7.20(s,1H),7.50-7.43(m,3H),7.42(d,1H,J＝16Hz),7.16(1H,dd,J＝ 9.0,J＝3.0Hz),6.88(1H,d,J＝3.0Hz),3.65(t,J＝7.2Hz,2H),3.45(t,J＝7.2Hz,2 H),3.35(s,3H)3.03(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C26H26N3O2 412.2025；found 412.2026,[M+H]+.
对比例5：
化合物Ⅳ-43:
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.412g，46％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6): δ＝8.72(s,2H),8.00(d,1H,J＝16Hz),7.50-7.43(m,2H),7.42(d,J＝2.6Hz, 1H),7.24(s,1H),7.01(s,1H),6.92(d,2H,J＝8.8Hz),3.75(t,J＝6.8Hz,2H),3.60(t,2 H,J＝6.8Hz),3.05(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.For C21H21lN6O 373.1777；found 373.1778,[M+H]+.
对比例6：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.192g，33％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ7.96-7.99(m,4H),7.33-7.37(m,3H),6.98(s,1H),3.24(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC19H12F4N2O2 376.0835；found 376.0830,[M-H]-.
对比例7：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.192g，33％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ7.96-7.99(m,4H),7.33-7.37(m,3H),6.98(s,1H),3.24(s,3H).MS(ESI):m/z Calcd.ForC19H12F4N2O2 376.0835；found 376.0830,[M-H]-.
对比例8：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.70(s, 1H),8.35(s,2H),8.15(s,2H),7.82(d,J＝15.8Hz,1H),7.22(d,J＝15.9Hz,1H),6.95 (s,1H),3.27(s,3H)；HRMS(ESI)m/z:546.8647found(calcd for C19H12Br2Cl2N2O3, [M+H]+546.8644).
对比例9：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.38(s, 1H),8.18(d,J＝2.0Hz,2H),8.12(s,2H),7.81(d,J＝4.8Hz,1H),7.18(d,J＝4.8Hz, 1H),6.93(s,1H),6.78(d,J＝2.0Hz,2H),3.25(s,3H),3.04(s,6H)；HRMS(ESI)m/z: 505.9855found(calcd for C21H19Br2N3O2,[M+H]+505.9896).
对比例10：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 10.38(s， 1H),8.16(d,J＝2.0Hz,2H),8.11(s,2H),7.80(d,J＝4.8Hz,1H),7.18(d,J＝4.8Hz, 1H),6.91(s,1H),6.74(d,J＝2.0Hz,2H),3.44(d,J＝4.8Hz,2H),3.25(s,3H),1.14(t, J＝4.8Hz,6H)；HRMS(ESI)m/z:534.0154found(calcd for C23H23Br2N3O2,[M+H]+ 534.0209).
对比例11：
按照化合物Ⅳ-1的合成步骤，(0.156g，18％)。1H NMR(400MHz,CD3OD) δ10.52(s,1H),8.07–8.01(m,2H),7.95(d,J＝15.7Hz,1H),7.76(d,J＝8.5Hz,2H), 7.01(d,J＝15.7Hz,1H),6.95(s,1H),6.87–6.83(m,2H),4.12(s,3H),3.62(s,3H), 1.50(s,9H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C24H21F3N2O4 457.5381；found457.5380, [M-H]-.
对比例12：
按照文献公布方法合成(JACS,2018,140,7381-7384.)。1H NMR(400MHz, CD3OD)δ8.17(d,J＝8.3Hz,2H),7.79(d,J＝15.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H), 6.84(s,1H),6.80(dd,J＝9.9,2.8Hz,2H),6.75(dd,J＝8.8,5.6Hz,2H),6.66(d, J＝15.6Hz,1H),4.82(s,2H),4.38(s,2H),3.59-3.43(m 8H),3.41-3.35(m,2H), 3.20-3.13(m,2H),3.04(s,6H),2.12-1.17(m,18H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C37H44ClF3N4O6 732.2901；found733.2980,[M-H]-.
对比例13：
按照文献公布方法合成(JACS,2018,140,7381-7384.)。1H NMR(400MHz, CD3OD)δ8.17(d,J＝8.3Hz,2H),7.79(d,J＝15.6Hz,1H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H), 6.84(s,1H),6.80(dd,J＝9.9,2.8Hz,2H),6.75(dd,J＝8.8,5.6Hz,2H),6.66(d, J＝15.6Hz,1H),4.82(s,2H),4.38(s,2H),3.59-3.43(m 8H),3.41-3.35(m,2H), 3.20-3.13(m,2H),3.04(s,6H),2.12-1.17(m,18H).HR-MS(ESI):m/z Calcd.For C38H44ClF3N5O6 739.2948；found740.3026,[M+H]-.
试验例1：
将实施例1-38制备的荧光染料IV-1–IV-38(分子转子)分别溶于二甲基亚 砜中，各自制得浓度为1×10-2M的母液，将各母液分别加入甘油和甲醇中，混 合均匀，各配制终浓度为1×10-5M的溶液，根据荧光染料不同，依次用各荧光 染料最大激发波长在相同条件下检测其荧光发射图谱，结果如表1所示，表明本 发明荧光染料粘度变化响应灵敏。
表1
试验例2：
分子转子IV-1、IV-2、IV-3、IV-4、IV-5、IV-6、IV-17、IV-18、IV-19、IV-20、 IV-21、IV-22加入二乙醇-甘油混合溶液中，配制为终浓度为1×10-5M的溶液， 480nm激发，不同粘度条件下荧光发射光谱如图1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12所示，相同浓度的分子转子在不同粘度条件下荧光强度逐渐增大， 说明分子转子荧光强度随环境粘度的增大荧光增强，证明分子转子对粘度反应灵 敏，是一种分子转子。
试验例3：
分子转子IV-39、IV-40、IV-44与IV-1、IV-2、IV-3、IV-4、IV-5、IV-6、IV-7、IV-8；IV-41、IV-43与IV-17、IV-18、IV-19、IV-20、IV-21、IV-22；IV-42与IV-36； IV-45、IV-46与IV-3；IV-47、IV-48与IV-20；IV-49、IV-50与IV-5；IV-51与IV-1； 溶解于DMSO中，配置为1×10-3M的母液，分别去上述母液加入PBS溶液中， 配置终浓度为1×10-6M的溶液，分别用各化合物最大激发波长激发，检测他们 在PBS中的荧光强度，以各组最强荧光为100对各样品进行归一化，分别如图 13、图14、图15、图16、图17、图18、图19所示。图13、图14、图15结果 表明：与拉电子基团上的芳香环上没有取代的分子转子相比较，本申请拉电子基 团上的芳香环上具有羟基、氰基、氟原子、氯原子、溴原子、碘原子取代的分子 转子具有更低的本底荧光；图16、图17结果表明，与拉电子基团上芳香环上有 多个取代的分子转子相比，单个取代的分子转子具有相对较低的本底荧光，可能 是因为多取代改变了拉电子基团上芳香结构的电子云分布，造成荧光本底升高； 图18、图19结果表明，R1处为简单的烷基取代时本底荧光更低，可能是R1体 积较大或者改性烷基上的杂原子(如，氧原子、氮原子)与拉电子基团上的芳香 环具有微弱的相互作用，从而抑制力此处的双键转动等非辐射耗能运动，从而造成化合物的荧光本底升高。
试验例4：
化合物IV-1、IV-2、IV-3、IV-4、IV-5、IV-6、IV-17、IV-18、IV-19、IV-20、 IV-21、IV-22与RNA适配体 (UUGCCAUGUGUAUGUGGGAGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUU GUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGC CGAAAGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCGGCGG ACACUUCCUCCCACAUACUCUGAUGAUCCUUCGGGAUCAUUCAUGGCAA) 特异性结合，结合后的化合物荧光被显著激活，在合适波长激发光的激发下发射 明亮的荧光，结合后的光学性质见表2，化合物还可以与细胞内该适配体结合， 表达了该RNA适配体的细胞具有明亮的荧光，如图20A；未表达该RNA适配 体的细胞无荧光，如图20B，说明该系列染料可以用于核酸的标记。
表2
注：荧光量子产率以罗丹明6G为标准(QY＝0.94)，采用相对法测得。
试验例5：
使用持续表达RNA适配体 (AUGGAUGAUGAUAUCGCCGCGCUCGUCGUCGACAACGGCUCCGGCAU GUGCAAGGCCGGCUUCGCGGGCGACGAUGCCCCCCGGGCCGUCUUCCCC UCCAUCGUGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGCGUGAUGGUGGGCAUGGGU CAGAAGGAUUCCUAUGUGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCAUC CUCACCCUGAAGUACCCCAUCGAGCACGGCAUCGUCACCAACUGGGACG ACAUGGAGAAAAUCUGGCACCACACCUUCUACAAUGAGCUGCGUGUGG CUCCCGAGGAGCACCCCGUGCUGCUGACCGAGGCCCCCCUGAACCCCAA GGCCAACCGCGAGAAGAUGACCCAGAUCAUGUUUGAGACCUUCAACACC CCAGCCAUGUACGUUGCUAUCCAGGCUGUGCUAUCCCUGUACGCCUCUG GCCGUACCACUGGCAUCGUGAUGGACUCCGGUGACGGGGUCACCCACAC UGUGCCCAUCUACGAGGGGUAUGCCCUCCCCCAUGCCAUCCUGCGUCUG GACCUGGCUGGCCGGGACCUGACUGACUACCUCAUGAAGAUCCUCACCG AGCGCGGCUACAGCUUCACCACCACGGCCGAGCGGGAAAUCGUGCGUGA CAUUAAGGAGAAGCUGUGCUACGUCGCCCUGGACUUCGAGCAAGAGAU GGCCACGGCUGCUUCCAGCUCCUCCCUGGAGAAGAGCUACGAGCUGCCU GACGGCCAGGUCAUCACCAUUGGCAAUGAGCGGUUCCGCUGCCCUGAGG CACUCUUCCAGCCUUCCUUCCUGGGCAUGGAGUCCUGUGGCAUCCACGA AACUACCUUCAACUCCAUCAUGAAGUGUGACGUGGACAUCCGCAAAGA CCUGUACGCCAACACAGUGCUGUCUGGCGGCACCACCAUGUACCCUGGC AUUGCCGACAGGAUGCAGAAGGAGAUCACUGCCCUGGCACCCAGCACAA UGAAGAUCAAGAUCAUUGCUCCUCCUGAGCGCAAGUACUCCGUGUGGA UCGGCGGCUCCAUCCUGGCCUCGCUGUCCACCUUCCAGCAGAUGUGGAU CAGCAAGCAGGAGUAUGACGAGUCCGGCCCCUCCAUCGUCCACCGCAAA UGCUUCUAGCACUCGCUAGAGCAUGGUUAAGCUUGGAAGAUUGUAAAC ACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAG AUUGUAAACACGCCGAAAGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCGGCGG ACACUUCCGGCGGACACUUCC)标记的mRNA的细胞骨架蛋白的稳定细胞株 (293T/17)和对照细胞(293T/17)，在常规哺乳动物细胞培养条件下(37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度)，待其生长至细胞汇合度达90％后，将细胞消化 下来，800rpm离心，并使用含有0.2μM IV-21和IV-41分子的PBS重悬细胞 并孵育5分钟后进行流式检测，检测结果可见(图21)，IV-21分子在表达了目 标RNA的细胞株中可特异性标记ACTB的mRNA，且无明显本底荧光(21A)， 而IV-41分子本底荧光高于IV-21，无法清晰区分ACTB是否表达(21B)。
序列表
<110> 纳莹（上海）生物科技有限公司
<120> 一种荧光染料及其制备方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 3
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UUGCCAUGUGUAUGUGGGAGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGAAAGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCUCCCACAUACUCUGAUGAUCCUUCGGGAUCAUUCAUGGCAA
<220>
<223> AUGGAUGAUGAUAUCGCCGCGCUCGUCGUCGACAACGGCUCCGGCAUGUGCAAGGCCGGCUUCGCGGGCGACGAUGCCCCCCGGGCCGUCUUCCCCUCCAUCGUGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGCGUGAUGGUGGGCAUGGGUCAGAAGGAUUCCUAUGUGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGGCAUCCUCACCCUGAAGUACCCCAUCGAGCACGGCAUCGUCACCAACUGGGACGACAUGGAGAAAAUCUGGCACCACACCUUCUACAAUGAGCUGCGUGUGGCUCCCGAGGAGCACCCCGUGCUGCUGACCGAGGCCCCCCUGAACCCCAAGGCCAACCGCGAGAAGAUGACCCAGAUCAUGUUUGAGACCUUCAACACCCCAGCCAUGUACGUUGCUAUCCAGGCUGUGCUAUCCCUGUACGCCUCUGGCCGUACCACUGGCAUCGUGAUGGACUCCGGUGACGGGGUCACCCACACUGUGCCCAUCUACGAGGGGUAUGCCCUCCCCCAUGCCAUCCUGCGUCUGGACCUGGCUGGCCGGGACCUGACUGACUACCUCAUGAAGAUCCUCACCGAGCGCGGCUACAGCUUCACCACCACGGCCGAGCGGGAAAUCGUGCGUGACAUUAAGGAGAAGCUGUGCUACGUCGCCCUGGACUUCGAGCAAGAGAUGGCCACGGCUGCUUCCAGCUCCUCCCUGGAGAAGAGCUACGAGCUGCCUGACGGCCAGGUCAUCACCAUUGGCAAUGAGCGGUUCCGCUGCCCUGAGGCACUCUUCCAGCCUUCCUUCCUGGGCAUGGAGUCCUGUGGCAUCCACGAAACUACCUUCAACUCCAUCAUGAAGUGUGACGUGGACAUCCGCAAAGACCUGUACGCCAACACAGUGCUGUCUGGCGGCACCACCAUGUACCCUGGCAUUGCCGACAGGAUGCAGAAGGAGAUCACUGCCCUGGCACCCAGCACAAUGAAGAUCAAGAUCAUUGCUCCUCCUGAGCGCAAGUACUCCGUGUGGAUCGGCGGCUCCAUCCUGGCCUCGCUGUCCACCUUCCAGCAGAUGUGGAUCAGCAAGCAGGAGUAUGACGAGUCCGGCCCCUCCAUCGUCCACCGCAAAUGCUUCUAGCACUCGCUAGAGCAUGGUUAAGCUUGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGGAAGAUUGUAAACACGCCGAAAGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCCGGCGGACACUUCC
<400> 2