一种生物样品检测方法及检测试剂盒
阅读说明：本技术 一种生物样品检测方法及检测试剂盒 (Biological sample detection method and detection kit ) 是由 王哲 柳可 熊贵 于 2020-06-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生物样品检测方法及检测试剂盒,该方法通过免疫特异性结合磁珠的方式,形成三元复合物(磁珠-抗原-标记物),在磁场作用下收集三元复合物。在特定化学试剂下,将三元免疫复合物中的标记物洗脱下来,在磁场作用下将标记物和磁珠分离,收集包含标记物的洗脱液并用强电解质重新分散。检测标记物的洗脱液进而通过纳米颗粒计数器从而实现绝对定量。本发明方法可以检出常规免疫检测检出下限以下的痕量蛋白,在免疫学检测、微生物检测、细胞分离等领域可广泛应用。(The invention discloses a biological sample detection method and a detection kit, wherein a ternary complex (magnetic bead-antigen-marker) is formed by combining immunospecificity with a magnetic bead, and the ternary complex is collected under the action of a magnetic field. Eluting the label in the ternary immune complex under the action of a specific chemical reagent, separating the label from the magnetic beads under the action of a magnetic field, collecting the eluate containing the label and re-dispersing the eluate by using a strong electrolyte. The eluate of the detection marker is then passed through a nanoparticle counter to achieve absolute quantitation. The method can detect trace protein below the lower limit of the conventional immunoassay, and can be widely applied to the fields of immunoassay, microbial detection, cell separation and the like.)
技术领域
本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种生物样品的定量检测方法。
背景技术
疾病的发生、发展与蛋白质的异常表达或特定蛋白表达密切相关。准确测定疾病相关蛋白的含量在传染病防控、癌症筛查和精准诊断等方面具有重要意义。
几种常用的免疫学技术，酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng水平。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器，检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。常用的方法有间接法、夹心法以及BAS－ELISA。间接法是先将待测的蛋白抱被在孔板内，然后依次加入一抗、标记了酶的二抗和底物显色，通过仪器(例如酶标仪)定量检测抗原。这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差。目前已逐渐被夹心法取代。夹心法利用二种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。目前通用的夹心法需要一端连接可以直接或者间接发光的基团，会受到溶液环境和检测器灵敏度的限制。
最近，Quanterix开发了一种可同时检测数千个单个蛋白质分子的方法。使用与常规ELISA相同的试剂，该方法已用于以飞摩尔(fg/mL)浓度测量各种不同基质(血清，血浆，脑脊髓液，尿液，细胞提取物等)中的蛋白质，从而将灵敏度大约提高了1000倍。这种方法利用了飞升大小的反应室阵列，这些阵列称为单分子阵列(SimoaTM)，可以隔离和检测单个酶分子。因为阵列体积比常规ELISA小约20亿倍，所以如果存在标记的蛋白质，则会快速生成荧光产物。随着扩散的消除，可以容易地观察到这种高的局部产物浓度。只需一个分子即可达到检测极限。该方法也被定义为数字ELISA。但是，Simoa方法还是依赖于计算每个反应室的光学信号强度通过柏松公式推算浓度，还不能实现完全的绝对定量。
发明内容
针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种生物样品的定量检测方法。
本发明的另一个目的是提供一种生物样品的定量检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
一种生物样品检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将修饰有第一结合物的磁珠与含有待分析物的样品、及修饰有第二结合物的标记物混合，得混合液；
(2)除去混合液中未结合的修饰有第二结合物的标记物；
(3)将混合液中的标记物与磁珠分离；
(4)去除样品中的磁珠，通过对标记物进行计数和/或电荷、粒径测量得出样品中待分析物的含量以及种类；
其中，第一结合物和第二结合物分别与所述样品中的待分析物的第一结合位点、第二结合位点特异性结合。
作为优选的：步骤(2)的方法为：在磁场的控制下，吸附住混合物中的磁珠，除去混合液中未结合的修饰有第二结合物的标记物。其中，磁场的强度不低于0.0001T，优选为0.0001T-0.1T；
作为优选的：步骤(3)中，标记物和磁珠的分离可以是断开磁珠与第一结合物的连接，或者断开第一结合物与待分析物的结合，或者断开第二结合物与待分析物的结合，或者断开第二结合物与标记物的连接；
具体的方法可以为：
1)利用解离剂，解离磁珠与第一结合物的连接或第二结合物与标记物的连接，所述解离剂可以是柠檬酸缓冲液、强酸性缓冲液、强碱性缓冲液，或者是其他的化学解离剂；
或者2)使用第一结合物的竞争分子、待分析物的竞争分子、或第二结合物的竞争分子使得标记物被从磁珠上替换下来；
或者3)特异性分解酶分解第一结合物、待分析物、第二结合物；
或者4)采用以上方法的组合。
作为优选的：步骤(4)使用磁场吸附，去除样品中的磁珠；
作为优选的，步骤(4)中标记物的计数采用纳米孔计数法、或者NTA检测法、或者纳米流式计数法、或者数字荧光计数法检测。
作为优选的：所述标记物为直径在10nm～1000nm的颗粒。
进一步优选的：所述的标记物为聚乙烯微球，二氧化硅微球，纳米金或者荧光微球。
作为优选的：第一结合物或第二结合物为抗原、抗体、受体、或者是适配体。
作为优选的：第一结合物与磁珠的修饰方式，或者第二结合物与标记物的修饰方式为硝基苄基与DNA分子链的键合，或者是二硫代乙基氨基与羧基的键合，或者是磺酸盐与寡核苷酸的键合，或者是6C或12C有机分子链与生物素的键合。
作为优选的：所述6C或12C有机分子链可以是六烷基链或者十二烷基链。
本发明的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，第一结合物修饰在磁珠的表面；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
根据标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和含量。
作为优选的：每种标记物的直径差异5％以上，或者表面电位差异10％以上。
作为优选的：本技术方案通过不同孔径的纳米孔检测样品中标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和浓度。
本发明的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，每种第一结合物分别修饰在不同的磁珠表面，每种磁珠在尺寸和/或磁感应强度上有可测量的差异；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
在步骤(3)之前，通过磁场梯度、磁场偏转或者离心的方法，将不同尺寸或者不同磁感应强度的磁珠分组；
在不同分组中根据标记物的尺寸和/或表面电位，来区分不同标记物的种类并计数，从而得到样品中待分析物的种类和含量，从而更大限度实现不同待测物的同时检测。
作为优选的：每种磁珠的直径差异在5％以上，或者磁感应强度差异在5％以上；
作为优选的：每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异10％以上。
一种生物样品检测试剂盒，其包括：
a.修饰有第一结合物的磁珠，第一结合物能够与待分析物的第一结合位点特异性结合；
b.修饰有第二结合物的标记物，第二结合物能够与待分析物的第二结合位点特异性结合。
作为优选的：所述标记物为直径在10nm～1um的颗粒。
进一步优选的：所述的标记物为聚乙烯微球，二氧化硅微球，纳米金或者荧光微球。
作为优选的：第一结合物或第二结合物为抗原、抗体、受体、或者是适配体。
作为优选的：第一结合物与磁珠的修饰方式，或者第二结合物与标记物的修饰方式为硝基苄基与DNA分子链的键合，或者是二硫代乙基氨基与羧基的键合，或者是磺酸盐与寡核苷酸的键合，或者是6C或12C有机分子链与生物素的键合。
作为优选的：所述6C或12C有机分子链可以是六烷基链或者十二烷基链。
本发明试剂盒的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，第一结合物修饰在磁珠的表面；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
作为优选的：每种标记物的直径差异5％以上，或者表面电位差异10％以上。
本发明试剂盒的另一个技术方案为：
所述待分析物为一种或一种以上；
对应地，所述第一结合物为一种或一种以上，每种第一结合物分别与对应的待分析物的第一结合位点特异性结合，每种第一结合物分别修饰在不同的磁珠表面，每种磁珠在尺寸和/或磁感应强度上有可测量的差异；
对应地，所述第二结合物为一种或一种以上，每种第二结合物分别与对应的待分析物的第二结合位点特异性结合，每种第二结合物分别修饰到不同的标记物的表面，每种标记物在尺寸和/或表面电位上有可测量的差异；
作为优选的：每种磁珠的直径差异在5％以上，或者磁感应强度差异在5％以上。
作为优选的：每种标记物的直径差异在5％以上，或者表面电位差异在10％以上。
进一步优选的：所述试剂盒还包括缓冲液、解离剂以及小型磁铁装置，或者用于产生磁场的线圈装置。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过免疫特异性结合磁珠的方式，形成三元复合物(磁珠-抗原-标记物)，如图1所示，在磁场作用下收集三元复合物。在特定化学试剂下，将三元免疫复合物中的标记物洗脱下来，在磁场作用下将标记物和磁珠分离，收集包含标记物的洗脱液并用强电解质重新分散检测标记物的洗脱液进而通过纳米颗粒计数器从而实现绝对定量，如图2所示。
2、本发明方法中，第一结合物与磁珠连接的优势在于：磁珠可以均匀分散在混合液中，能够使第一结合物充分结合待测样品中的待测物，提高捕获率，提高检测下限；同时带磁珠的三元复合物能够在磁场的作用下进行富集，便于后续步骤使用检测计数；此外“磁珠-抗原-标记物”三元复合物在磁场中的分组，可以更进一步增加同时检测的待分析物的种类数。
3、标记物与磁珠的多种解离方式的组合运用的优势在于：可以最大限度地提高解离率。
4、本发明通过使用不同的标记物结合不同的待测物的方法，可以检测多个不同待测物的种类和含量，实现多靶标的同时检测。
5、本发明方法使用纳米颗粒计数法，不使用光学读取的方法，可以极大的提高检出下限。计数颗粒可以在有利于提高纳米孔计数信噪比的溶液中稳定读取，该方法可以在抗原抗体不稳定的环境中进行计数。
6、本发明方法可以检出常规免疫检测检出下限以下的痕量蛋白，在免疫学检测、微生物检测、细胞分离等领域可广泛应用。
附图说明
图1为本发明“磁珠-抗原-标记物”三元复合物结构示意图。
图2为本发明检测方法的检测原理示意图：1为修饰有第一结合物的磁珠与含有待分析物的样品混合，2为修饰有第一结合物的磁珠与待分析物的第一结合位点特异性结合，3为加入修饰有第二结合物的标记物与待分析物的第二结合位点特异性结合，在磁场下去除未结合的修饰有第二结合物的标记物4为标记物与磁珠分离，收集上清中洗脱下来的标记物。
图3为不同初始浓度肌钙蛋白cTnI得到的计数曲线图：其中数据圆点(o)为标准浓度样本计数值，实测样本的计数值(x)可在标准曲线上对应相应浓度。
图4为实施例2肌钙蛋白cTnI和cTnT同时检测示意图：不同标记物1和2与磁珠分离，收集上清中洗脱下来的标不同标记物1和2。标记物2较标记物1有较大的尺寸，对应较大的脉冲信号，以此来区分标记物1和2。
图5为实施例2肌钙蛋白cTnI和cTnT同时检测计数结果：标记物1和2混合物的脉冲数据，单个脉冲对应单个标记物颗粒。标记物2较标记物1有较大的尺寸，对应较大的脉冲信号，通过脉冲值可以区分标记物1和2，从而实现标记物1和2的计数。
图6为不同磁珠的磁场分离示意图：磁场方向和流体初始方向正交。三元复合物在磁场作用下发生偏转，小磁珠的三元复合物从第一个出口流出，大磁珠的三元复合物因为尺寸较大，偏转比较小，从第二个出口流出。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
本实施例以肌钙蛋白cTnI的检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白抗体1(a34600，biospacific)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清白蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
l mg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，直径200纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3、肌钙蛋白cTnI检测方法
(1)将不同浓度的肌钙蛋白cTnI待检测样本(10fg/ml，100fg/ml,1pg/ml)与抗体1标记的免疫磁珠混合，在37℃孵育1h；
(2)在铷磁铁的磁场(磁场强度为0.0001T)吸引下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)通过移液枪吸取去除上清液，反复3次；
(3)向其中加入抗体2标记的纳米颗粒，在37℃孵育1h；
(4)除去未结合的纳米颗粒：在磁场下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次去除上清液；
(5)向免疫三元复合物中先后加入解离液柠檬酸缓冲液(pH＝3)和NaOH溶液(pH＝13)洗脱纳米颗粒；
(6)磁场下吸取上清液重新分散在1M KCl缓冲液中。
(7)利用基于库尔特原理(U.S.Patent 2,656,508.1953)的纳米孔单颗粒计数装置(型号：qNano,Izon science Ltd.)对步骤(6)分散于KCl缓冲液中的纳米颗粒进行计数。
本实施例中，不同浓度的肌钙蛋白cTnI待检测样本(10fg/ml，100fg/ml，1000fg/ml)可以洗脱得到相应浓度的纳米颗粒上清液。将该上清液用上述方法进行计数。在图3中有10fg/ml，100fg/ml，1000fg/ml不同初始浓度肌钙蛋白cTnI得到的计数数据(表1)，通过计数可以得到浓度和计数数目的标准曲线。其中数据圆点(o)为标准浓度样本计数值，实测样本的计数值(x)可在标准曲线上对应相应浓度为500fg/ml。
表1不同初始浓度肌钙蛋白cTnI得到的计数数据
肌钙蛋白cTnI浓度
计数数目
10fg/ml
4
100fg/ml
43
1000pg/ml
425
浓度计算公式：单位时间计数(N)＝浓度常数(A)*浓度(C)。这里浓度常数A由标准曲线得到，为0.42±0.02ml/pg。
进一步以浓度为500fg/ml的肌钙蛋白cTnI进行验证。经检测，计数数目为212，经计算公式换算后浓度为498fg/ml，准确率达99％以上。
实施例2
本实施例以肌钙蛋白cTnI和肌钙蛋白cTnT同时检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备多种抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnI抗体1(a34600，biospacific)和捕获肌钙蛋白cTnT抗体1(1C11，HyTest)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清白蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(二氧化硅微球，100纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入抗体2(9G6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3、肌钙蛋白cTnI和cTnT同时检测方法
洗脱方法在实施例1中一样的步骤之前，还通过添加肌钙蛋白分解酶的方法进行洗脱，得到两种标记物纳米颗粒的混合上清液，用于纳米孔计数。检测原理如图4所示，计数结果如图5所示，不同颗粒大小得到不同幅值的脉冲。检测结果如表2所示。
表2不同初始浓度肌钙蛋白的检测数据
蛋白
初始浓度
标记物计数数目
换算浓度
准确率
cTnI
75fg/ml
31
72fg/ml
98％
cTnT
500fg/ml
210
485fg/ml
97％
实施例3
本实施例以肌钙蛋白cTnI，肌钙蛋白cTnT，C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)同时检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备多种抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnI抗体1(a34600，biospacific)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获CRP抗体1(K1016，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnT抗体1(1C11，HyTest)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获PCT抗体1(K3b8，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，1000纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnI抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，1000纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入CRP抗体2(K1017，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(纳米金，10纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnT抗体2(9G6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(纳米金，10纳米)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入PCT抗体2(K58w3，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3.四种蛋白的同时检测
(1)将四种蛋白样本与四种抗体1标记的免疫磁珠混合，在37℃孵育1h；
(2)在磁场(磁场强度0.0001T)吸引下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)通过移液枪吸取去除上清液，反复3次；
(3)向其中加入四种抗体2标记的纳米颗粒，在37℃孵育1h；
(4)除去未结合的纳米颗粒：在磁场下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次去除上清液；
(5)磁场作用下的分离：上述混合物经过如图6所示的分叉管路，从左边管口进入，从右侧和上侧的三个管口流出。在管路路径上有由通上恒定电流的绕线线圈产生的大小为0.0001T的恒定磁场，磁场方向向上。在磁珠组成的三元复合物在磁场作用下发生偏转，150纳米磁珠的三元复合物从第一个出口流出，800纳米的磁珠三元复合物因为尺寸较大，偏转比较小，从第二个出口流出。从而实现了根据磁珠尺寸实现分组。
(6)分离后进行解离。解离的标记物纳米颗粒进行计数，根据粒径大小的测量用于不同标记物的统计。
检测结果如表3所示。
表3不同初始浓度待检蛋白的检测数据
蛋白
初始浓度
标记物计数数目
换算浓度
准确率
cTnI
75fg/ml
31
72fg/ml
98％
cTnT
500fg/ml
210
485fg/ml
97％
CRP
100fg/ml
42
98fg/ml
98％
PCT
50fg/ml
22
52fg/ml
99％
实施例4
本实施例以肌钙蛋白cTnI，肌钙蛋白cTnT，C反应蛋白(CRP)和降钙素原(PCT)同时检测为例，对本发明的检测方法作进一步的说明。
1、制备多种抗体1标记的免疫磁珠
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnI抗体1(a34600，biospacific)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(150纳米，Ademtech)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获CRP抗体1(K1016，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获肌钙蛋白cTnT抗体1(1C11，HyTest)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
免疫磁珠(800纳米，赛默飞，磁感应强度与150纳米Ademtech磁珠相当)经MES缓冲液置换三次，平衡至溶液pH为4-5、离子强度0.1M。平衡后的溶液中分别加入DMSO溶解的EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)与NHS(N-羟基丁二酰亚胺)各1mg，反应20分钟后离心弃上清；
以所述MES缓冲液复溶弃上清后的沉淀物，加入捕获PCT抗体1(K3b8，Okaybio)，混合包被1小时，然后加入终止剂BSA(牛血清蛋白)至BSA的浓度为1％，终止反应。
2、制备抗体2标记的纳米颗粒
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-50mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnI抗体2(4tc2-20c6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-20mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入CRP抗体2(K1017，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-50mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入cTnT抗体2(9G6，HyTest)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
lmg纳米颗粒(聚乙烯PS微球，200纳米，表面电位-20mV)在浓度为0.1M的PBS溶液中稀释至纳米颗粒的终浓度为0.1mg/mL；然后分别加入EDC与NHS，至EDC与NHS在溶液中的终浓度均为0.2mg/mL，活化30分钟后，离心弃上清。将弃上清之后的沉淀物以所述PBS溶液复溶，加入PCT抗体2(K58w3，Okaybio)，标记25分钟，加入BSA至其浓度为0.5％终止反应。
3.四种蛋白的同时检测
(1)将四种蛋白样本与四种抗体1标记的免疫磁珠混合，在37℃孵育1h；
(2)在磁场(磁场强度0.1T)吸引下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)通过移液枪吸取去除上清液，反复3次；
(3)向其中加入四种抗体2标记的纳米颗粒，在37℃孵育1h；
(4)除去未结合的纳米颗粒：在磁场下，采用含0.02％tween20的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次去除上清液；
(5)磁场作用下的分离
上述混合经过如下图所示的分叉管路，从左边管口进入，从右侧和上侧的三个管口流出。在管路路径上有由通上恒定电流的绕线线圈产生的大小为0.001T的恒定磁场，磁场方向向上。在磁珠组成的三元复合物在磁场作用下发生偏转，150纳米磁珠的三元复合物从第一个出口流出，800纳米的磁珠三元复合物因为尺寸较大，偏转比较小，从第二个出口流出。从而实现了根据磁珠尺寸实现分组。
分离后进行解离。解离的标记物纳米颗粒进行计数，根据电荷的测量用于不同标记物的统计。具体方式为用单粒子表面电位仪进行单粒子电位测量(型号：qNano,Izonscience Ltd.)。
表4不同初始浓度待检蛋白的检测数据
蛋白
初始浓度
标记物计数数目
换算浓度
准确率
cTnI
15fg/ml
7
18fg/ml
96％
cTnT
50fg/ml
23
54fg/ml
97％
CRP
10fg/ml
5
12fg/ml
96％
PCT
50fg/ml
22
52fg/ml
98％
由以上实施例可以看出：本发明方法可以检出常规免疫检测检出下限以下的痕量蛋白，在免疫学检测、微生物检测、细胞分离等领域可广泛应用。本发明通过使用不同的标记物结合不同的待测物的方法，可以检测多个不同待测物的种类和含量，实现多靶标的同时检测。
本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，对这些实施例所进行的同等效果的修改和替换，均落入本发明权利要求的保护范围。