阅读说明：本技术 诊断试剂盒及mak16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用 (Diagnostic kit and application of MAK16 in preparation of early diagnosis reagent for systemic lupus erythematosus ) 是由 叶冬青 凌华志 于 2019-10-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种诊断试剂盒及MAK16在制备系统性红斑狼疮(SLE)早期诊断试剂中的应用,该诊断试剂盒,可用于系统性红斑狼疮疾病的早期诊断,试剂盒包括酶标板、作为抗原的人蛋白质MAK16、包被液、标准血清、酶标试剂、封闭液、样品稀释液,将人蛋白质MAK16包被于酶标板上,通过测定血清中抗人蛋白质MAK16的IgG抗体的光密度,以辅助诊断系统性红斑狼疮。本发明提供了一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒,通过定性检测人血清中抗蛋白质MAK16的IgG抗体的水平,有助于辅助诊断和鉴别诊断SLE；提供的试剂盒用于SLE疾病筛查或初步诊断的特异性为88.12％,敏感性为48.98％；用于SLE疾病鉴别诊断的特异性为86.50％,敏感性为39.50％,可以作为现有SLE诊断标记物的有益补充。(The invention discloses a diagnostic kit and an application of MAK16 in preparation of an early diagnostic reagent of Systemic Lupus Erythematosus (SLE), wherein the diagnostic kit can be used for early diagnosis of systemic lupus erythematosus diseases, and comprises an enzyme-labeled plate, human protein MAK16 serving as an antigen, coating liquid, standard serum, an enzyme-labeled reagent, confining liquid and sample diluent, the human protein MAK16 is coated on the enzyme-labeled plate, and the diagnosis of the systemic lupus erythematosus is assisted by measuring the optical density of an IgG antibody of the human protein MAK16 in the serum. The invention provides a sensitive, safe, reliable and easy-to-operate commercialized kit, which is beneficial to auxiliary diagnosis and differential diagnosis of SLE by qualitatively detecting the level of IgG antibody of anti-protein MAK16 in human serum; the provided kit has 88.12% of specificity and 48.98% of sensitivity when used for SLE disease screening or primary diagnosis; the specificity for the differential diagnosis of SLE diseases is 86.50%, the sensitivity is 39.50%, and the SLE diagnostic marker can be used as a beneficial supplement of the prior SLE diagnostic marker.)

诊断试剂盒及MAK16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中 的应用

技术领域

本发明属于生物科学领域，尤其涉及一种诊断试剂盒及MAK16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种可能损伤全身多系统、多器官的严重威胁人类健康的慢性自身免疫性疾病，在世界各地均有发病，不同性别、种族和地区间存在较大差异，其中亚洲和美洲人的发病率较高(Rees F,et al:Rheumatology(Oxford),2017,56(11):1945-1961)，其在全球平均患病率约为17/10万～48/10万，在中国的患病率约为40/10万～70/10万，男女比例约为1:9，临床上很难治愈，随着病程的迁延或反复发作，可以造成身体各个器官或系统的不可逆性的损伤，其中较常见的损伤有皮肤黏膜、肾脏、血液系统、神经系统、关节(Wu H,et al:Autoimmunity reviews,2017,16(4):391-397)，其它损伤还可见于肝、肺、眼，心、脑等几乎全身所有器官和系统。

目前认为系统性红斑狼疮发生是由遗传、环境、激素等多种因素共同作用的结果(Paley MA,et al:Curr Opin Rheumatol,2017,29(2):178-186)。由于SLE的发病机制复杂，初期病情隐匿，涉及的器官损伤众多，临床早期诊断存在较大难度，且缺乏确切可靠的金标准，需要结合临床症状、体征、病史和实验室检查进行综合诊断。在过去的几十年里，系统性红斑狼疮的诊断、治疗技术和预后虽在不断改善，然而，由于病程易迁延反复且无法预测，临床上仍无法完全治愈等原因，系统性红斑狼疮患者仍承受着沉重的疾病负担，严重影响患者的生活质量。

系统性红斑狼疮的临床表现多样，血清学和免疫学指标变异性很大(Apostolopoulos D,et al:Aust Fam Physician,2013,42(10):696-700)。鉴于大量自身抗体的产生并攻击相应靶抗原，或与靶抗原结合形成免疫复合物，沉积于机体各组织是SLE发病的直接原因，国内外学者一直致力于新的高特异性和敏感性的自身抗体的发现。通过实验室检查，可以在病人血清中发现各种不同免疫球蛋白或抗体的异常升高。因此，系统性红斑狼疮自身抗体诊断标志物的发现具有重要临床应用价值。

理想的系统性红斑狼疮诊断标志物应符合以下条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)存在于体液，特别是血液中，易于检测。近年有文献综述报道，在SLE病人体内已发现100多种自身抗体异常高表达(Yaniv G,et al:Autoimmun Rev,2015,14(1):75-79)。然而，在目前已发现的众多血清免疫学指标中，还没有任何一种指标可以单独达到敏感性和特异性均很高地用于临床SLE的早期诊断。目前，指南推荐及临床上常用的自身抗体有：ANA、anti-dsDNA、anti-Sm、aPL、anti-rib-P、anti-DNP、AHA、AnuA、ANCA等。在已发现的临床常用自身抗体中，ANA能与所有动物的细胞核发生反应，可在SLE等大多混合***疾病(MTCD)中检测出，为SLE的初筛血清学指标；抗dsDNA抗体可出现在SLE发病早期，与SLE关系较密切，随疾病的活动度不同而升降，可在40％-70％SLE患者中检测出；anti-Sm抗体在SLE患者阳性检出率约30％；抗磷脂抗体(aPL)在30％-40％的SLE患者中可检出；抗核糖体P蛋白抗体(anti-rib-P)在SLE病人中的阳性率为15％-35％，与SLE中的神经精神症状伴发症相关(Viana VT,et al:Lupus,2017,26(5):453-462)；抗脱氧核糖核蛋白抗体(anti-DNP)与SLE患者疾病活动性具有一定相关；抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)常与SLE的活动性有关，在SLE患者的阳性率约为21％-25％(Weiner M,et al:Autoimmun Rev,2016,15(10):978-982)。通过对这些常见自身抗体应用价值的分析可以看出，其在SLE的诊断及鉴别诊断，疾病的发生、发展及临床各种表征的出现等方面都有一定作用，但也都存在一些不足，进一步从全蛋白组水平探索未知的SLE高度相关自身抗体具有重要的临床意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种诊断试剂盒，以解决现有技术中的系统性红斑狼疮诊断试剂盒不能实现对SLE的早期高灵敏性、高特异性的诊断的技术性问题。

本发明的第二目的在于提供一种MAK16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用，以解决现有技术中的系统性红斑狼疮诊断试剂盒不能实现对SLE的早期高灵敏性、高特异性的诊断的技术性问题。

为解决上述问题，本发明的技术方案为：

一种诊断试剂盒，用于系统性红斑狼疮疾病的早期诊断，所述试剂盒包括酶标板、作为抗原的人蛋白质MAK16、包被液、标准血清、酶标试剂、封闭液和样品稀释液，其中，所述人蛋白质MAK16包被于所述酶标板上，所述诊断试剂盒通过测定血清中抗人蛋白质MAK16的IgG抗体的浓度，以辅助诊断系统性红斑狼疮。

优选地，所述人蛋白质MAK16是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到的，浓度为50μg/mL。

优选地，所述酶标试剂含HRP标记抗人IgG抗体0.8mg/mL，其中，抗人IgG抗体是由亲和纯化山羊法制备的。

优选地，所述标准血清包括阳性标准血清和阴性标准血清，所述阴性标准血清为已知MAK16抗体为阴性的健康人血清；所述阳性标准血清为已知MAK16抗体为阳性的血清。

优选地，所述封闭液为含3％BSA的0.01mol/L pH7.4磷酸盐-NaCl缓冲溶液(PBS)，即1升溶液中含30g BSA(牛血清白蛋白)、8gNaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O和0.2gKCl。

优选地，所述样品稀释液为0.01mol/L pH7.4的PBS溶液，即1升溶液中包含以下成分：10gBSA、8gNaCl、0.2gKH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2gKCl、1mLTween-20、10mLFBS(胎牛血清)、0.4mLProClin300。

优选地，所述诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质MAK16的IgG抗体，具体是：用纯化的MAK16蛋白包被微孔板，制成固相抗原，向包被的微孔中依次加入待测血清，与HRP标记的抗人IgG抗体结合后，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加TMB溶液显色，TMB在HRP酶的催化下转变成蓝色，并在酸的作用下最终转变成黄色，颜色的深浅和样品中的抗蛋白质MAK16的IgG抗体的水平呈正相关。

本发明还提供了MAK16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用，通过使用该诊断试剂，测定血清中抗MAK16的IgG抗体的光密度，以辅助诊断系统性红斑狼疮。

本发明由于采用以上技术方案，使其与现有技术相比具有以下的优点和积极效果：

1、本发明提供了一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，通过定性检测人血清中抗蛋白质MAK16的IgG抗体的水平，有助于辅助诊断和鉴别诊断SLE。

2、提供的血清生物标志物诊断检测试剂盒用于SLE疾病筛查或初步诊断的特异性为88.12％，敏感性为48.98％；用于SLE疾病鉴别诊断的特异性为86.50％，敏感性为39.50％，可以作为现有SLE诊断标记物的有益补充。

附图说明

图1为SLE患者血清与健康人对照血清光密度值比较的箱式图；

图2为SLE患者与健康人对照血清光密度值比较的受试者工作曲线；

图3为SLE患者与疾病对照血清光密度值比较的箱式图；

图4为SLE患者与疾病对照血清光密度值比较的受试者工作曲线。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明提出的一种诊断试剂盒及MAK16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。

MAK16称为RNA结合蛋白13(RNA binding protein 13,RBM13)，定位于细胞核内，参与RNA剪切、转运、定位、编辑以及mRNA转录后调控等关键过程(Andersen JS,et al:Current Biology Cb,2002,12(1):1-11)。有研究人员通过冷冻电子显微镜观察发现，MAK16参与了核糖体60S大亚基前体的形成及稳定(Kater L,et al:Cell,2017,171(7):1599-1610e14)；还有研究者通过对酿酒酵母的相关研究，认为其参与了酿酒酵母25S和5.8S rRNAs的成熟(Pellett S,et al:Yeast,2006,23(7):495-506)。近些年有研究发现MAK16就是一种含核定位信号、在真核细胞的细胞周期与核糖体60S亚基形成中发挥重要作用的蛋白质，其参与了某些寄生虫体内核酸蛋白的转运(Crisostomo-Vazquez Mdel P,etal:Korean J Parasitol,2014,52(4):429-33)，其余有关MAK16基因及蛋白功能的研究甚少。

目前，尚未发现有将MAK16检测盒作为SLE生物标志物的报道。

因此本发明提出一种诊断试剂盒，用于系统性红斑狼疮疾病的早期诊断，试剂盒包括酶标板、作为抗原的人蛋白质MAK16、包被液、标准血清、酶标试剂、封闭液、样品稀释液，其中，人蛋白质MAK16包被于酶标板上，诊断试剂盒通过测定血清中抗人蛋白质MAK16的IgG抗体的浓度，以辅助诊断系统性红斑狼疮。

优选地，人蛋白质MAK16是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到的，浓度为50μg/mL。

优选地，酶标试剂含辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体0.8mg/mL，其中，抗人IgG抗体是由亲和纯化山羊法制备的。

优选地，标准血清包括阳性标准血清和阴性标准血清，所述阴性标准血清为已知MAK16抗体为阴性的健康人血清；所述阳性标准血清为已知MAK16抗体为阳性的血清。

优选地，还包括酶底物显示液，酶底物显示液为TMB溶液，TMB溶液为单组分显示液。

优选地，封闭液为含3％BSA的0.01mol/L pH7.4磷酸盐-NaCl缓冲溶液(PBS)，即1升溶液中含30g BSA(牛血清白蛋白)、8gNaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O和0.2gKCl。

优选地，样品稀释液为0.01mol/L pH7.4的PBS溶液，即1升溶液中包含以下成分：10gBSA、8gNaCl、0.2gKH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2gKCl、1mLTween-20、10mLFBS(胎牛血清)、0.4mLProClin300。

优选地，还包括洗涤液和终止液，洗涤液为0.01mol/L pH7.4的PBST溶液(磷酸盐-NaCl缓冲液)，PBST溶液内含0.1％Tween-20，即1升溶液中含8gNaCl、0.2gKH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2gKCl和1mLTween-20；终止液为2mol/L H₂SO₄溶液。

优选地，诊断试剂盒采用的是现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质MAK16的IgG抗体，具体是：用纯化的MAK16蛋白包被微孔板，制成固相抗原，向包被的微孔中依次加入待测血清，与HRP标记的抗人IgG抗体结合后，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加TMB溶液显色，TMB在HRP酶的催化下转变成蓝色，并在酸的作用下最终转变成黄色，颜色的深浅和样品中的抗蛋白质MAK16的IgG抗体的水平呈正相关。

本发明还提供了MAK16在制备系统性红斑狼疮早期诊断试剂中的应用，通过使用该诊断试剂，测定血清中抗MAK16的IgG抗体的光密度，以辅助诊断系统性红斑狼疮。

制备该诊断试剂盒以及使用诊断试剂盒的具体方法步骤如下：

1、血清样品的制备

全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于3500rpm离心5-10分钟，取上清即可立即检测，或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有NaN₃,因为NaN₃抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

2、ELISA法中各种缓冲液及试剂的配置方法：

(1)包被液：0.05M pH9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃

(2)封闭液：3％BSA的0.01mol/L pH7.4 PBS溶液

(3)样品稀释液：含BSA和FBS的pH7.4 PBST

(4)洗涤液：0.01mol/L pH7.4 PBST溶液(现配现用)

(5)终止液：2mol/L H₂SO₄溶液(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀)

1、ELISA法测定血清中抗蛋白质MAK16 IgG抗体的光密度(OD)值，以辅助诊断SLE：具体操作步骤如下：

(1)抗原包被：采用包被液稀释50μg/mL的人蛋白MAK16抗原至1μg/mL，使用多通道移液器将稀释后的抗原加入酶标板内，每孔50μL，震板器上震荡约1分钟，后检查每孔是否均有包被液，包被液加入量是否一致，孔底有无气泡，若有气泡，使用移液器进行消泡，室温(湿度20％，25℃)干燥包被过夜，直到液体干燥为止；

(2)洗板：使用多通道移液器向酶标板中加入300μL/孔的洗涤液清洗，静置30秒以上，然后往废液箱甩掉酶标板中的洗涤液；再重复3次此步骤，最后置于吸水纸上拍干；

(3)封闭：使用多通道移液器向酶标板加入封闭液300μL/孔，37℃封闭3～5小时；

(4)干燥处理：甩去封闭液，拍干；室温(湿度20％，25℃)干燥2～3小时；

(5)标准品和样品的稀释(封闭期间准备)：从-80℃冰箱取出血清样本，放置于4℃层析柜冻融2小时左右(具体冻融时间依据样本体积而定)，冻融完成后在冷冻高速离心机上以10000～12000rpm，4℃，离心30分钟。离心完成后，将待测血清样品和标准品按1:500倍用样品稀释液稀释；

(6)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品、酶标试剂，其余各步骤相同)、待测样品孔、阳性对照孔、阴性对照孔，将稀释后的血清加入到各自的抗原测定孔板中，每孔加入100μL；

(7)温育：用封口膜封板后置37℃温育30分钟；

(8)洗涤：小心撕开封板膜，甩去液体，拍干，每孔加满洗涤液300μL，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，拍干；

(9)加酶标试剂：将酶标试剂用样品稀释液按1:10000倍稀释，每孔加入稀释后的酶标试剂100μL，空白孔除外；其中，酶标试剂含HRP酶标记的抗人IgG抗体0.8mg/mL；

(10)温育：用封口膜封板后置37℃温育30分钟；

(11)洗涤：小心撕开封板膜，甩去液体，拍干，每孔加满洗涤液300μL，静置30秒后弃去，重复洗涤6次，拍干；

(12)显色：每孔加入TMB溶液100μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟；

(13)终止：每孔加入终止液50μL，终止反应；

(14)读数测定：以空白孔为零，450nm/620nm波长依序测量各孔光密度(OD值)，最终OD值为该双波长OD值之差。注意：测定应在加终止液后15分钟以内进行。

(15)结果判读：

a.当本实验用于SLE疾病筛查或初步诊断时，其cutoff值为0.104，当OD值＞0.104时判读为SLE阳性，OD值≤0.104时判读为SLE阴性；

b.当本实验用于SLE疾病与其它自身免疫性疾病间的鉴别诊断时，其cutoff值为0.142，当OD值＞0.142时判读为SLE阳性，OD值≤0.142时判读为SLE阴性。

(16)质量控制：

每个检测结果必须符合以下标准：

阳性标准血清OD值≥3.500；

阴性标准血清OD值≤0.080；

如不符合标准，则结果视为无效，必须重新检测。

检验结果的解释：

对294例SLE患者血清、261例健康体检者血清的ROC分析确立了SLE疾病筛查或初步诊断的cutoff值；对200例SLE患者血清、200例其他自身免疫性疾病患者血清的ROC分析确立了SLE与其它自身免疫性疾病间鉴别诊断的cutoff值。

图1为SLE患者血清和健康对照组血清采用本试剂盒时MAK16抗体的光密度值，可看出SLE患者的光密度值明显高于健康对照组，说明本试剂盒可用于SLE疾病筛查或初步诊断；图3为SLE患者血清和患其他疾病对照组血清，采用本试剂盒MAK16抗体的光密度值，可看出SLE患者的光密度值明显高于患其他疾病对照组，说明本试剂盒可用于SLE疾病与其它自身免疫性疾病间的鉴别诊断。

上述在制备诊断试剂盒中需要用到的酶标板购自美国Thermo FisherScientific公司，人蛋白质MAK16购自美国CDI Laboratories公司，HRP酶购自美国JacksonImmunoResearch公司；TMB溶液购自湖州英创。

4、特异性和敏感性检测：

采用755份血清(SLE患者294份、其他自身免疫性疾病患者200份、健康体检人群261份)对本发明的诊断检测试剂盒进行了特异性和敏感性检测(如图2、图4)。采用本发明提出的试剂盒对SLE患者的早期诊断或与其他疾病鉴别诊断，本发明的诊断检测试剂盒用于SLE疾病筛查或初步诊断的特异性为88.12％，敏感性为48.98％(如图2所示，AUC表示受试者工作曲线面积)；用于SLE疾病鉴别诊断的特异性为86.50％，敏感性为39.50％(如图4所示，AUC表示受试者工作曲线面积)。与现有SLE血清诊断标记物相比，可以作为现有诊断标记物的有益补充。

上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。即使对本发明作出各种变化，倘若这些变化属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍落入在本发明的保护范围之中。