阅读说明：本技术 一种鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体及其应用 (Chicken complement receptor 2(ChCR2) monoclonal antibody and application thereof ) 是由 李永清 靳换 孔子萌 江波 许健 刘文晓 宋翠平 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种抗鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体及其应用,本发明以纯化后的ChCR2蛋白片段作为免疫原,免疫小鼠后提取免疫合格的的小鼠脾脏B淋巴细胞,通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,经过筛选和亚克隆技术,获得抗ChCR2单克隆抗体,本发明的抗ChCR2单克隆抗体可以用于检测ChCR2蛋白抗原的生物学检测试剂,并应用在研究鸡B细胞功能的相关检测产品中。(The invention relates to an anti-chicken complement receptor 2(ChCR2) monoclonal antibody and application thereof, wherein a purified ChCR2 protein fragment is used as an immunogen, a mouse spleen B lymphocyte qualified for immunization is extracted after the mouse is immunized, the lymphocyte and a mouse myeloma cell are fused by a cell fusion technology, and an anti-ChCR 2 monoclonal antibody is obtained by screening and subcloning technologies.)

一种鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物制备技术领域，具体涉及一种鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体及其应用。

背景技术

补体受体2(complement receptor 2，CR2)，是一种具有跨膜区的糖蛋白，主要表达在成熟B细胞和滤泡树突状细胞表面，是补体C3裂解片段C3d(g)、IFN-α、EBV-gp350/220以及CD23等的受体，B细胞上CR2的缺失会导致T细胞依赖型抗体反应的丧失。HSV病毒囊膜蛋白gB和gH/gL分别与CR2及其相关的B细胞受体Ig2α结合后，能使病毒快速进入B细胞，并刺激B细胞免疫应答和产生体液免疫。CR2的配体为补体的裂解终产物C3d，因此CR2接受的抗原信号实际上是通过C3d链接的。抗原通过C3d与CR2结合引起CD19/CR2复合物活化，活化的CD19/CR2复合物与CD81发生交联，协同放大细胞内BCR刺激信号。BCR信号传导又是通过下游信号分子和效应分子活性来体现的，最后导致B细胞增殖和功能改变，并与T细胞间发生抗原信号交流，进而继发CTL反应。人的CR2单抗能通过与CR2结合而阻断病毒的入侵，进而起到免疫保护的作用。研究鸡的CR2基因在鸡的疾病及免疫系统中的作用，对临床上评估鸡免疫系统疾病具有指导意义。因此，如何制备一种可以检测ChCR2抗原的单克隆抗体，对研究ChCR2在鸡免疫系统中的作用意义重大。

发明内容

本发明为了解决现有的ChCR2抗原检测技术，本发明提供一种抗鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体及其用途。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

本发明提供了一种用于制备鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体的杂交瘤细胞3E9，该杂交瘤细胞于2020年01月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编100101)，其保藏编号为：CGMCC No.19286。

在一具体的实施方案中，本发明还具体公开了所述ChCR2单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，利用去掉跨膜区的ChCR2(His-CR2-ΔTM)蛋白免疫见实施例1BALB/c小鼠，取免疫合格的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选阳性杂交瘤细胞，通过有限稀释的方法对阳性杂交瘤细胞进行克隆纯化，最后得到特异性分泌抗ChCR2蛋白单一抗原表位的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

如上所述的蛋白免疫为经过四次蛋白免疫；所述的骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞。

在一具体的实施方案中，本发明还提供鸡补体受体2单克隆抗体，该鸡补体受体2单克隆抗体是上述杂交瘤细胞分泌的。

具体制备方法是将上述获得杂交瘤细胞腹腔注射经产BLAB/c雌性小鼠，当小鼠腹部明显增大，采集腹水，进行单抗纯化，获得抗鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体。其中，经产是指怀孕且生过小老鼠的母鼠。

优选地，所述鸡补体受体2单克隆抗体特异性的识别鸡补体受体2的抗原表位，所述抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述抗鸡补体受体2单克隆抗体在用于制备检测鸡补体受体2抗原的相关免疫学检测试剂中的应用。

如上所述的应用，所述检测试剂为ELISA，western blot，IFA、免疫共沉淀、免疫组化以及流式细胞术所用的试剂。

本发明还提供了含有上述鸡补体受体2单克隆抗体的检测试剂或试剂盒。

本发明提供的单克隆抗体在制备鸡补体受体2抗原相关检测产品中的应用，采用本发明制备的抗ChCR2单克隆抗体，特异性的识别组织和细胞中的ChCR2蛋白，实现对表达ChCR2蛋白的组织和细胞进行检测。人的CR2蛋白主要表达于B细胞和滤泡树突状细胞中，而ChCR2蛋白在鸡体内的分布情况是未知的。

本发明的有益效果在于：

本发明首次提供了抗ChCR2蛋白的单克隆抗体，其可特异性的识别并结合ChCR2蛋白上的特定位点的氨基酸序列，特异性高，灵敏性强。包含本发明所述的抗ChCR2单克隆抗体的检测工具可以用于ELISA，western blot，IFA、免疫共沉淀、免疫组化以及流式细胞术的实验技术，并且其还可能用于单链抗体、免疫毒素、免疫复合物以及抗体药物等的制备。

附图说明

图1为单克隆抗体3E9的纯化电泳图；

图2为单克隆抗体3E9间接免疫荧光的鉴定结果；

图3为WB实验鉴定3E9与His-CR2的结合结果图；

图4为ChCR2截短示意图以及3E9识别表位的鉴定；

图5为单克隆抗体3E9与ChCR2抗原结合的反应曲线；

图6为单克隆抗体3E9与其他抗原之间的交叉反应的鉴定结果；

图7为单克隆抗体3E9亚类鉴定结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。本发明公开了一种抗ChCR2单克隆抗体及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当的改进工艺参数实现。特别需要指出的是，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。本发明的方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

下面实施例中所用的材料和试剂的来源如下：骨髓瘤细胞SP2/0为实验室储存；BLAB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；细胞培养板、细胞培养瓶购自Coaster，DMEM/HIGH GLUCOSE(1×)、HT Supplement(100×)购自Gibco，HAT Supplement(50×)、PEG1500、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma，Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B购自invitrogen；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体杂交瘤细胞3E9，已于2020年01月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编100101)，登记编号为CGMCC No.19286。

实施例1BLAB/c小鼠的免疫

(一)质粒的构建

根据ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒步骤，利用同源重组的方法将去掉跨膜区的ChCR2-ΔTM片段连接至pCMV-HA和pET-32a载体中，将构建好的载体命名为pCMV-HA-ChCR2-ΔTM和pET-32a-ChCR2-ΔTM质粒。

(二)抗原的制备

将pET-32a-ChCR2-ΔTM质粒转入Transetta(DE3)表达感受态细胞中，利用IPTG诱导His-ChCR2-ΔTM蛋白表达，考马斯亮蓝染色结果显示His-ChCR2蛋白以包涵体的形式存在。通过提纯包涵体，利用氧化型/还原型谷胱甘肽复性液(浓度分别为0.5mM和5mM)对其进行复性，经浓缩换液之后，获得可溶的，且具有生物学活性的His-ChCR2-ΔTM蛋白，浓度为1mg/mL，液氮速冻后，分装保存于-80℃备用；制备方法同《鸡补体受体2基因克隆、蛋白表达纯化及其多克隆抗体的制备和鉴定》来源：《中国畜牧兽医》2020年第01期201-208.作者：孔子萌；江波；蔡云虹；何后军；李永清；靳换。

将pCMV-HA-ChCR2-ΔTM质粒转入293T细胞中(10cm²细胞培养皿37℃5％CO₂恒温培养箱培养)，24h后取出细胞，PBS涮洗一遍，轻轻将液体吸净，加入500uL含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，将细胞吹下装入1.5mL离心管中，4℃裂解30min，4℃、12000rpm条件下离心15min，收集上清为HA-ChCR2-ΔTM蛋白。

(三)小鼠的免疫

8周龄健康的雌性BLAB/c小鼠5只，使用His-ChCR2-ΔTM蛋白按照如下表1的程序进行免疫，首免后两周进行第二次免疫，之后每次免疫时间间隔一周。第四次免疫后一周眼窝静脉采血，收集血清，使用间接ELISA方法测定小鼠血清效价，评价免疫效果，若血清效价合格，融合前三天进行加强免疫。

表1小鼠免疫程序

实施例2鸡补体受体2分子单克隆抗体的制备

(一)单克隆抗体筛选方法的建立

阳性杂交瘤细胞株的筛选

利用间接免疫荧光方法进行分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株的筛选，实验步骤如下：

在96孔细胞培养板中铺入无菌爬片，将细胞以合适的浓度接种于孔中，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中培养过夜；待细胞密度长至50％-70％时，用LipofectamineTM LTXand PLUSTM Reagents转染试剂将pCMV-HA-CHCR2-ΔTM质粒转染至细胞内；用PBS洗涤细胞一次，轻轻吸弃，加入50μL 4℃预冷的3.7％多聚甲醛，室温固定6-8min，吸弃多聚甲醛，用PBS洗涤3次，每次5min；加入0.1％Triton X-100，室温放置10min，用PBS洗涤3次，每次5min；加入2％BSA溶液，室温封闭30min，用PBS洗涤3次，每次5min；加入细胞上清，每孔100μL，室温孵育1h，同时设立阴阳对照；用PBS洗涤3次，每次5min；用2％BSA稀释相应的二抗，每孔加入100μL，避光，室温孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min；置于荧光显微镜下观察结果。

(二)杂交瘤细胞株的建立

2.1饲养细胞的制备

在组织培养中，单个或少数的细胞不宜生长繁殖，若加入其他活细胞，则可促进这些细胞的生长繁殖，所加入的这种细胞被称为饲养细胞。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。饲养细胞的量一般为2×10⁴个细胞/孔。在融合前一天制备饲养细胞，具体操作如下：

1、将小鼠眼球摘除放血致死，浸泡于75％的乙醇中10min进行体表消毒；

2、将小鼠置于超净工作台中，固定，剪开腹部皮肤，分离皮肤与腹膜，充分暴露腹壁；

3、用无菌的剪刀和镊子在腹膜上剪一小口，用移液管吸取适量的培养基反复冲洗腹腔，以获取足量的饲细胞。

4、将饲养细胞充分混匀后加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃5％CO₂培养箱中备用。

2.2骨髓瘤细胞的制备

融合前一周，复苏骨髓瘤细胞SP2/0细胞，将细胞扩大培养，保证融合时细胞处于对数生长期，状态最佳；融合当天用移液管将细胞轻轻吹下，收集于50mL离心管中，500g离心10min，弃上清，用DMEM培养基重悬后计数备用。

2.3免疫小鼠脾细胞的制备

取实施例1中His-ChCR2-ΔTM蛋白免疫合格的BLAB/c小鼠，采血致死小鼠，分离阳性血清，留作筛选时的阳性对照；将小鼠浸泡于75％的乙醇中进行体表消毒，置于超净工作台，固定。剪开小鼠右侧皮肤，腹膜，可见小鼠脾脏；用灭菌过的剪刀和镊子，无菌取出脾脏，放入含有DMEM培养基的无菌平皿中漂洗几次；将脾脏转入新的无菌平皿中，用注射器将脾细胞冲洗出来。反复操作数次，直至脾脏变成透明的薄膜为止；将脾细胞500g离心10min，弃上清，用DMEM培养基重悬后计数备用。

2.4细胞融合

1、分别取1×10⁸个2.3中获得的免疫小鼠脾细胞和2×10⁷个2.2的SP2/0骨髓瘤细胞加入50mL离心管中，轻轻混匀，500g离心10min；

2、弃上清，将离心管倾倒，尽可能除去剩余液体，用手指轻弹管底，避免细胞贴在管壁上；

3、缓慢向离心管中加入PEG1500融合剂，约在60s内加完，静置1min；

4、沿着离心管壁缓慢滴加1mL DMEM，约1min或稍长，然后在5min之内缓慢加入20mL DMEM，终止PEG 1500融合剂的作用；

5、将融合细胞500g离心10min，弃上清，加入40mL HAT选择培养基悬浮沉淀细胞，将悬浮细胞加入96孔细胞培养板，每孔100μL，置于CO₂培养箱中培养；

6、7-10天后换HT培养基，14-17天后换成正常的DMEM培养基。

2.5阳性杂交瘤细胞的筛选

待融合的细胞克隆生长到覆盖细胞板孔底1/2时，用上述(一)中建立好的间接免疫荧光方法对所有细胞克隆生长的培养孔上清进行检测，将检测为阳性孔的细胞进行亚克隆和扩大培养。阴性孔2天之后再一次检测，重复一次，若仍为阴性则弃掉。总共筛选得到3株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为3E9、3F9和4E5。

2.6阳性杂交瘤细胞的亚克隆—有限稀释法

有限稀释法亚克隆具体步骤如下：

1、亚克隆的前一天制备饲养细胞，方法如前所述。将2.5中检测为阳性孔的细胞用吸管轻轻吹吸使细胞分散混匀，将细胞悬液进行一定倍数的稀释，混匀并计数；

2、用HT选择培养基将阳性克隆的杂交瘤细胞稀释至0.5个/200μL；

3、将稀释好的细胞悬液加到含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔200μL；

4、每天观察细胞的生长情况，在第四天时用正常的DMEM培养基半量换液，待亚克隆细胞长至孔底1/2时，检测有细胞克隆孔的上清液；

5、选择仅有一个细胞克隆生长的孔再次进行亚克隆，直至所有克隆阳性率达到100％；

6、获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，及时扩大培养并冻存。

2.7细胞的冻存与复苏

1、细胞的冻存：选择处于对数生长期的杂交瘤细胞3E9，轻轻地将细胞从瓶壁上吹下；500g离心10min，弃上清；用细胞冻存液将细胞沉淀悬浮，分装于细胞冻存管中，1mL/管，加盖封严，注明细胞名称，代次及日期；将细胞放入冻存盒中置于-80℃冰箱过夜，再将其移入液氮管中长期保存；

2、细胞的复苏：从液氮管中取出冻存细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其快速溶化；500g离心3min，弃上清；用含有20％胎牛血清的DMEM培养液将沉淀悬浮，加入细胞瓶中，置CO₂培养箱内培养。

由于单克隆抗体3E9的ELISA效价最高，因此将获得的杂交瘤细胞3E9于2020年01月10日保藏在地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记编号为CGMCC No.19286。

2.8单克隆抗体的大量制备

使用体内诱生腹水法进行腹水的制备，具体步骤如下：1、选择经产BLAB/c的雌性BLAB/c小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡油0.5mL/只；

2、选择处于对数生长期的杂交瘤细胞，将其轻轻的吹下来，1000rpm离心10min，弃上清，用PBS重新悬浮，计数备用；

3、每只小鼠腹腔注射5×10⁵-1×10⁶个杂交瘤细胞；

4、经7-10天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水；

5、将小鼠腹水3000rpm离心10min，收集上清，-20℃保存备用。

(三)腹水的纯化

取适量腹水按照Thermo protein A/G纯化系统进行单抗的纯化，操作步骤如下：

1、先取出column和所有溶液恢复到室温(Binding buffer/Elute buffer)，另准备1M Tris buffer pH8.0和2％的叠氮化钠。单抗纯化步骤在常温下进行即可；

2、首次填柱时，加入10mL填料，即5mL树脂珠。并流穿5倍柱体积Binding buffer。若是第二次纯化，从4℃中取出填好的柱子，用水流穿之后，用Binding buffer调零至280nm读数稳定为止；

3、取3mL腹水解冻，加入等体积的DMEM培养基颠倒混匀，再于此混匀液之中加入等体积的Binding buffer，颠倒混匀12000rpm离心10min，再用0.22μm过滤器过滤一遍。全部经过纯化柱流穿一遍，并循环数分钟，待280nm读数稳定；

4、15倍柱体积Binding buffer除杂，至280nm读数稳定；

5、Elute buffer洗脱单抗，读数开始上升时开始接样，到达第一个280nm读数峰之后开始下降，直至初始数值。此阶段280nm读数峰顶接样记为P1，立即加入1M Tris bufferpH8.0调节pH；之后280nm读数会在初始数值附近稳定一段时间，此阶段接样记为linker，调节pH；自此之后，读数骤然上升，比第一个峰数值高出数十倍，然后下降，一直到读数降至初始读数，此阶段280nm读数峰顶接样记为P2，调节pH；

6、按将纯化洗脱峰1(P1)、纯化洗脱峰2(P2)进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝法染色后观察纯化结果；结果如图1所示，图中标号1：纯化洗脱峰1(P1)；标号2：纯化洗脱峰2(P2)，结果表明纯化的单克隆抗体较纯，有明显的重链和轻链条带，分别为55kD和25kD。

7、用12倍柱体积清洗柱子，再使用0.02％叠氮化钠水溶液置换数倍柱体积之后，将柱子和溶液置于4℃保存；

8、纯化后的抗体超滤管4℃2990rpm离心60min左右，分次将液体离心完，用PBS进行换液，换液2-3次，每次离心尽量离完液体。超滤管下层液体去皮测纯化后抗体浓度，即测得抗鸡补体受体2单克隆抗体3E9浓度为1.44mg/mL，用终体积0.02％叠氮钠或者终浓度50％甘油保存于-20℃。

实施例3鸡补体受体2分子单克隆抗体的鉴定

1腹水中单克隆抗体效价的测定

用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将His-ChCR2-ΔTM蛋白(实施例1)稀释为4μg/L，包被酶标板，100μL/孔，37℃孵育2h后置于4℃过夜；使用BIO-RAD洗板机进行洗涤(程序为300μL/孔，洗5次)；加入封闭液(含5％的脱脂乳溶液)，200μL/孔，37℃封闭2h，洗涤同上；用PBS将单克隆抗体(实施例2中纯化后获得的单克隆抗体(1.44mg/mL))进行稀释(从1:16000开始倍比稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；用PBS将辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG按工作浓度(1:10000)稀释，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；每孔加底物溶液(TMB)100μL，避光显色15min；每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，酶标仪测定各孔OD450值。结果如表2，三株单克隆抗体效价分别为1.024×10⁶、2.56×10⁵和2.56×10⁵。单抗3E9的效价最高，因此选择3E9进行后续实验的鉴定。

表2单克隆抗体的效价

2间接免疫荧光实验

在24孔细胞培养板中铺入无菌爬片，将DF-1细胞以合适的浓度接种于孔中，置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养过夜；待细胞密度长至50％-70％时，用LipofectamineTMLTX and PLUSTM Reagents转染试剂将pCMV-HA-ChCR2-ΔTM质粒(制备方法见实施例1)转染至细胞内；用PBS洗涤细胞一次，轻轻吸弃，加入200μL 4℃预冷的4％多聚甲醛，室温固定10min，吸弃多聚甲醛，用PBS洗涤3次，每次5min；加入0.1％Triton X-100，室温放置10min，用PBS洗涤3次，每次5min；加入2％BSA，室温封闭30min，用PBS洗涤3次，每次5min；用2％BSA稀释相应的抗体记作一抗(抗His-ChCR2-ΔTM蛋白鼠多克隆阳性血清，HA-tag鼠单克隆抗体，实施例2中制备的单克隆抗体3E9，鼠阴性血清)，每孔加入200μL，放入湿盒，室温孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min；用含2％的BSA溶液稀释Alexa-fluor-488标记的山羊抗鼠IgG(H+L)F(ab’)2作二抗，每孔加入200μL，放入湿盒，避光，室温孵育1h，用PBS洗涤3次，每次5min；加入DAPI染色液，室温孵育10min，用PBS洗涤3次，每次5min；置于荧光显微镜下观察并拍照。结果如图2所示，图中A：单克隆抗体3E9，B：HA标签抗体对照，C：阳性血清对照，D：阴性血清对照；结果显示单克隆抗体3E9、阳性血清，HA标签抗体都可以与HA-ChCR2-ΔTM蛋白进行特异性的反应，产生较强的荧光，阴性血清则无荧光。

3免疫印迹实验鉴定

分别将实施例1制备获得的HA-ChCR2-ΔTM和His-ChCR2-ΔTM蛋白按照常规的方法进行SDS-PAGE；将PAGE胶上的蛋白转到PVDF膜上；用5％脱脂乳封闭PVDF膜；洗涤之后孵育制备好的实施例2中纯化获得的单克隆抗体3E9；洗涤之后孵育HRP标记的羊抗鼠IgG；洗涤之后显色曝光。结果如图3所示，图3为WB实验鉴定单克隆抗体3E9分别与His-CR2 HA-CR2蛋白的结合，结果显示：单克隆抗体3E9可以分别与HA-ChCR2和His-ChCR2蛋白进行特异性的结合。

4识别抗原表位的鉴定

将ChCR2按照其结构域进行截短，分别命名为SCR1、SCR1-2、SCR1-3、SCR1-4、SCR2-5、SCR3-5、SCR4-5、SCR5(SCR1代表ChCR2结构域SCR1、SCR1-2代表ChCR2结构域SCR1+SCR2、SCR1-3代表ChCR2结构域SCR1+SCR2+SCR3、SCR1-4代表ChCR2结构域SCR1+SCR2+SCR3+SCR4、SCR2-5代表ChCR2结构域SCR2+SCR3+SCR4+SCR5、SCR3-5代表ChCR2结构域SCR3+SCR4+SCR5、SCR4-5代表ChCR2结构域SCR4+SCR5、SCR5代表ChCR2结构域SCR5)，并将其克隆到pEGFP-N2质粒中，将质粒转到293T细胞中，24h裂解细胞获得重组蛋白，利用WB实验检测各段重组蛋白与单克隆抗体3E9的反应，结果如图4中的A所示，结果显示，单克隆抗体3E9分别可以与SCR2-5，SCR3-5和SCR4-5进行反应，表明单克隆抗体3E9识别的抗原表位位于SCR4-5之间。随后将SCR4-5进行截短，分别命名为SCR4-5-1、SCR4-5-2、SCR4-5-3和SCR4-5-4，并将各个片段克隆到pEGFP-N2质粒中，将质粒转到293T细胞中获得重组蛋白，利用WB实验鉴定各段重组蛋白与单抗3E9的反应，结果如图4中的A所示，可看出单克隆抗体3E9可以与SCR4-5-3进行反应，表明单克隆抗体3E9识别的抗原表位位于230aa-280aa和250-300aa区间，由此推断，单克隆抗体3E9所识别的抗原表位在ChCR2 250aa-280aa之间。将250-280aa进行截短，最终确定3E9所识别的抗原表位位于第258-269位氨基酸，序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ IDNO:1CKEISCVFPEVQ，结果如图4中的B所示。

5亲和力的鉴定

将ChCR2蛋白进行8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL 2×递进稀释，将实施例2中获得的单克隆抗体3E9进行10μg/mL，5μg/mL，2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.3125μg/mL，0.15625μg/mL，0.078μg/mL，0.039μg/mL，0.0195μg/mL，0.00975μg/mL，0.00488μg/mL，测定这四种浓度抗原包被以及12种抗体稀释条件下的抗体与抗原结合反应曲线，结果如图7所示。四种抗原浓度之比为1:2:4:8，通过作图法取每种抗原浓度最大OD450值一半(即50％OD)处对应的抗体浓度，代入公式Kaff＝(n-1)/2(n Ab’-Ab)，计算亲和常数，式中的Ab和Ab’分别表示当抗原浓度为Ag和Ag’时产生半数吸光值的抗体浓度(mol/L)，n＝Ag/Ag’，然后两两比较，当n＝2时，可得到3个Kaff值；当n＝4，时可得到2个Kaff值；当n＝8时，可得到1个Kaff值；最终结果为求出六个Kaff值的平均数，Kaff(3F9)＝2.82×10⁹。结果表明单克隆抗体3E9对抗原ChCR2有较高的亲和力。

6抗原交叉反应的鉴定

分别用His-gD、His-VP2、GST、His-C3d以及His-ChCR2-ΔTM蛋白(北京市农林科学院实验室保存提供)作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA实验，蛋白包被浓度以及抗体稀释浓度参考实例3中1，检测单抗与这些抗原是否有交叉反应，结果如图6所示，实验结果表明单克隆抗体3E9与其它几种蛋白抗原反应的OD450值均远小于阳性对照及阴阳临界值，说明本发明制备的单克隆抗体3E9与其它几种抗原无交叉反应。

7亚类的鉴定

步骤按照IsoQuickTMStrips and Kits for Mouse Monoclonal Isotyping试剂盒说明书进行实施例1中获得的单克隆抗体3E9亚类的鉴定，具体操作步骤如下：

将装有试纸条的容器放在室温下平衡10min；350μL的杂交瘤细胞上清放入2mL冻存管中；将IgG亚类鉴定试纸条、IgA/IgM鉴定试纸条、轻链分型试纸条放入装有杂交瘤细胞上清的2mL冻存管中；反应5min之后鉴定结果如图7所示，结果表明单克隆抗体3E9为IgG2b亚类，轻链为Kappa型。

8杂交瘤细胞分泌单克隆抗体稳定性的检测

将杂交瘤细胞系3E9分别隔1个月和3个月从液氮罐中取出复苏，然后进行间接ELISA鉴定，检测杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的活性。结果表明：两次复苏杂交瘤细胞株3E9均能稳定生长，单克隆抗体3E9分泌水平不变，说明杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的活性没有降低。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种鸡补体受体2(ChCR2)单克隆抗体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 抗原表位(epitope)

<400> 1

Cys Lys Glu Ile Ser Cys Val Phe Pro Glu Val Gln

1 5 10