阅读说明：本技术 一种絮凝酵母生物粘合剂及其制备和使用方法 (Flocculation yeast biological adhesive and preparation and use method thereof ) 是由 刘晨光 冯颀 张家威 于 2020-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种絮凝酵母生物粘合剂及其制备和使用方法,涉及生物粘合剂领域,包括蛋白质、多糖和絮凝酵母活细胞,其中,蛋白质含有贻贝蛋白多巴(Dopa),絮凝酿酒酵母包括酿酒酵母S.cerevisiae SPSC01、S.cerevisiae 6525Flol和S.cerevisiae 4126Flol中的一种或多种；其制备方法包括活化、培养、收集和混合；液态适合原位使用；固态适合长期保存和运输。Dopa赋予该粘合剂较强的粘合效能,絮凝酵母用于调整粘合强度,同时活性细胞使该粘合剂可以在粘合后的一段时间继续进行生化反应。该生物粘合剂生物粘合性能好,且具有防水、低刺激及抗菌的性能,能减少甲醛释放。(The invention discloses a flocculation yeast biological adhesive and a preparation and use method thereof, relating to the field of biological adhesives, comprising protein, polysaccharide and flocculation yeast living cells, wherein the protein contains mussel protein Dopa (Dopa), and the flocculation saccharomyces cerevisiae comprises one or more of saccharomyces cerevisiae S.cerevisiae SPSC01, S.cerevisiae 6525Flol and S.cerevisiae 4126 Flol; the preparation method comprises activating, culturing, collecting and mixing; the liquid state is suitable for in-situ use; the solid state is suitable for long-term storage and transportation. The Dopa imparts a strong binding efficiency to the binder, and the flocculating yeast serves to adjust the binding strength while the living cells allow the binder to continue biochemical reactions for a period of time after binding. The biological adhesive has good biological adhesion performance, waterproof, low-irritation and antibacterial performances, and can reduce formaldehyde release.)

一种絮凝酵母生物粘合剂及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及生物粘合剂领域，尤其涉及一种絮凝酵母生物粘合剂及其制备和使用方法。

背景技术

甲醛和尿素缩合能够形成脲醛树脂，也就是所谓的树脂胶。因为原料价格低廉，这类胶的使用范围十分普遍，主要应用在木质板型材料的制作中。脲醛树脂含有未反应的甲醛，其位于人造板材各个部分，而深层的甲醛释放是一个缓慢的、连续的过程，引发了室内建筑材料及办公用具中甲醛污染的问题。居于室内的人们很容易长期接触甲醛，对人体健康有诸多不利。因此从环保角度考虑，出现不释放甲醛的生物粘合剂来部分代替脲醛树脂。

生活在海洋中的贻贝通过分泌贻贝蛋白，将自身迅速、牢固的粘附在礁石上，有效的防止自身被海浪冲走。从化学组成看，贻贝黏附蛋白中良好的抗湿粘性来自于蛋白中特有的多巴(Dopa)。Dopa是络氨酸在络氨酸羟化酶的催化作用下产生的一种转录后修饰的氨基酸，其侧基中的儿茶酚基具有化学多功能性和亲和多样性。在碱性的海水中，Dopa被氧化成多巴醌，无论是Dopa还是多巴醌都能在有机、无机和金属表面形成键交联以及非键交联，因此Dopa是界面黏附的关键。贻贝黏附蛋白作为一种天然的蛋白，具有优异的防水黏附性能以及良好的生物相容性，不会引发人体免疫反应。因此，在船舶防水密封和船底防护漆、生物医药领域中的组织快速缝合医用粘合剂、建筑装修领域的家用粘合剂等方面有着广泛的应用前景。然而采用生物提取方法制备贻贝黏附蛋白价格昂贵，限制了生物粘合剂的应用。一方面贻贝黏附蛋白提取费用高，比如一种由翡翠贻贝中提取黏附蛋白，具有良好生物相容性的防水生物粘合剂的方法，作为从生物中直接提取制备黏附蛋白，成本有所降低，但是其制备的黏附蛋白作为粘合剂的原料来说还是比较贵。另一方面，如果不采用贻贝黏附蛋白来生产生物粘合剂，使用生物材料和化学材料的结合来制造生物粘合剂，在成本降低的同时又会引入其他污染。比如由结构蛋白(胶原蛋白、明胶等)和单宁酸进行迈克尔加成反应，经过后续处理，再通过转谷氨酰胺酶(TG)交联制得的生物粘合剂，由于引入非生物的化学物质，对环境有一定的污染，对人体有一定刺激。

因此，急需一种低成本、环保、无毒且效果佳的生物粘合剂。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种低成本、效果佳的生物粘合剂，部分取代脲醛树脂，且对环境无污染，对人体无刺激。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种低成本、具有防水性、具有较好的生物粘合性能、低刺激性的并且环保的生物粘合剂。为实现上述目的，本发明提供了一种含有絮凝酵母的生物粘合剂，不仅具有较好的生物粘合性能、防水性、低刺激性及抗菌作用，还能够按照一定比例与以脲醛树脂为主要成分的传统粘合剂混合，减少脲醛树脂的使用量，从而减少甲醛的释放。更重要的是，由于该粘合剂内含活性絮凝酵母细胞，能够通过细胞代谢在短期内(几天)将粘合剂中残留的甲醛吸收分解成安全环保的二氧化碳和水，从而在源头上就可以解决甲醛缓慢释放的问题。

一种絮凝酵母生物粘合剂包括蛋白质、多糖和絮凝酵母活细胞，其中，蛋白质含有贻贝蛋白多巴(Dopa)，所述絮凝酵母包括酿酒酵母S.cerevisiae SPSC01、酿酒酵母S.cerevisiae 6525Flol和酿酒酵母S.cerevisiae 4126Flol中的一种或多种。酿酒酵母SPSC01为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Lindner 2.1461)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 2.607)的融合株，于2001年5月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国，北京)，登录号CGMCC0587。

进一步地，蛋白质中贻贝蛋白多巴(Dopa)的含量超过30％。

进一步地，酿酒酵母S.cerevisiae 6525Flol是采用基因工程的手段将FLO-spsc基因导入絮凝酵母S.cerevisiae 6525(ATCC编号4006525)获得的；酿酒酵母cerevisiae4126Flol是采用基因工程的手段将FLO-spsc基因导入絮凝酵母S.cerevisiae 4126(ATCC编号4004126)获得的。

进一步地，生物粘合剂包括液态生物粘合剂和固态生物粘合剂。

本发明还提供了一种含有絮凝酵母的生物粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤1)活化：取絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)冻存液接种到种子培养液中进行活化，获得活化絮凝酿酒酵母；

步骤2)培养：当步骤1)获得的活化絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在细胞生长达到中后期时，转接至改良的发酵培养液重，在发酵罐中培养，得到培养絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

步骤3)收集：当步骤2)获得的培养絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的细胞达到生长中期时，收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞，得到发酵絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

步骤4)混合：将步骤3)获得的发酵絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，与Dopa含量丰富的蛋白质和多糖的溶液混合均匀，制成液态生物粘合剂；将步骤3)获得的发酵絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，冷冻干燥得到细胞干粉，将细胞干粉与所述Dopa含量丰富的蛋白质和多糖的混合干粉混合均匀，制成固态生物粘合剂；其中絮细胞干粉与混合干粉的质量比1：20至1：50，混合干粉的成分为酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、甘露糖和Dopa含量丰富的蛋白质。

进一步地，絮凝酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)包括酿酒酵母S.cerevisiae SPSC01、酿酒酵母S.cerevisiae 6525Flol和酿酒酵母cerevisiae4126Flol中的一种或多种。

进一步地，步骤2)中种子培养液是YPD种子培养液，其配方是质量含量为1％的酵母膏，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖；步骤3)中改良的发酵培养液的配方是在YPD种子培养液的基础上额外添加Dopa含量丰富的蛋白质和甘露糖，其中所述Dopa蛋白的质量分数为0.1％-20％，甘露糖的质量分数为0.1％-10％。

进一步地，步骤4)中Dopa含量丰富的蛋白质中Dopa的质量含量超过30％。

本发明还提供一种含有絮凝酵母的生物粘合剂的使用方法，液态生物粘合剂适合原位生产使用，液态生物粘合剂的使用方法是直接粘合；固态生物粘合剂适合长期保存和长途运输，固态生物粘合剂的使用方法：将固态生物粘合剂与改良发酵液以质量比1：20～50搅拌均匀，于20～30℃下放置培养1～4h后，得到混合物，收集所述混合物进行使用，所述混合物的成分为絮凝酵母细胞、Dopa含量丰富的蛋白质及多糖。

进一步地，改良发酵培养液配方是在YPD种子培养液的基础上额外添加Dopa含量丰富的蛋白质和甘露糖，其中所述Dopa蛋白的质量分数为0.1％-20％，甘露糖的质量分数为0.1％-10％。

进一步地，一种含有絮凝酵母活性细胞的生物粘合剂，其主要包含贻贝蛋白多巴(Dopa)。

进一步地，絮凝酵母SPSC01为栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombeLindner 2.1461)和酿酒酵母(Sacchadromyces cerevisiae 2.607)的融合株，于2001年5月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，登录号为CGMCC 0587(被专利CN1436851A所公布)。

进一步地，絮凝酵母6525Flol是采用基因工程的手段将FLO-spsc基因导入酿酒酵母S.cerevisiae 6525(ATCC编号4006525)获得的。

进一步地，絮凝酵母4126Flol是采用基因工程的手段将FLO-spsc基因导入絮凝酵母S.cerevisiae 4126(ATCC编号4004126)获得的。

进一步地，絮凝酿酒酵母相比于游离酿酒酵母，其表面具有粘附作用的蛋白，絮凝因子(Flocculin)和协助粘附的胞外多糖，因此表面更粗糙，比表面积更大。

进一步地，Dopa含量丰富的蛋白质的提取方式包括以下步骤：

步骤a：取活的海洋贻贝足部，预处理后切碎并进行匀浆；

步骤b：处理后的匀浆液离心，分离出上清液，向其中加入高氯酸(PCA)，搅拌后离心，回收上清液；

步骤c：上清液在冰乙醇中冷却，搅拌时加入浓硫酸酸化，酸化后的混合液中加入丙酮；

步骤d：静置一段时间后离心，弃上清液，取沉淀物溶于乙酸中，在离心，取上清液并冻干，即得到Dopa含量丰富的蛋白质干粉。

进一步地，液态生物粘合剂和固态生物粘合剂两种形态适合于不同的应用场合；液态生物粘合剂适合原位生产使用，不经过复杂的后续加工，维持高的细胞活性和生物粘合剂活性，成本低廉；固态生物粘合剂由于进行脱水处理，能经过长期保存和长途运输，使用前仍需加水活化，为了更好的粘合效果，常常将活化用的水替换为改良发酵液来活化，混合培养约2h后达到生长中期，使得酵母细胞的转化活性能够更好的发挥。

本发明的絮状酵母生物粘合剂中Dopa赋予该粘合剂较强的粘合效能，絮凝酵母用于调整粘合强度，同时活性细胞使该粘合剂可以在粘合后的一段时间继续进行生化反应。不仅具有较好的生物粘合性能、防水性、低刺激性及抗菌作用，还能够按照一定比例与以脲醛树脂为主要成分的传统粘合剂混合，减少脲醛树脂的使用量，从而减少甲醛的释放。更重要的是，由于该粘合剂内含活性絮凝酵母细胞，能够通过细胞代谢在短期内(几天)将粘合剂中残留的甲醛吸收分解成安全环保的二氧化碳和水，从而在源头上就可以解决甲醛缓慢释放的问题。

在本发明的较佳实施方式实施例1中，详细说明Dopa含量丰富的蛋白质的提取方式。

在本发明的另一较佳实施方式实施例2中，详细说明絮凝酵母生物粘合剂的制备过程。

在本发明的另一较佳实施方式实施例3中，详细说明液态生物粘合剂或者活化后的固态生物粘合剂用来制备三合板。

在本发明的另一较佳实施方式实施例4中，详细说明絮凝酵母生物粘合剂降解甲醛的

具体实施方式

。

与现有技术相比，本发明的生物粘合剂含有絮凝酵母，一方面酵母代谢酵母代谢甲醛生成二氧化碳和水，不会带来甲醛的二次释放。因而，利用酵母细胞能够有效吸收并且去除甲醛气体；另一方面，絮凝酵母有利于产品降低成本，絮凝酵母目前主要应用于乙醇发酵，由于其能够在发酵过程中自动絮凝形成细胞团快与发酵产物分离，大大节约了产品纯化所需要的成本；同时絮凝特性也使得酵母细胞分泌的胞外多糖和蛋白大大高于普通游离细胞。酵母细胞表面的糖蛋白与相邻细胞表面的残糖基形成氢键，从而将不同的细胞连接起来。已证实絮凝受到FLO相关基因的调控，通过调控FLO1、FLO5、FLO11基因的表达可以调控酵母细胞的絮凝与解絮。其中，flo1型的絮凝酵母的絮凝主要是基于其表面的甘露糖残基和蛋白质间能够形成氢键。

本发明具有如下的有益效果：

1.酿酒酵母SPSC01、6525Flol和4126Flol能够自发絮凝，细胞收集过程能耗低，环境友好。且这三株菌是目前构建出的能够用于工业生产的絮凝酿酒酵母，菌株的絮凝特性稳定，能够用于工业生产，获取大量的酵母细胞。

2.絮凝酿酒酵母的表面有粘附蛋白，表面粗糙，与游离酿酒酵母细胞相比有更大的比表面积，从而使得更多的表面羟基团暴露，拥有越高的表面能。因此与游离酵母相比，絮凝酿酒酵母细胞的表面能够产生更高的热力学反应潜力，更有利于酵母细胞黏附其他的物质，增大使用时粘合剂的粘性。

3.本发明直接使用活酵母细胞而非酵母组分提取液，在降低提取有效物质过程的成本同时，保持细胞的活性使其能改完成多种生化反应，如脱除甲醛的功能。

4.絮凝酿酒酵母细胞表面富含羟基、醛基等还原性基团，能够结合并还原材料表面的高价态重金属离子。

5.在家装过程中使用絮凝酵母的生物粘合剂能够从源头上减少由普通化学粘合剂所带来的甲醛等对人体有害的气体，同时也能实现对空气中甲醛的有效代谢和吸收，转化为二氧化碳，过程环保高效。

6.本发明的生物粘合剂中活细胞含量富集，使得絮凝酿酒酵母的脱除甲醛毒性、吸附还原重金属离子、抑杂菌等作用增强。

7.固态生物培养基的使用方法为将细胞干粉与改良的发酵培养基按一定的比例混合培养约2h后达到生长中期，使得酵母细胞的转化活性能够更好的发挥。而平时保持干粉状态，有利于保存更长的时间。

8.通过基因工程手段改造过后的絮凝酵母能够提高其的粘合性以及对甲醛的降解能力。

9.酵母本身具有啤酒或面包的芳香，提升了该粘合剂的感官接受度。酵母自身的生物安全性较高，不存在任何潜在的微生物风险，使用后容易安全分解，不影响粘合的效果。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例2的絮凝酵母生物粘合剂的制备流程图；

图2是本发明的一个较佳实施例5的絮凝酵母生物粘合剂降解甲醛的过程示意图；

其中，1-发酵罐；2-搅拌桨；3-絮凝酵母；4-Dopa蛋白；5-絮凝酵母活性细胞；6-脲醛树脂。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1Dopa含量丰富的蛋白质的提取方式：

取活的海洋贻贝足部，用-5℃至0℃的PBS冲洗后，在-5℃至0℃的含蛋白酶抑制剂的5％醋酸溶液中切碎，用分散机将上述物质切碎，混合液在冰上匀浆；

处理后的组织匀浆液离心，分离出上清液，将上清液冰浴同时缓慢向其中加入60％高氯酸(PCA)至终浓度为1％，搅拌20-40分钟后离心，回收上清液；

上清液在-10℃至-20℃冰乙醇中冷却，在搅拌时加入浓硫酸酸化至终浓度为0.3mmol/L，酸化后的混合液中逐滴滴加两倍体积的-82℃至-86℃的丙酮；

静置20-30分钟后离心，弃上清液，取沉淀物溶于5％乙酸中，再离心，取上清液并冻干，即得到Dopa含量丰富的蛋白质干粉。

实施例2絮凝酵母生物粘合剂的制备

絮凝酵母生物粘合剂的制备如图1絮凝酵母生物粘合剂的制备流程图所示，絮凝酿酒酵母通过发酵罐1进行工厂生产，发酵罐1的罐体上设置有挡板、通气和搅拌浆2。培养好的絮凝酿酒酵母3可以制备成两种形式的生物粘合剂，分别是液态和固态。当细胞经过沉降，可以得到液态生物粘合剂；当细胞制成干粉后，与Dopa含量丰富的蛋白质和多糖的混合干粉混合，制成固态生物粘合剂。

一、液态絮凝酵母生物粘合剂的制备过程：

从-80℃的冰箱中取絮凝酿酒酵母冻存液，接种到YPD种子培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，115℃灭菌15分钟)中进行活化；

当活化的絮凝酿酒酵母细胞生长达到中后期时，1％转接活化的种子培养液至改良的发酵培养液(在YPD种子培养液中额外添加甘露糖，并灭菌)中培养；

当培养的絮凝酿酒酵母细胞达到生长中期(换用EDTA水解液解絮后测得的OD600值约为2.0)时，收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞，将其与Dopa含量丰富的蛋白质混合均匀，制成液态粘合剂。

二、固态絮凝酵母的生物粘合剂

从-80℃的冰箱中取絮凝酿酒酵母冻存液，接种到YPD种子培养液(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，115℃灭菌15分钟)中进行活化；

当活化的絮凝酿酒酵母细胞生长达到中后期时，1％转接活化的种子培养液至改良的发酵培养液(在YPD种子培养液中额外添加甘露糖，并灭菌)中培养；

当培养的絮凝酿酒酵母细胞达到生长中期(换用EDTA水解液解絮后测得的OD600值约为2.0)时，收集发酵罐下层的絮凝酿酒酵母细胞，使用冻干机将酵母制成干粉；

将絮凝酿酒酵母细胞干粉与Dopa含量丰富的蛋白质和多糖的混合干粉搅拌均匀制成固态生物粘合剂，其中絮凝酿酒酵母细胞干粉与Dopa含量丰富的蛋白质和多糖的混合干粉质量比1：20至1：50，混合干粉的成分为酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、甘露糖和含Dopa的蛋白质。

实施例3液态生物粘合剂或活化后的固态生物粘合剂用来制备三合板

用旋切机将木段材料旋切成1-2mm的单板，并用热风炉将所述单板烘干至含水量为10-12％，将碳纤维粉末与液体耐磨橡胶按0.05-0.1:1的重量比混合均匀，得耐磨涂层；

将上述耐磨涂层均匀涂布在制得的单板上，并自然风干，所述耐磨涂层用量为100-200g/m²；

用涂胶机将粘胶剂涂在制得的单板的两面，絮凝酵母生物粘合剂用量为280-300g/m²，絮凝酵母生物粘合剂为液态生物粘合剂或活化后的固态生物粘合剂，涂胶后进行组坯，按木材纹理结构将涂胶后的单板纵横交错排列粘合在一起，得板坯；

将上述板坯在25-30℃下、0.1-0.2MPa压力下预压30-40min，接着转入热压机中于120-140℃下、0.1-0.2MPa压力下热压1-1.5min/mm，冷却，砂光，即得所述三合板。

实施例4絮凝酵母生物粘合剂降解甲醛

在木质板型材料的制作中，使用含有絮凝酵母的生物粘合剂部分取代树脂胶，减少甲醛的来源，同时活细胞对材料中的甲醛也有吸附降解作用，可以从根本上消除甲醛。絮凝酵母生物粘合剂内含活性絮凝酵母细胞，能够通过细胞代谢在短期内(几天)将粘合剂中残留的甲醛吸收分解成安全环保的二氧化碳和水，从而在源头上就可以解决甲醛缓慢释放的问题。

絮凝酵母生物粘合剂降解甲醛的过程如图2所示，絮凝酵母生物粘合剂和脲醛树脂6混合使用，其中Dopa蛋白4和絮凝酵母活性细胞5分布于脲醛树脂6之间，在起到粘合作用的同时，絮凝酵母活性细胞5可以代谢脲醛树脂6中未反应的甲醛，生成二氧化碳和水。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。