阅读说明：本技术 纳米材料固定化微生物修复剂及其制备方法和应用 (Nano material immobilized microorganism repairing agent and preparation method and application thereof ) 是由 任文杰 滕应 毛婷玉 骆永明 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：纳米材料固定化微生物修复剂及其制备方法和应用,包括如下步骤：(1)噬氨副球菌菌体的制备；(2)包埋剂氧化石墨烯基纳米复合材料的制备；(3)交联剂CaCl<Sub>2</Sub>溶液的制备；(4)纳米材料固定化微生物修复剂制备。本发明制备的氧化石墨烯基纳米材料固定化微生物修复剂对环境的适用性强,保证了多环芳烃降解微生物降解功能的稳定发挥,提高了传统固定化微生物制剂的降解效率,缩短了多环芳烃污染土壤微生物修复的周期；制备方法操作简单、成本低、效果好,具有大规模工业化生产的前景,适合多环芳烃污染土壤的原位修复且无二次污染。(The preparation method and the application of the nano material immobilized microorganism repairing agent comprise the following steps: (1) preparing paracoccus aminovorans thallus; (2) preparing an embedding agent graphene oxide-based nano composite material; (3) crosslinking agent CaCl 2 Preparing a solution; (4) preparing the nano material immobilized microorganism repairing agent. The graphene oxide-based nanomaterial immobilized microorganism repairing agent prepared by the invention has strong applicability to the environment, and guarantees the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbonThe biodegradation function is stably exerted, the degradation efficiency of the traditional immobilized microbial preparation is improved, and the microbial remediation period of the soil polluted by the polycyclic aromatic hydrocarbon is shortened; the preparation method has the advantages of simple operation, low cost and good effect, has the prospect of large-scale industrial production, is suitable for in-situ remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon polluted soil, and has no secondary pollution.)

纳米材料固定化微生物修复剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于污染土壤微生物修复技术领域，具体涉及一种纳米材料固定化微生物修复剂及其制备方法和应用。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类广泛存在于土壤环境中的有机污染物，主要来源于化石燃料和生物质的不完全燃烧。近年来，我国土壤中PAHs污染日益严重，2014年环保部和国土资源部联合发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，PAHs污染土壤的点位超标率为1.4％，污染呈现面积大、多组分复合等特点，严重危及农产品质量安全和人居环境安全。因此，如何有效控制和修复土壤中PAHs已成为我国生态环境治理和可持续发展的重大科技需求。

微生物修复具有操作简单、成本低廉、无二次污染等优点，逐渐成为备受推崇的绿色可持续修复技术。目前，通过微生物富集培养等技术，已经筛选分离到一些能降解或转化某种PAHs的微生物，如中国专利200810022333.9报道了一种可以降解高分子量PAHs(苯并[a]芘、芘或荧蒽)的噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2；中国专利201410005967.9报道了一种能以荧蒽为唯一碳源和能源生长的腊状芽孢杆菌。但在实际修复工程中，由于容易受到土著微生物竞争和环境条件制约，外源微生物在原位土壤环境中往往难以稳定发挥作用，以至于无法取得理想的修复效果。

微生物固定化技术可为生物体提供良好的生存条件，降低外界环境对微生物的损伤，在污水处理和土壤修复领域展现出很大应用潜力。但目前的固定化微生物材料存在力学性能差、传质效率低等缺点，在复杂的土壤环境中容易变形和破裂。因此，亟待研发机械强度高、传质性能优异的固定化微生物材料，保证土壤中微生物降解功能稳定发挥，以便为污染土壤修复领域提供高效、经济、绿色的微生物修复材料。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种纳米材料固定化微生物修复剂及其制备方法和应用，可以克服实际污染土壤中添加游离微生物修复效率偏低、原有固定化微生物菌剂机械强度不高等问题，有助于促进降解微生物的生长繁殖，提高固定化微生物菌剂的机械强度和传质效率，实现PAHs污染土壤高效、绿色、经济的可持续修复，在PAHs污染农田及场地土壤生物修复领域具有良好的发展应用潜力。

技术方案：纳米材料固定化微生物修复剂，微生物固定于纳米材料中，所述纳米材料为氧化石墨烯基纳米复合材料；所述微生物为噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为CGMCCNo.2568。

纳米材料固定化微生物修复剂的制备方法，包括如下步骤：(1)噬氨副球菌菌体的制备：将噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2于LB培养基中扩大培养，获得噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)HPD-2菌体，记为菌体A；(2)包埋剂氧化石墨烯基纳米复合材料的制备：将海藻酸钠溶解于60-80℃去离子水中，搅拌得到海藻酸钠质量百分含量为2.5％的溶液，向溶液中加入LB培养基，混合均匀后在0.12MPa、121℃条件下灭菌20min，再加入氧化石墨烯，记为溶液B；(3)交联剂CaCl₂溶液的制备：将无水氯化钙溶于去离子水中，得到质量百分含量为3％的CaCl₂溶液，记为溶液C；(4)纳米材料固定化微生物修复剂制备：将菌体A按体积比为1:9加入到溶液B中，搅拌混合均匀后滴加到500mL溶液C中，缓慢搅拌，交联处理，过滤，用1.0％的生理盐水清洗，得到纳米材料固定化微生物修复剂。

作为优选方案，步骤(1)中所述菌体A中噬氨副球菌的数量为2.8×10⁸个/mL。

优选的，步骤(2)中所述溶液B中LB培养基的体积百分含量为5％-10％(v/v)，氧化石墨烯的质量百分含量为0.01％。

优选的，步骤(4)中所述交联处理为在4℃条件下交联6h。

上述纳米材料固定化微生物修复剂在修复多环芳烃污染土壤中的应用。

上述纳米材料固定化微生物修复剂在制备修复多环芳烃污染土壤产品中的应用。

有益效果：本发明制备的氧化石墨烯基纳米材料固定化微生物修复剂，可以利用氧化石墨烯高比表面积、高表面活性和高机械强度等优异特性，增强海藻酸钙包埋剂的机械特性和吸附特性，明显提高了传统海藻酸钙包埋型固定化微生物修复剂的机械强度和传质速率；在一定营养水平(体系中含有5％-10％LB培养基)下，氧化石墨烯能够显著促进PAHs降解微生物噬氨副球菌的生长繁殖，增强其生物膜的形成，提高微生物对环境的适应性，三者间的协同作用保证了PAHs降解微生物降解功能的稳定发挥，从而提高了传统固定化微生物制剂的降解效率，缩短了PAHs污染土壤微生物修复的周期；该修复剂制备方法操作简单、成本低、效果好，具有大规模工业化生产的前景，适合PAHs污染土壤的原位修复且无二次污染。

附图说明

图1为固定化微生物修复剂(左图为常规固定化微生物修复剂，右图为石墨烯基纳米复合材料固定化微生物修复剂；修复剂直径大约为3mm)；

图2为不同固定化体系对污染土壤中PAHs的去除效果(CK代表不加修复剂的对照处理；HPD-2代表常规固定化HPD-2修复剂；HPD-2+LB代表常规固定化材料中添加LB培养基的固定化HPD-2修复剂；HPD-2+GO代表未添加LB培养基的氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂；HPD-2+GO+LB代表的本标准所述氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂(添加LB培养基))。

具体实施方式

为更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1：氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂对土壤中PAHs的去除效果

制备LB培养基，所含成分及用量：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl10.0g/L，其余为去离子水，调节pH为7.0，在0.12MPa、121℃下灭菌20min备用。将保存于-80℃的噬氨副球菌菌株取出，吸取100μL菌液接种于10mL液体LB培养基中进行复壮培养，在30℃、150r/min条件下培养8h后按10％的体积比接种到液体LB培养基中继续培养16h。以6000r/min的速度离心5min后，获得上述菌体的对数生长期细胞；用磷酸盐缓冲液洗涤2次后重新悬浮，调节菌悬液OD₆₀₀值至1.0，将100mL菌悬液离心浓缩，获得用于PAHs降解的噬氨副球菌菌体；将海藻酸钠溶解于60℃去离子水中，快速搅拌，得到海藻酸钠质量百分含量为2.5％的溶液，向溶液中按10％的体积比加入LB培养基，混合均匀，在0.12MPa、121℃条件下灭菌20min，待溶液冷却后加入氧化石墨烯，溶液中氧化石墨烯的质量百分含量为0.01％。，作为包埋剂溶液；将无水氯化钙溶于去离子水中，得到质量百分含量为3％的CaCl₂溶液，作为交联剂溶液；将菌体按体积比为1:9加入到包埋剂溶液中，搅拌混合均匀后滴加到交联剂溶液中，在4℃条件下交联6h，过滤，用1.0％的生理盐水洗涤，得到石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂。

以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中PAHs含量为344.48mg/kg，将上述制备的石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂按照3wt.％的投加比投加到土壤中。由图2可见，修复35天后，使用氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂的土壤中PAHs的去除率为70.31％，与常规固定化HPD-2修复剂处理相比提高了12.57％，明显促进了土壤中PAHs的去除，相比于其他不同固定化体系，对土壤中PAHs的去除效果也明显提高，尤其是针对土壤中高分子量PAHs，去除效果的促进作用更为明显(表1)。这是由于氧化石墨烯在存在LB培养基的营养状态下可以促进HPD-2的生长繁殖，加速HPD-2生物膜的形成，提高了微生物对环境的适应能力，同时也能提升常规固定化微生物修复剂的传质性能和机械强度，最终促进了微生物对PAHs的降解效果。

表1不同固定化体系对污染土壤中PAHs的去除效果(％)

实施例2：氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂对土壤中PAHs的去除效果

与实施例1相比，本实施例中向海藻酸钠溶液中按5％的体积比加入LB培养基，其他步骤及参数均与实施例1相同，制备得到石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂。以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中PAHs含量为344.48mg/kg，将上述制备的石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂按照3wt.％的投加比投加到土壤中。修复35天后，使用氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂的土壤中PAHs的去除率为68.24％，与添加10％LB培养基的固定化修复剂相比没有显著差别，与常规固定化HPD-2修复剂处理相比提高了10.5％，明显促进了土壤中PAHs的去除，相比于其他不同固定化体系，对土壤中PAHs的去除效果也明显提高。

实施例3：氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂对土壤中PAHs的去除效果

与实施例1和2相比，本实施例中向海藻酸钠溶液中按8％的体积比加入LB培养基，其他步骤及参数均与实施例1和2相同，制备得到石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂。以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中PAHs含量为344.48mg/kg，将上述制备的石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂按照3wt.％的投加比投加到土壤中。修复35天后，使用氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂的土壤中PAHs的去除率为71.35％，与添加10％LB培养基的固定化修复剂相比没有显著差别，与常规固定化HPD-2修复剂处理相比提高了13.61％，明显促进了土壤中PAHs的去除，相比于其他不同固定化体系，对土壤中PAHs的去除效果也明显提高。

对比例1：常规固定化HPD-2修复剂对土壤中PAHs的去除效果

将保存于-80℃的噬氨副球菌菌株取出，吸取100μL菌液接种于10mL液体LB培养基中进行复壮培养，在30℃、150r/min条件下培养8h后按10％的体积比接种到液体LB培养基中继续培养16h。以6000r/min的速度离心5min后，获得上述菌体的对数生长期细胞；用磷酸盐缓冲液洗涤2次后重新悬浮，调节菌悬液OD₆₀₀值至1.0，将100mL菌悬液离心浓缩，获得用于PAHs降解的噬氨副球菌菌体；将海藻酸钠溶解于60℃去离子水中，快速搅拌，得到海藻酸钠质量百分含量为2.5％的溶液，在0.12MPa、121℃条件下灭菌20min，作为包埋剂溶液；将无水氯化钙溶于去离子水中，得到质量百分含量为3％的CaCl₂溶液，作为交联剂溶液；将菌体加入到包埋剂溶液中，搅拌混合均匀后滴加到交联剂溶液中，在4℃条件下交联6h，过滤，用1.0％的生理盐水洗涤，得到常规固定化HPD-2修复剂。

以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中PAHs含量为344.48mg/kg，将上述制备的常规固定化HPD-2修复剂按照3％的投加比投加到土壤中。由图2可见，修复35天后，添加常规固定化HPD-2修复剂的土壤中PAHs的去除率为57.74％。

对比例2：常规固定化材料中添加LB培养基的固定化HPD-2修复剂对土壤中PAHs的去除效果

将保存于-80℃的噬氨副球菌菌株取出，吸取100μL菌液接种于10mL液体LB培养基中进行复壮培养，在30℃、150r/min条件下培养8h后按10％的体积比接种到液体LB培养基中继续培养16h。以6000r/min的速度离心5min后，获得上述菌体的对数生长期细胞；用磷酸盐缓冲液洗涤2次后重新悬浮，调节菌悬液OD₆₀₀值至1.0，将100mL菌悬液离心浓缩，获得用于PAHs降解的噬氨副球菌菌体；将海藻酸钠溶解于60℃去离子水中，快速搅拌，得到海藻酸钠质量百分含量为2.5％的溶液，向溶液中按10％的体积比加入LB培养基，混合均匀，在0.12MPa、121℃条件下灭菌20min，作为包埋剂溶液；将无水氯化钙溶于去离子水中，得到质量百分含量为3％的CaCl₂溶液，作为交联剂溶液；将菌体加入到包埋剂溶液中，搅拌混合均匀后滴加到交联剂溶液中，在4℃条件下交联6h，过滤，用1.0％的生理盐水洗涤，得到固定化材料(海藻酸钙包埋剂)中添加LB培养基的固定化HPD-2修复剂。

以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中PAHs含量为344.48mg/kg，将上述制备的固定化材料中添加LB培养基的固定化HPD-2修复剂按照3％的投加比投加到土壤中。由图2可见，修复35天后，采用固定化材料中添加LB培养基的固定化HPD-2修复剂的土壤中PAHs的去除率为50.92％，甚至低于添加常规固定化HPD-2修复剂的处理，可能是因为添加LB培养基后，HPD-2主要以LB培养基作为碳源生长，而减弱了对PAHs的降解。

对比例3：未添加LB培养基的氧化石墨烯基纳米复合材料固定化HPD-2修复剂对土壤中PAHs的去除效果

将保存于-80℃的噬氨副球菌菌株取出，吸取100μL菌液接种于10mL液体LB培养基中进行复壮培养，在30℃、150r/min条件下培养8h后按10％的体积比接种到液体LB培养基中继续培养16h。以6000r/min的速度离心5min后，获得上述菌体的对数生长期细胞；用磷酸盐缓冲液洗涤2次后重新悬浮，调节菌悬液OD₆₀₀值至1.0，将100mL菌悬液离心浓缩，获得用于PAHs降解的噬氨副球菌菌体；将海藻酸钠溶解于60℃去离子水中，快速搅拌，得到海藻酸钠质量百分含量为2.5％的溶液，在0.12MPa、121℃条件下灭菌20min，待溶液冷却后加入氧化石墨烯，溶液中氧化石墨烯的质量百分含量为0.01％。，作为包埋剂溶液；将无水氯化钙溶于去离子水中，得到质量百分含量为3％的CaCl₂溶液，作为交联剂溶液；将菌体加入到包埋剂溶液中，搅拌混合均匀后滴加到交联剂溶液中，在4℃条件下交联6h，过滤，用1.0％的生理盐水洗涤，得到固定化材料中添加氧化石墨烯的固定化HPD-2修复剂。

以南京某焦化厂污染场地采集的土壤为供试土壤，土壤中PAHs含量为344.48mg/kg，将上述制备的固定化材料中添加氧化石墨烯的固定化HPD-2修复剂按照3％的投加比投加到土壤中。由图2可见，修复35天后，采用固定化材料中添加氧化石墨烯的固定化HPD-2修复剂的土壤中PAHs的去除率为58.90％，与添加常规固定化HPD-2修复剂的处理相比提高了1.19％，但促进效果并不明显。

本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。