富含有机酸的疑拟香桃木果提取物、包含该提取物的化妆品组合物及其化妆品用途
阅读说明：本技术 富含有机酸的疑拟香桃木果提取物、包含该提取物的化妆品组合物及其化妆品用途 (Extract of Syzygium cumini fruit rich in organic acids, cosmetic composition comprising same and cosmetic use thereof ) 是由 J-M·波特 C·卡帕莱 C·冈德兰 I·英伯特 S·加尼尔 E·莱波涅 于 2019-01-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及干燥、无籽的疑拟香桃木(Myrciaria dubia)果的果肉和果皮提取物,其成熟度为至少70％并且其可溶性固形物/酸度比为2.5至3,其特征在于其富含有机酸。本发明还涉及获得提取物的方法、包含所述提取物的化妆品组合物和用于减少皮肤疲劳体征的化妆品用途。(The invention relates to an extract of the pulp and pericarp of a dried, seedless, suspected myrtle (Myrciaria dubia) fruit, having a maturity of at least 70% and a soluble solids/acidity ratio of between 2.5 and 3, characterized in that it is rich in organic acids. The invention also relates to a method for obtaining the extract, a cosmetic composition comprising said extract and cosmetic use for reducing the signs of skin fatigue.)
技术领域
本发明涉及富含有机酸的疑拟香桃木(Myrciaria dubia)(卡姆果(Camu-camu))果提取物、其制备方法、包含该提取物的化妆品组合物及其化妆品用途。
背景技术
卡姆果(Myrciaria dubia(H.B.K.)Mc Vaugh.)为灌木，原产于亚马逊盆地，属于桃金娘科(Myrtaceae family)。这种灌木高约3米，生长于秘鲁、哥伦比亚、委内瑞拉和巴西的亚马逊森林中，在大部分亚马逊河流域的洪泛区、湖泊和河流中。这种高度分枝的灌木于11月至12月间和8月至9月间开花，并且在1月至3月间和10月至11月间结果。
卡姆果的果实为深红-紫色的圆形浆果，直径1至3cm，具有细腻、光滑、有光泽的果皮和***的酸性果肉。传统上，成熟浆果是在雨季泛洪期在亚马逊沼泽地区直接通过独木舟手工采摘。几年来，在许多亚马逊国家建立人造林。700多年来，原住民一直将卡姆果用于医疗目的，以治疗感染、减轻疼痛、加固关节、延年益寿、增强免疫和神经系统以及促进营养吸收。由于其天然酸度，这种营养水果的果肉主要在加工成果汁、酒精饮料、醋、浓缩物、果酱、冰淇淋和蛋糕后食用。果肉占果实重量的50％至55％，其余为籽(每个果实1至3粒籽)和果皮。当研究人员发现卡姆果主要由于其高天然含量的维生素C(抗坏血酸)和类黄酮而带来独特的营养和健康益处时，其便风靡全球。卡姆果被本领域技术人员认为属于“超级水果”组，这是由于其具有高含量的抗坏血酸或维生素C(占干重的3.5％至9％)，多种多酚例如黄酮类(杨梅素、原花青素、鞣花酸等)，单宁类(鞣花单宁，其主要存在于籽中)或花青素，以及萜烯化合物(α-蒎烯、柠檬烯、类胡萝卜素等)，它们赋予其强的抗氧化能力(防止自由基引起的氧化应激)及其它健康益处。由于这些活性成分中的几种，其也被认为具有抗炎作用、增强免疫系统并且改善人体的自然防御能力。在康复期、疲劳、流感或其它病毒性疾病的情况下，其指示作为佐剂使用。
已知1-4卡姆果的籽包含桦木酸(三萜)、多酚化合物(杨梅素及其衍生物、鞣花酸及其衍生物、鞣花单宁、原花青素)和酰基间苯三酚(Isomyrtucommulone B、Myrciarone B)。还已知1,3-6卡姆果的果皮包含多酚化合物(杨梅素及其衍生物、鞣花酸及其衍生物、鞣花单宁、原花青素)、矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷)、类胡萝卜素(全反式叶黄素、β-胡萝卜素、紫黄质、黄体黄质)和酰基间苯三酚(Myrciarone A、Rhodomyrtone)。最后，已知4,7-9卡姆果的果肉包含多酚化合物(杨梅素及其衍生物、鞣花酸及其衍生物、鞣花单宁、矢车菊素-3-葡萄糖苷、槲皮素及其衍生物)、抗坏血酸和脱氢抗坏血酸、脂肪酸(硬脂酸、亚油酸、油酸、γ和α-亚麻酸、二十三烷酸、二十碳二烯酸)、柠檬酸、苹果酸和异柠檬酸、简单的碳水化合物(主要为葡萄糖和果糖)、氨基酸(丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸，还有谷氨酸盐、4-氨基丁酸盐、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸)和矿物质(钾、钙、镁、钠、磷酸盐、硫酸盐、铝、硼、铜、锰、锌)。Fracassetti等人的文献4还证明，在从籽和果皮或果肉的混合物中用溶剂50％甲醇-水和1％甲酸提取的提取物中存在维生素C和多酚，并且获得的维生素C和多酚的量相对于整个植物进行表示。
已在来自新鲜或干燥植物材料的果实的不同成熟阶段研究了上面指定的卡姆果中不同成分的浓度。Zapata等人9研究了在三个不同的成熟度阶段的新鲜果肉的化学组成。它们表明，从未成熟果实到成熟果实之间的维生素C含量增加约12％，糖含量(葡萄糖和果糖)增加一倍。果实成熟期间的氨基酸含量也增加，主要是丝氨酸、缬氨酸和亮氨酸的含量。这项研究中，还表明在成熟期间，与含量增加的苹果酸相比，柠檬酸含量下降。据信，该果实的果肉中存在痕量异柠檬酸。最后，这项研究还表明，钾和磷酸盐的含量增加，钠和硫酸盐的含量净减少50-60％，并且成熟期间钙和镁的含量保持不变。
以上引用的文献中，仅文献1和4描述了使用卡姆果的干果(通常与籽一起)进行成分分析。这两篇文献使用不同的分析方法和不同的溶剂表明，提取物具有高含量的多酚。
此外，公开号为WO2014020219的文献公开了从卡姆果的果实获得的产物的抗氧化组合物。它更具体地涉及用于获得处于20％至30％的成熟度状态并且具有1.40至2.30的可溶性固形物/酸度比的卡姆果提取物，所述方法包括从所选的果实中除去籽并且在低于60℃的温度干燥不含籽的果实的步骤。水溶性化合物在酸性pH值(三羧酸)用水进行提取，提取物显示含有大量的维生素C和多酚，包括原花青素。描述这些提取物主要用于制备滋补食品组合物和刺激药物组合物；通常引用先验具有滋养作用的化妆品组合物。
公开号为WO2004074304的文献还公开没食子酸的糖基化衍生物化合物(1-[1,5-二羟基-2,2,4,4-四甲基-3-[[6-O-(3,4,5-三羟基苯甲酰基)-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]环戊基]-3-甲基-2-丁烯-1-酮)，其称为“CA1”，根据实施例1衍生自卡姆果籽并且具有强大的抗氧化活性和稳定的美白效果。用甲醇(一种单醇溶剂)对卡姆果籽进行提取工艺。根据该文献，化合物CA1也存在于果肉和果皮中，但似乎以不同浓度存在。
最后，从公开号为JP3431383的文献中可知，卡姆果的提取物也显示漂白活性。从卡姆果的整果、优选新鲜的整果，通过用水、有机溶剂或水与有机溶剂的混合物浸渍至少两天的时间段来获得提取物。该文献中唯一的实例表明用乙醇浸渍果实三天。
因此，取决于所用的疑拟香桃木果的部分，果实(新鲜或干燥)的品质和所用的提取工艺，特别是溶剂的选择，证明所提取的分子在质量和数量上是不同的。然而，提取物的组成决定了生物活性，并且因此决定了美容功效。结果，申请人希望获得富含有机酸和多酚含量低的新型疑拟香桃木提取物。
申请人已经证明，成熟度为至少70％并且不含籽的干燥的疑拟香桃木果的果皮和果肉的提取物具有减少皮肤疲劳体征的活性。本发明的提取物富含有机酸(抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、苹果酸和柠檬酸的混合物)，包含矿物质和糖(果糖、葡萄糖、蔗糖和痕量的麦芽糖)，并且包括痕量的脱色素化合物和少量的酚类化合物。
发明内容
首先，本发明由此涉及其成熟度为至少70％并且其可溶性固形物/酸度比为2.5至3的干燥、无籽的疑拟香桃木果的果肉和果皮提取物，所述提取物富含有机酸。
其次，本发明涉及用于获得本发明的提取物的方法，其包括以下步骤，其中：
a)将具有至少70％的成熟度和2.5至3的可溶性固形物/酸度比的无籽、干燥的疑拟香桃木果的果肉和果皮分散在水-多元醇溶剂中并且在水-多元醇溶剂中提取，
b)通过倾析和/或离心和/或澄清过滤从步骤a)获得的提取物，将加载有目标化合物的液相与固相分离，
c)将步骤b)中获得的液体提取物进行微过滤以除去固体植物颗粒，
d)任选地，将步骤c)中获得的液体提取物通过过滤、超滤和/或纳滤进行纯化，
e)任选地，可以干燥例如通过喷雾、冷冻干燥或沸石低温脱水(zéodratation)获得的液体疑拟香桃木提取物以获得固体疑拟香桃木提取物，任选地通过干燥载体例如麦芽糊精进行干燥。
本发明还涉及直接通过所述方法获得的疑拟香桃木的果肉和果皮提取物。
第三，本发明涉及化妆品组合物，其包含作为活性剂的有效量的本发明的干燥的疑拟香桃木果的果肉和果皮提取物，和生理学上可接受的介质。
最后，第四，本发明涉及本发明的组合物用于减少皮肤疲劳体征的化妆品用途。
具体实施方式
本说明书中，除非另有说明，否则应理解，当给出范围时，其包括此范围的上限和下限。
除非另有说明，否则百分比为重量百分比。
本发明中：
-“水-多元醇”是指水和多元醇的混合物，多元醇包含至少两个醇基、更具体地2个至9个醇基，和3个至12个碳原子。
-“富含有机酸的提取物”是指如下提取物，其包含一定量的有机酸(总抗坏血酸、苹果酸和柠檬酸的混合物，所述总抗坏血酸包括抗坏血酸和脱氢抗坏血酸)比确定的其它成分多，即，13.5％至80.5％，相对于总提取物的干物质。
-“有效量”是指获得所需效果即减少皮肤疲劳体征所需的目标化合物的量。
-“减少皮肤疲劳体征”是指健康的人可出现的以下体征的一种、多种或全部：眼睛下方出现浮肿和黑眼圈、肤色暗沉、皮肤干燥、细纹和皱纹加重例如前额皱纹或鱼尾纹、皮肤松弛加重、指甲脆性增加和发际线后退。在分子和细胞水平上，皮肤疲劳的特征包括线粒体功能障碍、ATP生成减少、糖酵解减少和肌酸激酶系统减少。
-植物名称卡姆果(Camu-camu)和疑拟香桃木(Myrciaria dubia)在申请中可互换使用。
-“局部施用”是指将包含本发明的疑拟香桃木提取物的组合物施用或铺展在皮肤表面、粘膜或附肢上。
-“生理学上可接受的”是指包含本发明的疑拟香桃木提取物的组合物适合与皮肤或粘膜接触而不引起毒性、不耐受或过敏反应。在可摄入或注射到皮肤中的组合物的情况下，这些不展显出毒性、不相容性、不稳定性并且不引起全身性过敏反应。
-“干物质”以质量百分比表示，是指通过干燥或蒸发完全除去溶剂后获得的干燥残留物。
-“目标化合物”是指通过本发明的方法提取并且可用于化妆品组合物以减少皮肤疲劳体征的化合物。
-“可溶性固形物/酸度比”是指果实中所含的可溶性固形物(主要是糖)与果实的酸度之比。在果实成熟过程中，酸进行分解，糖含量增加，总可溶性固形物/酸度比(称为白利糖度(Brix)/酸度)达到较高值。该比率没有单位，并且对应于基于柠檬酸浓度计算的白利糖度/酸度比。可在A.Askar和H.Treptow于1993年由Springer Verlag BerlinHeidelberg出版的文献“Quality assurance in Tropical Fruit Processing”的第25页第2.7段中找到用于计算该比率的参考。
-“至少70％的成熟度”是指每只果实的颜色为至少70％红色和30％绿色。该成熟度可达至100％。
-“痕量化合物”是指通过常规实验室检测方法可检测到其存在但无法量化的化合物。
申请人根据安第斯法律关于《遗传资源获取共同规则》的第391号决定，向秘鲁政府(INIA：国家农业创新研究所(Instituto Nacional de Innovacion Agraria)(“国家农业创新研究所(National Institute of Agricultural Innovation)”)提交了获取遗传资源疑拟香桃木(Kunth)McVau的申请。
首先，本发明涉及干燥、无籽的疑拟香桃木果的果肉和果皮提取物，所述疑拟香桃木果的成熟度为至少70％，其可溶性固形物/酸度比为2.5至3,所述提取物富含有机酸。
本发明还涉及通过描述为本发明第二主题的方法直接获得的干燥、无籽的疑拟香桃木果的果肉和果皮提取物，所述疑拟香桃木果的成熟度为至少70％并且其可溶性固形物/酸度比为2.5至3。
本发明的上下文中，选择的植物部分为疑拟香桃木的果实，其选自已去籽的干果的果皮和果肉。当果实的成熟度达到红色果实的70％或更高并且可溶性固形物/酸度比为2.5至3时，收获果实。
在一个非常优选的实施方案中，提取物从干燥的疑拟香桃木果的果肉和果皮中通过在常规搅拌下或在超声下在选自水-甘油和/或水-二醇溶剂的水-多元醇溶剂中进行固-液提取而获得。
提取物通过干燥和压碎的疑拟香桃木果的果肉和果皮在水-多元醇溶剂中的固-液提取获得，所述水-多元醇溶剂选自水和多元醇，例如甘油、诸如1,3-丙二醇等二醇、及其混合物。溶剂1,3-丙二醇为优选的溶剂，因为该溶剂为基于农业的(agrosourcé)。
提取溶剂优选为水-甘油和/或水-二醇溶剂，有利的比例为30％至90％的在水中的甘油和/或二醇，例如水和1,3-丙二醇的混合物。
在一个甚至更优选的实施方案中，提取物从干燥、无籽的疑拟香桃木果的果肉和果皮中通过在由60％的1,3-丙二醇和40％的去离子水组成的水-多元醇溶剂中进行固-液提取而获得。
最后，在另一个非常优选的实施方案中，相对于总提取物的干物质，提取物包含13.5％至80.5％的有机酸，包括苹果酸、柠檬酸和抗坏血酸；4.0％至22.0％的总糖，具体包括葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖；和0.5％至3％的矿物质，包括钾、镁、钙、钠、锰、锌和铁。
本发明的提取物仅包含痕量的蛋白质，痕量的氨基酸和肽，0.08％至2.00％的量的多酚以及最后痕量的脱色素化合物CA1，其参考现有技术中已知的提取物。
其次，本发明涉及用于获得本发明的提取物的方法，其包括以下步骤，其中：
a)将具有至少70％的成熟度和2.5至3的可溶性固形物/酸度比的无籽、干燥的疑拟香桃木果的果肉和果皮分散在水-多元醇溶剂中并且在所述水-多元醇溶剂中提取，
b)通过倾析和/或离心和/或澄清过滤从步骤a)获得的提取物，将加载有目标化合物的液相与固相分离，
c)将步骤b)中获得的液体提取物进行微过滤以除去固体植物颗粒，
d)任选地，将步骤c)中获得的液体提取物通过过滤、超滤和/或纳滤进行纯化，
e)任选地，可以干燥例如通过喷雾、冷冻干燥或沸石低温脱水获得的液体疑拟香桃木提取物以获得固体疑拟香桃木提取物，任选地通过干燥载体例如麦芽糊精进行干燥。
为了实施本发明的方法，所选的植物部分是疑拟香桃木的果实，其选自干燥的果实的果肉和果皮的，并且去籽以避免提取脂质，所述脂质会损害目标化合物的提取。
当果实的成熟度达到红色果实的70％或更高并且可溶性固形物/酸度之比为2.5至3时，收获果实。
特别有利地，步骤(a)在不含籽的疑拟香桃木果的干燥和压碎的果肉和果皮上进行。将收获的果实进行分类、消毒、洗涤和去籽，然后用热空气脱水，然后将干燥的果皮和果肉压碎。
提取物通过在水-多元醇溶剂中固-液提取疑拟香桃木果的干燥和磨碎的果肉和果皮而获得，所述水-多元醇溶剂选自水和多元醇例如甘油、二醇例如1,3-丙二醇及其混合物。溶剂1,3-丙二醇为优选溶剂，因为该溶剂为基于农业的。
有利地，所述水-多元醇溶剂为包含10重量％至90重量％的甘油和/或1,3-丙二醇在去离子水中的混合物，相对于溶剂加水的总重量。
进一步优选地，所述水-多元醇溶剂为包含50重量％至80重量％的甘油和/或1,3-丙二醇在去离子水中的混合物，相对于溶剂加水的总重量。
更特别地，在固-液提取去籽和干燥的疑拟香桃木果的果肉和果皮的范围内，将0.1重量％至20重量％(干物质)的果实的果肉和果皮的一部分引入提取溶剂中，优选1重量％至15重量％，典型地5重量％至10重量％(％表示为干物质的重量，相对于所用的总重量)。
当使用的溶剂为甘油时，选择甘油在水中的比例为30％至90％，有利地50％至80％(百分比表示为甘油的重量，相对于水+甘油的总重量)。
当使用的溶剂为二醇、更具体地1,3-丙二醇时，选择1,3-丙二醇在水中的比例为10％至90％，有利地50％至70％，并且甚至更有利地选择60％的1,3-丙二醇和40％的去离子水的比例(％表示为1,3-丙二醇的重量，相对于水加1,3-丙二醇的总重量)。
提取温度有利地为4℃至100℃，优选10℃至80℃，更优选20℃至50℃。
可通过使热流体在双层夹套提取容器中循环或通过微波来进行加热。
提取时间有利地为10分钟至4小时，优选为30分钟至3小时，甚至更有利地为1小时至2小时。
提取可以有利地在真空下、在大气压或在压力下，优选在大气压或在压力下，更有利地在大气压下进行。
提取总是在搅拌下进行，因此可使固体在液体中分散和均质化，有效地改善溶质在溶剂中的扩散。
在步骤a)的提取之后，根据步骤b)，例如通过倾析、离心或澄清过滤，有利地将用尽目标化合物的残留植物材料与液相分离。可根据步骤c)，使用合适孔隙率的过滤介质对所得液相进行微过滤，以获得纯化的固体植物颗粒的透明溶液。
在这些初始的液-固分离步骤之后，可以根据步骤d)例如通过过滤、超滤和/或纳滤进行纯化步骤，从而以牺牲其它化合物为代价对目标化合物进行浓缩。
因此，在本发明的方法的一个优选实施方案中，步骤a)的温度为4℃至100℃，提取时间为10分钟至4小时，提取在常规搅拌下或在超声波下进行。
本发明还涉及通过所述方法直接获得的疑拟香桃木的果肉和果皮的提取物。
本发明还涉及通过上述方法直接获得的疑拟香桃木提取物，其包含相对于总提取物的干物质，13.5％至80.5％的有机酸，包括苹果酸、柠檬酸和抗坏血酸；4.0％至22.0％的总糖，包括葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖；0.5％至3％的矿物质，包括钾、镁、钙、钠、锰、锌和铁。
本发明还涉及前述段落所述的疑拟香桃木提取物，并且进一步包含痕量蛋白质、痕量氨基酸和肽以及0.08％至2％的量的多酚，其通过上述方法直接获得。
第三，本发明涉及化妆品组合物，其包含本发明的疑拟香桃木果的果肉和果皮，以及生理学上可接受的介质。
在本发明的一个优选实施方案中，疑拟香桃木果的果肉和果皮的水-多元醇提取物在组合物中以0.1％至3％的浓度存在，相对于组合物的总重量，优选0.1％至1.5％。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物意在更具体地用于局部给药。因此，这些组合物必须包含生理学上可接受的介质，即与皮肤和附肢可相容，并且必须涵盖所有化妆品形式。这些组合物可具体是乳膏、水包油或油包水乳状液或多种乳状液(émulsion)、溶液、悬浮液、凝胶、乳状物(lait)、乳液(lotion)、棒或粉末的形式，其适于施用于皮肤、嘴唇和/或附肢。这些组合物包括其调配所必需的赋形剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、表面活性剂、抗氧化剂、染料、防腐剂和香料。它们可以用作护肤品和/或用作皮肤的化妆用品。
此外，本发明的组合物包括在预期应用领域中通常使用的任何添加剂以及其调配所必需的助剂，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、染料、防晒剂、美黑剂、颜料、填充剂、防腐剂、香料、气味吸收剂、化妆品或药物活性成分、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。
由华盛顿特区的“个人护理产品理事会(Personal Care Products Council,Inc.)”出版的《国际化妆品原料字典和手册(INCI Dictionary&Handbook)》(“国际化妆品成分命名法”，第13版，2010年)描述了多种但不限于常用于皮肤护理工业中、适合用作本发明的组合物中的附加成分的化妆品和药物成分。
这些附加成分类别的非限制性实例包括：愈合剂、抗衰老剂、抗皱剂、抗萎缩剂、保湿剂、软化剂、抗菌剂、抗寄生虫剂、抗真菌剂、杀真菌剂、抑真菌剂、杀菌剂、抑菌剂、抗微生物剂、抗炎剂、止痒剂、麻醉剂、抗病毒剂、角质层分离剂、抗自由基剂、抗皮脂溢剂、去屑剂、皮肤分化调节剂、增殖剂或色素沉着剂、渗透促进剂、脱皮剂、黑色素合成刺激剂或抑制剂、增白剂、脱色剂或提亮剂、色素原剂、美黑剂、NO合酶抑制剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗空气污染剂、抗糖基化剂、紧肤剂、真皮或表皮大分子合成刺激剂和/或能够预防或抑制其降解的试剂、胶原蛋白合成刺激剂、弹性蛋白合成刺激剂、饰胶蛋白聚糖合成刺激剂、层粘连蛋白合成刺激剂、防卫素合成刺激剂、伴侣蛋白合成刺激剂、水通道蛋白合成刺激剂、透明质酸合成刺激剂、脂质和角质层成分(神经酰胺、脂肪等)合成刺激剂、胶原蛋白降解抑制剂、弹性蛋白降解抑制剂、成纤维细胞增殖刺激剂、角质形成细胞增殖刺激剂、脂肪细胞增殖刺激剂、黑色素细胞增殖刺激剂、角质形成细胞分化刺激剂、脂肪细胞分化刺激剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、糖胺聚糖合成刺激剂、DNA修复剂、DNA保护剂、止痒剂、敏感皮肤治疗和/或护理剂、紧肤剂、抗妊娠纹剂、收敛剂、皮脂产生调节剂、皮肤舒缓剂、愈合辅助剂、再上皮化刺激剂、细胞因子生长因子、镇静剂、抗炎剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的试剂、血管生成刺激剂、血管通透性抑制剂、作用于细胞代谢的试剂、真皮表皮连接区改善剂、头发和/或体毛生长诱导剂、头发和/或体毛生长抑制剂或减缓剂、肌肉松弛剂、抗污染和/或抗自由基剂、脂解刺激剂、减肥剂、消脂肪团剂、作用于微循环的试剂、作用于细胞代谢的试剂、清洁剂、头发定型剂、头发生长刺激剂、防晒霜、防晒隔离霜、化妆剂、洗涤剂、药品、乳化剂、润肤剂、有机溶剂、防腐剂、除臭剂活性成分、生理学上可接受的介质、表面活性剂、摩擦剂、吸收剂、化妆品组分例如香料、颜料、染料、着色剂和天然着色剂、精油、接触剂、化妆品收敛剂、抗粉刺剂、抗凝剂、消泡剂、抗氧化剂、配体、生物添加剂、酶、酶抑制剂、酶诱导剂、辅酶、螯合剂、植物提取物和植物衍生物、精油、海洋提取物、来自生物发酵和/或生物技术过程的试剂、无机盐、细胞提取物、防晒霜(对紫外线A和/或B射线有活性的有机或无机防晒剂)、神经酰胺、肽、缓冲剂、增量剂、螯合剂、化学添加剂、着色剂、化妆品杀生物剂、变性剂、药用收敛剂、外部止痛剂、增强组合物的成膜性和直接性的成膜剂例如聚合物、季铵化合物、直接性增强剂、遮光剂、pH调节剂和调整剂(例如三乙醇胺)、抛射剂、还原剂、螯合剂、皮肤美白剂和/或皮肤提亮剂、皮肤调理剂(即保湿剂，包括油膜和闭合剂)、保湿物质、α-羟基酸、β-羟基酸、保湿剂、表皮水解酶、舒缓剂和/或修复剂、皮肤护理剂、抗皱剂、能够减轻或治疗眼睛下方的浮肿的试剂、去角质剂、增稠剂、柔软剂、胶凝聚合物、维生素及其衍生物、润湿剂、剥离剂、镇静剂、皮肤愈合剂、木脂素、防腐剂(即苯氧乙醇和对羟基苯甲酸酯)、抗紫外线剂、细胞毒剂、抗肿瘤剂、粘度调节剂、非挥发性溶剂、珠光剂、止汗剂、脱毛剂、疫苗、香水、皮肤重组剂、赋形剂、填充剂、矿物质、抗分枝杆菌剂、抗过敏剂、H1或H2抗组胺剂、抗刺激剂、免疫系统刺激剂、免疫系统抑制级、驱虫剂、润滑剂、颜料或着色剂、美白祛斑剂、光稳定剂，以及它们的混合物，只要它们在物理上和化学上与组合物的其它成分、特别是与本发明的活性成分相容即可。
此外，这些附加成分的性质必须不能不可接受地改变本发明活性成分的益处。这些附加成分可以是合成的或天然的例如植物提取物，或来自生物发酵过程。其它实例可以在《国际化妆品原料字典和手册》中得到。
这样的附加成分可选自：氨基糖、葡糖胺、D-葡糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、维生素B3及其衍生物、烟酰胺、脱氢乙酸钠、脱氢乙酸及其盐、植物甾醇、水杨酸化合物、己脒定、二烷酰基二羟基脯氨酸化合物、大豆的提取物和衍生物、雌马酚、异黄酮、类黄酮、植烷三醇、法呢醇、香叶醇、没药醇、肽及其衍生物、二肽、三肽、四肽、五肽和六肽及其衍生物、lys-thr-thr-lys-ser、棕榈酰-lys-thr-thr-lys-ser、肌肽、N-酰基氨基酸化合物、类视色素、视黄醇丙酸酯、视黄醇、棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、视黄醛、视黄酸、水溶性维生素、抗坏血酸盐、维生素C、抗坏血酸葡萄糖苷、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸磷酸钠、维生素及其盐和衍生物、维生素原及其盐和衍生物、乙基泛醇、维生素B及其衍生物、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素K及其衍生物、泛酸及其衍生物、泛酸醇乙基醚、泛醇及其衍生物、乙基泛醇、右泛醇、生物素、氨基酸及其盐和衍生物、水溶性氨基酸、天冬酰胺、丙氨酸、吲哚、谷氨酸、水不溶性维生素、维生素A、维生素E、维生素F、维生素D及其化合物、单萜、二萜和三萜、β-紫罗兰醇、雪松醇及其衍生物、水不溶性氨基酸、酪氨酸、色胺、粒状物质、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚、尿囊素、烟酸生育酚酯、生育酚、生育酚酯、棕榈酰-gly-his-lys、植物甾醇、羟基酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、酮酸、丙酮酸、植酸、溶血磷脂酸、芪类、肉桂酸酯、白藜芦醇、激动素、玉米素、二甲基氨基乙醇、天然肽、大豆肽、酸糖盐、葡萄糖酸锰、葡萄糖酸锌、吡罗克酮乙醇胺盐、3,4,4'-三氯均二苯脲、三氯卡班、吡啶硫酮锌、氢醌、曲酸、抗坏血酸、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡萄糖苷、吡哆醇、芦荟、萜烯醇、尿囊素、红没药醇、甘草酸二钾、甘油酸、山梨糖醇、季戊四醇、吡咯烷酮及其盐、二羟基丙酮、赤藓酮糖、甘油醛、酒石醛、丁香油、薄荷醇、樟脑、桉树油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅馏出物、二十碳烯与乙烯基吡咯烷酮的共聚物、碘丙基丁基氨基甲酸酯、多糖、必需脂肪酸、水杨酸酯、甘草次酸、类胡萝卜素、神经酰胺与类神经酰胺、复合脂质、一般天然来源的油例如乳木果油、杏仁油、月见草油、李油、棕榈油、摩诺伊油、凯海油、氢醌、HEPES、丙半胱氨酸、O-辛酰基-6-D-麦芽糖、甲基甘氨酸二乙酸的二钠盐、类固醇例如薯蓣皂苷元及DHEA衍生物、DHEA脱氢表雄酮和/或化学或生物前体或衍生物、N-乙基羰基-4-对氨基苯酚、越橘提取物、植物激素、酿酒酵母酵母提取物、海藻提取物、大豆、油菜籽、亚麻、斯佩耳特小麦、大米、羽扇豆、玉蜀黍和/或豌豆提取物、阿尔维林及其盐，特别是枸橼酸阿尔维林、冬青与马栗提取物及其组合、金属蛋白酶抑制剂和柔毛肖乳香果提取物。
这样的附加成分还可选自包括以下的组：以如下商品名出售的肽：
所有情况下，本领域技术人员应确保以不会不利地影响本发明的组合物的所需有利性能的方式选择这些佐剂及其比例。
最后，本发明的第四个目的是使用化妆品组合物减少健康人的皮肤疲劳体征。
皮肤疲劳体征是由与生活方式(饮食习惯、暴露于污染中)、情绪(心理压力、劳累过度)以及缺乏休息或睡眠质量差相关的多个因素共同作用的结果(Flament等人，How aworking day-induced-tiredness may alter some facial signs in differently agedCaucasian women，Int J Cos Sci，1-9，2017)。临床上，最常见的面部皮肤疲劳体征为：眼睛下方的浮肿和黑眼圈、肤色暗沉、皮肤干燥、细纹和皱纹加重例如前额皱纹或鱼尾纹以及皮肤松弛加重；与疲劳有关的指甲脆性增加和发际线后退，这些在健康人中也已观察到。
本申请涉及关于健康人的护理组合物和美容护理方法。
分子和细胞水平上，线粒体功能障碍与疲劳有关(Filler等人，Association ofmitochondrial dysfunction and fatigue:a review of the literature，BBAClinical，1，12-23，2014)。实际上，线粒体在以ATP形式的能量产生中起着关键作用。维持细胞内的能量水平对于细胞合成、再生和***以及保护和修复至关重要(Blatt等人，Stimulation of skin's energy metabolism provides multiple benefits for maturehuman skin，Biofactors 25，179-185，2005)。细胞内，能量也可通过线粒体外途径如糖酵解和肌酸激酶系统产生。糖酵解为增生细胞例如皮肤角质形成细胞的关键代谢途径。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)通过催化2,6-二磷酸果糖的形成在糖酵解的调节中起重要作用，2,6-二磷酸果糖的积累促进了磷酸果糖激酶1(在糖酵解中起主要限制作用的酶)的活性(Amelio等人，p63 adjusts sugar taste of epidermal layers，JInvest Dermatol，137，1204-1206，2017)。需要PFKFB3来维持角质形成细胞的增殖活性(Hamanaka等人，PFKFB3，a direct target of p63,is required for proliferation andinhibits differentiation in epidermal keratinocytes，J Invest Dermatol，137，1267-1276，2017)。
肌酸激酶也是细胞能量容量中的关键酶。ATP以由肌酸激酶产生的磷酸肌酸的形式存储，然后在高能量需求的情况下允许其运输和利用(Lenz等人，The creatine kinasesystem in human skin:protective effects of creatine against oxidative and UVdamage in vitro and in vivo，J Invest Dermatol，124:443-452，2005)。
因此，本发明的目的是本发明的组合物用于减少健康人可能出现的疲劳体征的化妆品用途，其中所述皮肤疲劳体征选自：眼睛下方出现浮肿和黑眼圈、肤色暗沉、皮肤干燥、细纹和皱纹加重例如前额皱纹或鱼尾纹、皮肤松弛加重、指甲脆性增加和发际线后退，或所有这些体征。
本发明进一步涉及其中皮肤疲劳体征在分子和细胞水平上表现为如下的组合物的化妆品用途：ATP的产生、糖酵解和肌酸激酶系统、I型胶原蛋白的表达、PFKFB3的合成、11b-HSD2的信使RNA(mRNA)水平减少，和11b-HSD1的信使RNA(mRNA)水平增加。
本发明进一步涉及本发明的组合物用于如下的化妆品用途：增加细胞ATP的合成、增加肌酸激酶的活性、增加I型胶原蛋白的表达、增加PFKFB3的合成、减少11b-HSD1的信使RNA(mRNA)水平并且增加信使RNA(mRNA)水平。
通过阅读以下描述和与附图相关所述的非限制性实施方案，将会更好地理解本发明及由此带来的优点，其中：
-图1显示对于真皮成纤维细胞培养物的ATP测量；
-图2显示皮肤成纤维细胞培养物中的肌酸激酶活性的测量；
-图3显示在重建的真皮上对COL1A1型胶原蛋白的qPCR测量；
-图4显示正常人角质形成细胞(KHN)培养物中11b-HSD1和11b-HSD2的qPCR测量；
-图5显示重建的表皮上的苏木素/伊红(HE)染色；
-图6显示重建的真皮上PFKFB3的免疫染色强度；和
-图7显示重建的真皮上肌酸激酶活性的测量。
实施例1：由去籽的疑拟香桃木果的果肉和果皮粉末制备植物提取物
将刚去籽的疑拟香桃木果(70％成熟)的果肉和果皮放在湿度控制下加热至60℃的热风隧道系统中进行干燥。将所得粉末(200g)放在玻璃反应器中，该玻璃反应器配备有搅拌装置并且借助双层夹套在热传递流体存在下进行加热。
用于浸渍的溶剂(3800g)为60％1,3-丙二醇和40％去离子水的混合物。
将疑拟香桃木的果肉和果皮粉末在30℃在溶剂中分散2小时，然后在倾析器中分离混合物，离心以除去团粒，回收上清液并且过滤。过滤后，上清液为3220g提取物，其在溶剂介质60％1,3-丙二醇和40％水中。
由此得到的提取物在以下实施例中称为“E1疑拟香桃木果提取物”。该提取物E1包含2.0％干物质，包括本身(结果相对于干物质(DM)来表示)：
-35.3％/DM的有机酸，包括苹果酸、柠檬酸和总抗坏血酸(抗坏血酸和脱氢抗坏血酸)；
-10.1％/DM的糖，包括葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖；
-1.8％/DM的矿物质，包括钾、镁、钙、钠、锰、锌和铁；痕量肽/蛋白质和痕量CA1化合物；
-1.5％/MS的鞣花酸和没食子酸形式的多酚。
上述干提取物通过重量分析法基于液体提取物中存在的溶剂蒸发之前和之后的质量而获得。
总抗坏血酸(抗坏血酸+脱氢抗坏血酸)使用HPLC/外部校准方法来确定。
柠檬酸和苹果酸通过HPLC/DEDL方法通过外部校准来确定。
总糖使用HPLC/DEDL方法通过外部校准来确定。
多酚通过HPLC/DAD通过外部校准来确定。
矿物质根据从NF EN ISO 11885标准(NF EN ISO 11885方法是通过ICP/OES的分析方法)改编的方法进行测定。
缩略语表：
-HPLC：高效液相色谱
-DAD：二极管阵列检测器
-DEDL：蒸发光散射检测器
-ICP-OES：电感耦合等离子体发射光谱
实施例2：E1疑拟香桃木果提取物对疲劳状态下真皮成纤维细胞培养物中ATP合成 的影响
这项研究的目的是确定通过复制和营养缺乏的培养基引起“疲劳”的真皮成纤维细胞培养物中ATP合成的水平。这些培养物用0.1％(体积/体积)、即在培养基中稀释1/1000的E1提取物处理。
方案：真皮成纤维细胞培养物通过多次复制(使用15至20次传代的细胞)并且通过营养不足的培养基(无葡萄糖)饲养3天引起“疲劳”。这些培养物从应激的第二天到应激的剩余两天用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理，即48小时处理。在第四天，进行施用0.1％E1疑拟香桃木果提取物1分钟，然后通过发光法确定ATP(Abcam-ref:ab113849)。
结果：与未处理的“疲劳”成纤维细胞相比，用E1疑拟香桃木果提取物处理48小时后，ATP水平增加+104％。与未处理的“疲劳”成纤维细胞相比，用E1疑拟香桃木果提取物处理1min后，ATP水平增加+82％。结果示于图1中。
结论：用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理“疲劳的”成纤维细胞导致ATP合成增加。
实施例3：E1疑拟香桃木果提取物对疲劳状态下真皮成纤维细胞培养物的肌酸激 酶活性的作用
这项研究的目的是确定真皮成纤维细胞培养物中肌酸激酶活性的水平。该酶的功能是催化肌酸向磷酸肌酸的转化，从而提供快速可用的能量储备。
在用0.1％E1疑拟香桃木果提取物(体积/体积)(即在培养基中稀释1/1000)处理的“疲劳”真皮成纤维细胞的培养物上进行活性测量。
方案：真皮成纤维细胞培养物通过多次复制(使用15至20次传代的细胞)并且通过营养不足的培养基(无葡萄糖)饲养3天引起“疲劳”。这些培养物从应激的第二天到应激的剩余两天用0.1％E1疑拟香桃木果提取物，或用4μg/mL的维生素C作为阳性对照处理。处理开始后两天，使用试剂盒(Abcam-ref:ab155901)进行肌酸激酶活性的测量。
为此目的，将成纤维细胞与试剂盒中包含的CK缓冲液分离，回收并且在4℃以4000g离心5分钟。然后根据试剂盒规程测量各样品的活性。动力学通过与Gen5软件耦合的Synergy 2光谱仪(Biotek)进行比色读取而获得。
结果：在细胞“疲劳”的情况下，肌酸激酶活性降低-51％。与未处理的“疲劳”细胞相比，用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理，这种酶活性增加+62％，而使用维生素C处理仅增加+44％。结果示于图2中。
结论：用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理细胞防止“疲劳”细胞的肌酸激酶活性降低，其比用维生素C实测的作用更重大。
实施例4：E1疑拟香桃木果提取物对“疲劳”状态下重建真皮的COL1A1型胶原蛋白 qPCR测量的影响
这项研究的目的是确定从通过复制和营养缺乏的环境中引起疲劳的成纤维细胞重建的真皮等同物中的胶原蛋白I信使RNA(mRNA)水平。这些培养物用0.1％E1疑拟香桃木果提取物(体积/体积)(即在培养基中稀释1/1000)处理。
方案：真皮成纤维细胞培养物通过多次复制(使用15至20次传代的细胞)并且通过营养不足的培养基(无葡萄糖)饲养2天引起“疲劳”。在这两天期间，这些培养物也用0.1％E1疑拟香桃木果提取物(体积/体积)(即稀释1/1000)处理。使用如下物质作为对照：保持在DMEM 1g/L葡萄糖培养基中的成纤维细胞培养物(经过4至10次传代)，所述葡萄糖培养基补充有10％(v/v)胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺(Lonza)和100μg/mL Primocine(Invivogen)。
从这些成纤维细胞和胶原蛋白培养物中，重建真皮等同物。一旦完成重构，在第0天(J0)、第1天(J1)和第2天(J2)添加一次0.1％E1疑拟香桃木果提取物。在第5天(J5)，将真皮冷冻在-80℃。
然后将真皮融化以提取总RNA。
为此，使用Gentle MACS(Mylteni)压碎真皮，并且使用mirVana*miRNA分离试剂盒(AM1561,Ambion)提取总RNA。然后将RNA使用具有RNase抑制剂的高容量cDNA逆转录试剂盒(4374966，Life technologies)逆转录。最后，在具有TaqMan*基因表达预混液(4369514，Life technologies)和TaqMan*基因表达测定(Life technologies)的StepOnePlus热循环仪(Applied Biosystems)上进行实时PCR反应。Ct(循环阈值)比较方法用于目标的相对定量，而StepOne*软件(Applied Biosystems)用于数据处理。
结果：与未疲劳的成纤维细胞相比，在成纤维细胞“疲劳”的情况下，胶原蛋白I信使RNA(mRNA)的水平降低-58％。当这些成纤维细胞与0.1％E1疑拟香桃木过提取物一起培养时，胶原蛋白I信使RNA(mRNA)的水平增加+773％。结果示于图3中。
结论：在等同物真皮重建之前和之后，用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理“疲劳”成纤维细胞导致胶原蛋白I的信使RNA(mRNA)增加。
实施例5：E1疑拟香桃木果提取物对正常人角质形成细胞(KHN)培养物的11b-HSD1 和11b-HSD2的qPCR测量的影响
这项研究的目的是确定角质形成细胞的11b-HSD1和11b-HSD2的信使RNA(mRNA)水平。11b-HSD酶催化活性皮质醇转化为非活性可的松。皮质醇水平与焦虑和心理压力有关，这可能会导致皮肤疲劳体征。这些培养物用0.1％E1疑拟香桃木果提取物(体积/体积)(即在培养基中稀释1/1000)处理。
方案：培养角质形成细胞，每天用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理一次持续24小时和48小时。通过实时PCR测量11b-HSD1和11b-HSD2的信使RNA(mRNA)水平。
为此，将总RNA使用mirVana*miRNA分离试剂盒(AM1561,Ambion)提取，然后使用具有RNase抑制剂的高容量cDNA逆转录试剂盒(4374966，Life technologies)逆转录。最后，在具有TaqMan*基因表达预混液(4369514，Life technologies)和TaqMan*基因表达测定(Life technologies)的StepOnePlus热循环仪(Applied Biosystems)上进行实时PCR反应。Ct(循环阈值)比较方法用于目标的相对定量，而StepOne*软件(Applied Biosystems)用于数据处理。
结果：用E1疑拟香桃木提取物处理的KHN中，处理24小时和48小时后，11b-HSD1的水平分别降低了-67％和-84％。处理24和48小时后，11b-HSD2的水平分别增加+15％和+23％。结果示于图4中。
结论：用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理角质形成细胞导致11b-HSD1信使RNA(mRNA)水平降低和11b-HSD2信使RNA(mRNA)水平增加。
实施例6：E1疑拟香桃木果提取物对疲劳状态下重建的真皮形态的影响
这项研究的目的是创建一个重建的“疲劳”的人皮肤模型。为此，使用成年供体角质形成细胞和呼吸链抑制剂(鱼藤酮)重建皮肤，造成能量不足。
呼吸系统链抑制剂(如鱼藤酮)的使用造成线粒体功能障碍，包括ATP耗竭。因此，在我们的模型中，缺乏细胞能量等同于细胞疲劳状态(Han G等人，The mitochondrialcomplex I inhibitor rotenone induces endoplasmic reticulum stress andactivation of GSK-3βin cultured rat retinal cells,Invest Ophthalmol VisSci.31；55(9):5616-28,2014)。在重建过程中，将这些培养物用0.1％E1疑拟香桃木果提取物(体积/体积)(即在培养基中稀释1/1000)或1％(体积/体积)(即稀释1/100稀释)处理。
方案：在表皮重建的第12天，将鱼藤酮添加到培养基中。保持对照条件而不添加鱼藤酮，但无论如何都更换培养基。用抑制剂温育3小时后，将培养基更换为含有0.1％E1疑拟香桃木果提取物的新培养基，并且将表皮再次温育48小时。安慰剂条件包括在培养基中含有PBS(磷酸盐缓冲盐水)。然后通过苏木素-伊红(HE)染色观察皮肤形态。
为此，将重建的真皮用甲醛固定，然后包埋在石蜡中。然后切成4μm。
为了染色，将切块用二甲苯和乙醇浴脱蜡，然后漂洗。先后通过苏木素和伊红浴完成染色。
然后在显微镜(Eclipse E600,Nikon)下检查切块，并且使用Q-capture采集软件(QImaging*)拍摄照片。
结果：在用鱼藤酮处理重建的真皮的情况下，我们观察到比对照更薄的表皮，并且基底层受损较大。当用0.1％E1疑拟香桃木提取物处理后，似乎对表皮结构的损害较小。结果示于中图5.
结论：用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理重建的真皮似乎部分弥补了鱼藤酮抑制呼吸链引起的能量缺乏。
实施例7：E1疑拟香桃木果提取物对疲劳状态下重建的真皮中PFKFB3表达的影响
这项研究的目的是确定“疲劳”的重建的人皮肤模型中PFKFB3(6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3)的表达水平。
PFKFB3参与糖酵解过程。它是可诱导的酶，通过表皮的活性上皮细胞来表达。它能激活酶PFK-1(磷酸果糖激酶-1)，从而限制这种糖酵解过程。
为了获得“疲劳”的皮肤，可使用成年供体角质形成细胞和呼吸链抑制剂(鱼藤酮)对其进行重建，以产生能量不足(参见实施例6)。在重建过程中，将这些培养物用0.1％E1疑拟香桃木果提取物(体积/体积)(即在培养基中稀释1/1000)处理。
方案：在表皮重建的第12天，将鱼藤酮添加到培养基中。保持对照条件而不添加鱼藤酮，但无论如何都要更换培养基。用抑制剂温育3小时后，将培养基更换为含有0.1％E1疑拟香桃木果提取物的新培养基，并且将表皮再次温育48小时。安慰剂条件在培养基中含有PBS(磷酸盐缓冲盐水)。PFKFB3表达的检测通过间接免疫荧光技术进行。
为此，将重建的真皮用甲醛固定，然后包埋在石蜡中。然后切成4μm切块。
为了染色，将切块用二甲苯和乙醇浴脱蜡，然后漂洗。为了暴露特定的抗原结合位点，将切块在微波炉的柠檬酸盐缓冲液浴中加热，然后用胰蛋白酶溶液处理。在用5％BSA饱和30分钟以封闭非特异性位点后，将切块用PFKFB3抗体溶液温育1.5小时，然后用偶联至荧光染料(Alexa488,Invitrogen)的抗兔二抗溶液温育1小时。然后在Epi荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M显微镜)下检查切块。根据获得的照片，使用图像分析软件(PerkinElmer，Inc.)对荧光进行定量。
结果：在用鱼藤酮处理重建的真皮的情况下，与未经应激的表皮相比，我们观察到PFKFB3表达降低了-20％。当将这些用0.1％或1％E1疑拟香桃木果提取物处理时，其表达分别增加+19％和+46％。结果示于图6中。
结论：用鱼藤酮处理的重建的真皮显示PFKFB3减少，反映糖酵解减少。用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理这些“疲劳”的重建的真皮似乎可部分地补偿由刺激PFKFB3合成所实测的能量不足。
实施例8：E1疑拟香桃木果提取物对疲劳状态下重建的真皮中肌酸激酶活性的影 响
这项研究的目的是确定重建的人皮肤模型中肌酸激酶活性的水平。该酶的功能是催化肌酸向磷酸肌酸的转化，从而提供快速可用的能量储备。
在使用成人供体角质形成细胞和呼吸链抑制剂(鱼藤酮)造成能量缺乏的“疲劳”的重建的人皮肤模型上进行该活性测量。在重建过程中，将这些培养物用0.1％E1疑拟香桃木果提取物(体积/体积)(即在培养基中稀释1/1000)处理。
方案：在表皮重建的第12天，将鱼藤酮添加到培养基中。保持对照条件而不添加鱼藤酮，但无论如何都要更换培养基。用抑制剂温育3小时后，将培养基更换为含有0.1％E1疑拟香桃木果提取物的新培养基，并且将表皮再次温育48小时。安慰剂条件在培养基中含有PBS(磷酸盐缓冲盐水)。使用试剂盒(Abcam-ref：ab155901)进行肌酸激酶活性的测量。
为此，使用具有包含在试剂盒中的CK缓冲液的玻璃杵将重建的真皮捣碎，回收，并且在4℃以4,000g离心5分钟。然后根据试剂盒规程测量各样品的活性。动力学通过与Gen5软件耦合的Synergy 2光谱仪(Biotek)进行比色读取而获得。
结果：在重建的真皮“疲劳”的情况下，与非“疲劳”的表皮相比，肌酸激酶活性降低了-40％。与“疲劳”模型相比，通过用0.1％E1疑拟香桃木果提取物进行处理，该酶活性增加了+29％。结果示于图7中。
结论：用0.1％E1疑拟香桃木果提取物处理重建的真皮防止在“疲劳”的重建皮肤模型上实测的肌酸激酶活性下降。
实施例9：丝绒霜调配物
制备方法：
1.在主烧杯中，添加水，并且通过加热至70-75℃开始均质化。
2.喷洒Natrosol Plus 330CS，混合均匀30分钟。
3.喷洒Solagum AX，混合均匀20分钟。
4.将相成分添加到第二烧杯中，加热至70-75℃。
5.将相C添加至相A同时均质化。
6.在70-75℃，将相D添加到主烧杯中，混合均匀。乳液应该是均匀的。
7.开始冷却。在50℃逐一添加相E成分，每次添加后，混合均匀。
8.在25℃，添加相F，均质化。
9.预混相G直到获得澄清均匀的混合物。添加至主烧杯，混合均匀。
10.在25℃停止。
11.外观：白色乳状液；不透明。pH：4.4-4.8；粘度(D0)：12000-20000cps(Brookfield RVT/Spindle B/5RPM/1分钟/25℃)
12. 28天后通过有效性的双重测试验证了调配物的保存。然而，防腐剂并未以其最低有效水平进行优化。
实施例10：维他果(Vitafruit)霜凝胶调配物
制备方法：
1.在主烧杯中，逐一添加相A的成分，加热至70℃同时混合直至完全均质化。
2.喷洒聚合物FlexiThixTM并且均质化直到获得均匀的混合物。
3.在单独烧杯中，加热相C(除AntaronTM/GanexTM Sensory聚合物之外)至70℃直至均质化。然后在搅拌下将Antaron/Ganex Sensory聚合物浸渍在相C中。
4.在70℃，添加相C(Antaron/Ganex Sensory聚合物呈湿粉末形式)至主烧杯，均质化。
5.冷却。
6.在25℃，缓慢添加相D并且混合直至完全均质化。
7.添加相E并且混合直至完全均质化(粘度增加)。
8.在室温，在搅拌下预混合相F，添加主烧杯的内容物并且混合均匀。
9.当混合物颜色均匀时停止。
10.外观：橙色乳白霜凝胶；pH：6.0-6.5；粘度(D0)：25000-40000cps(BrookfieldRVT/Spindle B/5RPM/1分钟/25℃)。
11.通过3个月的加速老化测试和28天后的效力测试验证调配物的保存。然而，防腐剂没有以其最低有效水平进行优化。
参考文献
(1)Myoda,T.；Fujimura,S.；Park,B.；Nagashima,T.；Nakagawa,J.；Nishizawa,M.Int.J.Food Agric.Environ.2010,8(2),304.
(2)Yazawa,K.；Suga,K.；Honma,A.；Shirosaki,M.；Koyama,T.J.Nutr.Sci.Vitaminol.(Tokyo)2011,57(1),104.
(3)Kaneshima,T.；Myoda,T.；Toeda,K.；Fujimori,T.；Nishizawa,M.Biosci.Biotechnol.Biochem.2017,81(8),1461.
(4)Fracassetti,D.；Costa,C.；Moulay,L.；Tomás-Barberán,F.A.FoodChem.2013,139(1–4),578.
(5)Zanatta,C.F.；Mercadante,A.Z.Food Chem.2007,101(4),1526.
(6)Zanatta,C.F.；Cuevas,E.；Bobbio,F.O.；Winterhalter,P.；Mercadante,A.Z.J.Agric.Food Chem.2005,53(24),9531.
(7)Akter,M.S.；Oh,S.；Eun,J.-B.；Ahmed,M.Food Res.Int.2011,44(7),1728.
(8)Justi,K.C.；Visentainer,J.V.；Evelázio de Souza,N.；Matsushita,M.Arch.Latinoam.Nutr.2000,50(4),405.
(9)Zapata,S.M.；Dufour,J.-P.J.Sci.Food Agric.1993,61(3),349.
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