一种广谱抗菌的苯甲酰胺化合物、制备方法和用途
阅读说明：本技术 一种广谱抗菌的苯甲酰胺化合物、制备方法和用途 (Broad-spectrum antibacterial benzamide compound, preparation method and application ) 是由 张可煜 王霄旸 王春梅 郑海红 王满梅 费陈忠 张丽芳 王艳平 江雪佳 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供及一种具有抗多种细菌活性的苯甲酰胺类新化合物及其制备方法和用途,所述化合物为3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺,该化合物分子量小、结构相对简单,合成获得容易,而抑菌实验证实具有抑制性强、杀伤效果好等特点,能够显著抑制常见的需氧或微需氧菌,如：金黄葡萄球菌、沙门氏菌、肠球菌等常见感染细菌。同时,还能长时间有效地抑制细菌的生长和繁殖。因此在抗菌方面具有的巨大开发潜力。(The invention provides a benzamide new compound with multiple bacterial activity resistance, a preparation method and application thereof, wherein the compound is 3, 4-dichloro-N- (5-nitrothiazole-2-yl) benzamide, the compound has the characteristics of small molecular weight, relatively simple structure and easy synthesis, and a bacteriostatic experiment proves that the compound has the characteristics of strong inhibition, good killing effect and the like, and can obviously inhibit common aerobic or microaerophilic bacteria, such as: staphylococcus aureus, salmonella, enterococcus and other common infectious bacteria. Meanwhile, the growth and the propagation of bacteria can be effectively inhibited for a long time. Therefore, the antibacterial agent has great development potential in the aspect of antibiosis.)
技术领域
本发明涉及化合物及其合成与应用，具体而言，本发明涉及一种具有抗多种细菌活性的苯甲酰胺类新化合物及其制备方法和用途，更具体的，涉及3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺及其制备方法和用途。
背景技术
随着二十世纪抗菌药物的不断出现，使以前若干原本难以治疗的细菌感染性疾病不再成为绝症。然而，随着抗菌药物的不断问世及其在全球范围内的广泛大量应用，细菌对抗生素的耐药性日益突出，至80 年代末已发展成为严重的公共卫生问题。例如：耐甲氧西林金黄葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus，MRSA），目前已经成为医院内一种常见的严重传染致病菌；耐药的沙门氏菌菌株常在碎肉中被检出。而近年来，各种超级耐药菌更是相继出现，继2010年研究人员检出能够耐受碳青酶烯类抗生素的产NDM-1菌后，2015年又报道了携带mcr-1的多粘菌素耐药菌等。这些超级细菌的出现使得抗生素疗法的最后防线被突破，细菌感染的治疗面临无药可用的风险，引起了人们的广泛关注甚至极大恐慌。为保障人类健康和畜牧业健康持续发展，开发有效的治疗方案和寻找新型抗菌药物或抗菌增效剂势在必行。
硝唑尼特（NTZ），化学名称为2-乙酰氧基-N（5-硝基-2-噻唑）苯甲酰胺，最初于1976年由英国的Romark实验室合成。21世纪初，美国FDA批准硝唑尼特作为首个专门用来治疗隐孢子虫感染的药物，在美国、新西兰、澳大利亚等多个国家上市,然而在中国还未上市。硝唑尼特是一种很好的抗寄生虫药物和抗病毒药物，应用十分广泛。然而，硝唑尼特的抗菌活性十分微弱，仅对厌氧菌如：脆弱类杆菌（Bacterooides fragilis）、幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、难辨梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile）等具有较好的抗菌效果，但是对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄葡萄球菌等常见感染的需氧或微需氧菌却几乎没有抗菌效果。（见文献Nitazoxanide InhibitsBiofilm Formation by Staphylococcus epidermidis by Blocking Accumulation onSurfaces. ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, July 2010, p. 2767–2774;Activities of Tizoxanide and Nitazoxanide Compared to Those of Five OtherThiazolides and Three Other Agents against Anaerobic Species. ANTIMICROBIALAGENTS AND CHEMOTHERAPY, Mar. 2006, p. 1112–1117）。因此，国内外都有科学家将硝唑尼特进行结构改造，以期获得抗难辨梭状芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌等厌氧菌效果更好的硝唑尼特衍生物。
在长期的硝唑尼特及其主要代谢物替唑尼特（TIZ）研究中，我们发现人们对硝唑尼特进行了大量的分子结构改造。改造主要从硝唑尼特分子的两个基团上进行，一是苯环、二是噻唑环。例如，我国的张晗等（见文献：硝唑尼特衍生物的合成及其抗菌定量构效关系研究，中国农业科学院，学位论文，2012）合成了两类硝唑尼特衍生物（噻唑类和嘧啶类），结果显示，7个化合物最小抑菌浓度（MIC)小于等于 4μg/mL，但是其测试细菌仅为厌氧菌——难辨梭状芽孢杆菌。其所涉及的化合物主要为苯环上进行苯环上进行氟取代或三氟甲烷取代的化合物，其药物合成成本高，环境污染风险大，且得到的新化合物并未改善对常见需氧或微需氧菌抗菌活性的提高。国外相关的改造则主要集中在对噻唑环上硝基的替代以及苯环上进行甲基化修饰，但得到的化合物同样对常见需氧或微需氧菌的抗菌活性没有提高。本研究是在我们已经证明硝唑尼特及其主要代谢物替唑尼特（TIZ）具有抗炎、激活细胞自噬等功能的基础上对硝唑尼特进行进一步的改造和修饰，得到了一系列未见报道的新化合物，而这些新化合物不仅容易合成获得，且经过筛选后发现新的化合物3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺对常见需氧或微需氧菌的抗菌效果比硝唑尼特及其已经报道的衍生物具有极大的提高，且对耐药的金黄色葡萄球菌等抗菌效果显著，在较低的剂量下（2～4μg/mL）就能长时间抑制细菌（耐药菌）繁殖。因此，新化合物3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺已经克服了硝唑尼特及其衍生物对常见感染的需氧或微需氧菌几乎没有抗菌效果的难题，将对细菌感染的防治，尤其对耐药菌的扩散和防治将起到非常重要的作用，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种广谱抗菌的苯甲酰胺化合物和该化合物的制备方法及其应用。
进一步的，本发明所述的苯甲酰胺化合物为3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺。
进一步的，本发明的目的是这样实现的：
一种新苯甲酰胺类化合物—3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺，该化合物具有下式结构（式I）：
（I）
所述化合物的制备方法，包括以下化学反应：
3,4-二氯苯甲酰氯 (Ⅱ)与2-氨基-5-硝基噻唑 (Ⅲ)通过酰氯和氨基反应生成3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺(I)。具体地：
其中，优选的，所述步骤具体为：
称取约2～5 mmol的2-氨基-5-硝基噻唑 (式Ⅲ)，投入到100 mL的三口烧瓶中，加入15～20 mL非质子溶剂（优选为THF，即四氢呋喃或CH2Cl2），磁力搅拌至完全溶解，冰盐浴，待冷却至-5℃～0℃后加入1.2～1.5 eq（当量）的有机胺溶液（优选为三乙胺）。2～6 mmol的3,4-二氯苯甲酰氯 (式Ⅱ)溶于5～10 mL THF，然后通过恒压滴液漏斗缓慢滴加入反应体系中。滴加完毕后撤去冰浴，反应0.5～1h后加入适量DMAP（对二甲氨基吡啶）。以石油醚：乙酸乙酯作为展开剂，薄层色谱监控反应至无原料时，加入冰水，搅拌至有黄色物质析出后，抽滤，得到土黄色固体的粗产物，烘干。乙醇重结晶，得到黄色晶状物。
所述3,4-二氯苯甲酰氯 (式Ⅱ)与2-氨基-5-硝基噻唑 (式Ⅲ)均为本领域内常见的成熟商业化产品。
进一步的，本发明提供一种含有有效量的3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）作为活性成分或其可药用盐和可药用载体的一种抗多种细菌的药物组合物，对多种细菌具有抗菌效果，其测试细菌对3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）的敏感性（MIC值）相对于NTZ得到数倍的提升。
所述组合物可以包含药学上可接受的载体、辅料和/或赋形剂。
进一步的，本发明提供了一种药物制剂、化妆品或清洁用品，其包含式(I)化合物或其异构体、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐和一种或多种药学上或化妆品上可接受的载体、辅料和/或赋形剂。
优选地，所述药物制剂为固体制剂、外用制剂、喷剂或液体制剂。
优选地，所述化妆品或清洁用品为牙膏、漱口水或消毒液。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型、外用制剂、喷剂等等。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。
进一步的，这些细菌包括蜡样芽孢杆菌、马腺疫链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠球菌、多杀性巴氏杆菌等，其中抗蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值甚至达1 µg/mL，对肠球菌、沙门氏菌的MIC值也达到4µg/mL。且3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）对多株对现有市售抗菌药物耐药的细菌具有很好的抗菌效果。相对于衍生物母体硝唑尼特和替唑尼特，3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）的抗菌活性也得到显著提高。
有益效果
本发明的化合物分子量小、结构相对简单，合成制备工艺简单易得；抑菌实验证实其已经克服了硝唑尼特及其衍生物对常见感染的需氧或微需氧菌几乎没有抗菌效果的难题，表现出对常见诱发机体感染的需氧或微需氧菌具有抑制性强、杀伤效果好等特点，能够以较低剂量长时间显著抑制常见需氧或微需氧菌的生长和繁殖，如：金黄葡萄球菌、沙门氏菌、肠球菌等常见感染细菌。同时，抑菌实验证实其对耐药细菌也具有很好的抗菌效果，因此，3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）在抗菌方面具有的巨大开发潜力。
附图说明
图1-4 3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）和NTZ对蜡样芽孢杆菌（CVCC2002）和S.aureus 的抑菌生长曲线，其中，图1、图2分别为3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）抑制CVCC2002和S.aureus的生长曲线，图3、图4分别为NTZ抑制CVCC2002和S.aureus的生长曲线。
具体实施方式
下面的实施例是本发明说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限制。
实施例中所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例中所用溶解剂为二甲基亚砜，它的功能为对药物增加溶解性、渗透性，对实验细胞或动物体无毒性作用。
实施例1：3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）的制备
采用一步法合成。通过酰氯和杂环（或苯）胺化合物反应合成目标化合物。称取约3mmol的2-氨基-5-硝基噻唑 (式Ⅲ)，投入到100 mL的三口烧瓶中，加入15 mL THF（四氢呋喃），磁力搅拌至完全溶解，冰盐浴，待冷却至0℃后加入1.2～1.5 eq（当量）三乙胺。3.6mmol的3,4-二氯苯甲酰氯 (式Ⅱ)溶于5 mL THF，然后通过恒压滴液漏斗缓慢滴加入反应体系中。滴加完毕后撤去冰浴，反应半小时后加入适量DMAP（对二甲氨基吡啶）。以石油醚：乙酸乙酯作为展开剂，薄层色谱监控反应至无原料时，加入冰水，搅拌至有黄色物质析出后，抽滤，得到土黄色固体的粗产物，烘干。乙醇重结晶，得到黄色晶状物。反应物经核磁共振氢谱、质谱、红外光谱等对目标化合物的结构进行分析鉴定：
黄色固体，产率64.6%，mp 223.9-224.6℃；1HNMR (400 MHz, dmso) δ 8.74 (s, 1H),8.40 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 3.33 (s, 1H), 1.23 (s,1H). HR-MS (ESI): m/z calcd. For C10H5Cl2N3O3S [M-H]-: 315.93; found: 315.80。
实施例2：3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）的抗菌应用
采用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）VET01-A4推荐的微量肉汤稀释法测定目标衍生化合物最低抑菌浓度（MIC）值。
实施例中所用细菌包括质控菌株和临床分离菌株，质控菌株：大肠杆菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）由本实验室保存。蜡样芽孢杆菌（CVCC2002）、多杀性巴氏杆菌（CVCC469）、马腺疫链球菌（CVCC556）购自中国兽药监察所菌种保存库。临床分离菌株：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌、气单胞菌、肠球菌等35株细菌由本实验室分离、鉴定并保藏。
将目标产物用DMSO配制浓度为1280 µg/mL的药液，使用0.22 μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存。菌种复苏，从-80℃冰箱取出菌种，然后转接到含有5 mL MH培养基摇菌管中，37℃振荡培养12-24h。用生理盐水调节菌悬液浓度至0.5麦氏浓度标准后，用MH培养基稀释1000倍待用。在96孔板的第1列孔加入160 µL MH培养基，再加入40 µL的1280 µg/mL药物原液。第2列至第12列孔都加入100 µL MH培养基，然后吸取第1列的混合液100 µL加到第2列，吸取第2列的混合液100 µL加到第3列，依次二倍稀释到第12列，弃掉第12列的混合液100 µL，最后向第1列至第12列加入100 µL上述稀释好的菌液。第1列至第12列孔中的药物终浓度分别为128 µg/mL、64 µg/mL、32 µg/mL、16 µg/mL、8 µg/mL、4 µg/mL、2 µg/mL、1 µg/mL、0.5 µg/mL、0.25 µg/mL、0.125 µg/mL、0.0625 µg/mL。同时设置阳性对照（恩诺沙星）、阴性对照（不加菌液）、溶剂对照（将原药液换成DMSO），重复试验3次。将96孔板放入37℃恒温培养箱培养24h后，肉眼观察96孔板，底部无白色沉淀，溶液清亮，无细菌生长的最低药物浓度即为该药的MIC。
按上述方法测定硝唑尼特、替唑尼特、对照药物恩诺沙星以及其它常用抗菌药物（亚胺培南、美罗培南、多粘菌素B）的MIC值。
结果显示：对照药物恩诺沙星对质控菌株ATCC25922和ATCC25923的MIC值均为0.03 µg/mL。根据CLSI文件中微量肉汤稀释法所示恩诺沙星对ATCC25922、ATCC25923的MIC允许范围分别为0.008~0.03 µg/mL、0.03～0.12 µg/mL，判定本试验测得的MIC值结果可靠。
3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）对蜡样芽孢杆菌（CVCC2002）、马腺疫链球菌（CVCC556）、金黄色葡萄球菌临床分离菌株都表现出较好的抑菌效果，对蜡样芽孢杆菌的MIC值为1 µg/mL，对马腺疫链球菌的MIC值为2 µg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC值为1~2 µg/mL。对大肠杆菌、屎肠球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌等也具有一定的抗菌作用，对鸡沙门氏菌和肠球菌的MIC值也能达到4 µg/mL。尤其是对美罗培南、亚胺培南耐药的金黄色葡萄球菌临床分离菌株（S.aureus 2、4）具有较好的抗菌作用，其MIC值为1 µg/mL，其抗菌活性远远高于衍生物母体硝唑尼特和替唑尼特。文献报道也证实衍生物母体硝唑尼特和替唑尼特仅对厌氧菌具有较好的抗菌效果，对常见的芽孢杆菌、马腺疫链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等细菌敏感性很差，在厌氧培养体系中对金黄色葡萄球菌的MIC值也在8~16 µg/mL，见参考文献（Nitazoxanide Inhibits Biofilm Formation byStaphylococcus epidermidis by Blocking Accumulation on Surfaces.ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, July 2010, p. 2767–2774; Activities ofTizoxanide and Nitazoxanide Compared to Those of Five Other Thiazolides andThree Other Agents against Anaerobic Species. ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY, Mar. 2006, p. 1112–1117）。结果见表1。
表1 细菌对3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）及市售抗菌药物的敏感性（MIC，µg/mL）
菌株
恩诺沙星
I
NTZ
TIZ
多粘菌素B
美罗培南
亚胺培南
ATCC25922
0.03
16
128
128
8
0.25
0.06
ATCC25923
0.03
16
64
64
4
0.06
0.125
CVCC2002
0.06
1
128
64
–
–
–
CVCC556
0.5
2
64
64
–
–
–
CVCC469
8
16
128
128
–
–
–
<i>S.aureus 1</i>
128
2
128
64
16
8
2
<i>S.aureus 2</i>
>128
2
64
64
8
128
128
<i>S.aureus 3</i>
>128
1
128
64
32
16
1
<i>S.aureus 4</i>
>128
2
64
64
8
128
>128
<i>S.aureus 5</i>
2
2
128
64
8
0.25
8
<i>S.aureus 6</i>
2
1
64
64
4
1
0.06
<i>S.aureus 7</i>
>128
1
128
64
16
128
1
<i>S.aureus 8</i>
1
1
64
32
8
2
0.125
<i>E.faecalisF26C2</i>
4
4
128
128
–
–
–
<i>E.faecalis F30C</i>
2
8
128
128
–
–
–
<i>E.faecalis F40C</i>
64
64
128
128
–
–
–
<i>E.Faecium 20-5</i>
64
8
64
64
–
–
–
<i>E.Faecium 1624</i>
64
8
64
64
–
–
–
<i>E.Faecium 1765</i>
>128
16
128
128
–
–
–
<i>E.coli1E</i>
2
64
128
128
2
0.06
0.125
<i>E.coli3E</i>
0.06
64
128
128
2
0.06
0.125
<i>E.coli 4E</i>
0.06
64
128
128
4
0.06
0.5
<i>E.coli 5E</i>
1
16
128
128
2
0.06
0.25
<i>E.coli7E1</i>
16
16
128
128
2
0.125
0.5
<i>E.coli8E1</i>
16
16
128
128
1
0.125
0.5
<i>E.coli 8E2</i>
16
16
128
128
0.5
0.125
0.5
<i>EHEC 5</i>
64
8
128
128
1
0.06
2
<i>Salmonella D4</i>
8
16
128
128
>128
8
2
<i>Salmonella D6</i>
0.06
4
128
128
1
0.06
0.25
<i>Salmonella D9</i>
0.06
4
128
128
1
0.06
0.25
<i>Salmonella D14</i>
0.06
4
128
128
0.5
0.06
0.25
<i>Salmonella D16</i>
0.06
4
128
128
1
0.06
0.25
<i>Salmonella 5</i>
2
8
128
128
–
–
–
<i>Salmonella 17</i>
1
16
128
128
–
–
–
<i>Salmonella 21</i>
1
128
>128
>128
–
–
–
<i>A.hydrophila</i>
1
32
128
64
–
–
–
<i>Proteus SXJ</i>
128
32
128
128
<i>Proteus YN</i>
0.5
32
128
128
<i>K.Pneumoniae 11-B</i>
2
64
128
128
4
0.015
0.125
<i>K.Pneumoniae Apr44</i>
16
32
128
128
8
0.015
0.125
注：–表示未测定，CVCC2002为蜡样芽孢杆菌，CVCC556为马腺疫链球菌，CVCC469为多杀性巴氏杆菌，E.coli为大肠杆菌，EHEC 5为肠出血性大肠杆菌，S.aureus为金黄色葡萄球菌（其中S.aureus 1和2为MRSA），A.hydrophila为气单胞菌, E.Faecium为屎肠球菌,E.faecalis为粪肠球菌, Salmonella为沙门氏菌, Proteus为变形杆菌，K.Pneumoniae 为肺炎克雷伯菌。
实施例3：3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）对细菌生长繁殖的抑制作用
以蜡样芽孢杆菌（CVCC2002）、金黄色葡萄球菌（S.aureus 3）为试验菌株，以105 cfu/mL菌液浓度为起始实验细菌浓度，添加不同浓度的3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）、NTZ后，在37℃、180 rpm的摇床中震荡培养后，每隔1.5 h取1 mL 在630nm处测定不同浓度的菌液的OD值，设三个重复，计算OD的平均值。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制抑菌生长曲线。
从图1-4中结果可以看出：在7.5h前，2 µg/mL的3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）一直对蜡样芽孢杆菌具有很好的抑制效果，但7.5h后抑制效果减弱，细菌逐渐繁殖；而2 µg/mL以上浓度3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）在整个细菌生长期都能显著性地抑制细菌的繁殖；而2 µg/mL的3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）对 S.aureus 3的抑制效果很弱，从6h开始4 µg/mL的3,4-二氯-N-(5-硝基噻唑-2-基)苯甲酰胺（式I）对S.aureus 3的抑制效果显著增强，随着剂量的增加抑菌效果不断增加，到128 µg/mL浓度时细菌在整个检测期内完全被抑制。而NTZ在高浓度时也有很好的抑制细菌生长的效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进、组合、简化等，均应包含在本发明的保护范围之内。