阅读说明：本技术 一种由单一蛋白形成的智能水凝胶 (Intelligent hydrogel formed by single protein ) 是由 曾安平 张心怡 任杰 聂晶磊 于 2020-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物材料领域,具体涉及一种由单一蛋白质形成的具有催化活力的智能性水凝胶。所述智能水凝胶是将来源于大肠杆菌的硫辛酸连接酶蛋白(LplA)稀释于缓冲溶液中,通过控制体系的理化条件形成的。所述智能水凝胶具有温度敏感性和可逆性,临界温度范围为8℃-80℃,高于临界温度时形成水凝胶,降温时回复溶液状态,并且该可逆转变过程可重复30次以上,同时具有温度响应灵敏,转变温度范围在2℃以内,温度响应时间短(3min内)的优点。所述水凝胶还可以通过调节pH和离子浓度控制凝胶状态。可广泛以用于三维细胞培养、药物缓释、靶向治疗药物制备、美容护肤品及温度传感等组织工程及医学美容领域中。(The invention belongs to the field of biological materials, and particularly relates to an intelligent hydrogel which is formed by a single protein and has catalytic activity. The intelligent hydrogel is formed by diluting lipoic acid ligase protein (LpIA) derived from escherichia coli into a buffer solution and controlling the physicochemical conditions of a system. The intelligent hydrogel has temperature sensitivity and reversibility, the critical temperature range is 8-80 ℃, the hydrogel is formed when the critical temperature is higher than the critical temperature, the solution state is recovered when the temperature is reduced, the reversible transformation process can be repeated for more than 30 times, and the intelligent hydrogel has the advantages of sensitive temperature response, transformation temperature range within 2 ℃ and short temperature response time (within 3 min). The hydrogel can also control the gel state by adjusting the pH and ion concentration. Can be widely used in the tissue engineering and medical cosmetology fields of three-dimensional cell culture, drug sustained release, targeted therapy drug preparation, beauty skin care products, temperature sensing and the like.)

一种由单一蛋白形成的智能水凝胶

技术领域：

本发明属于生物材料领域，具体的说，本发明涉及一种由单一蛋白质形成的具有催化活力的智能性水凝胶。

背景技术：

水凝胶是三维网状结构空隙中分散介质为水的分散体系。智能水凝胶是指一类随环境因素如温度，溶液特性，离子浓度及pH值的变化而形态在溶液和凝胶之间改变的特殊水凝胶。通常来讲，智能性水凝胶会根据外界的物理刺激或者化学刺激，发生相应的转变。

在众多的智能性水凝胶中，由于温敏型智能水凝胶不引入其它物质，只需温度变化、简单易操作、环境友好型等特点，备受关注。智能温敏型水凝胶是一种随温度变化而形态在溶液和凝胶之间可逆改变的特殊水凝胶，在细胞组织培养，药物缓释，靶向治疗，美容护肤品及温度传感上都有很强的应用前景。

已报道智能温敏型水凝胶主要分为天然和人工合成两类，其中天然温敏型水凝胶主要有壳聚糖类、纤维素类、透明质酸及木聚糖类，来源丰富但均为聚合物及混合物，没有单一明确的分子结构，修饰改性较为困难。人工合成温敏型水凝胶有聚乙二醇类、聚丙烯酰胺类及聚氧乙烯等，但具有响应速度慢，生物相容性差的缺陷，而且合成目标分子所需嵌段聚合反应工艺要求相对较高，稳定性相对较差，环境不友好，应用成本高。近来，也有研究者开发了基于多肽，蛋白质及核糖核酸(DNA)的人工合成温敏型水凝胶，有较好的生物相容性。但目前未见报道由具有生物催化活性的蛋白质形成的智能温敏型水凝胶。

发明内容

：

本发明涉及一种基于天然蛋白质的智能型水凝胶，制备工艺简单，对环境友好，易于稳定大量制备，并且可以通过蛋白质工程改变其凝胶性质。

所述天然蛋白质为来源于大肠杆菌的硫辛酸连接酶蛋白(LplA)，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其基因序列如SEQ ID No.2所示；或者，

所述蛋白质为与SEQ ID No.2所示序列具有80％以上同源性的硫辛酸连接酶蛋白，进一步地具有90％以上同源性，更进一步地具有99％以上同源性；或者，

所述蛋白质是在SEQ ID No.2所示序列的两端增加了一定长度的核苷酸编码的蛋白；

所述增加的核苷酸包括但不限于6个组氨酸序列(His-tag)、谷胱甘肽巯基转移酶标签蛋白序列(GST-tag)、或麦芽糖结合蛋白标签序列(MBP-tag)；

所述蛋白质还可以是SEQ ID No.1所示硫辛酸连接酶蛋白(LplA)的突变体，所述突变体产生的突变影响蛋白二聚体的形成；

进一步地，所述突变体是在SEQ ID NO.1基础上产生以下突变位点中至少一个的蛋白：S252、H267、D269、R277、Q279、G248、P251、C57、C303或C313；

更进一步地，所述突变体是在SEQ ID NO.1基础上产生以下突变位点中至少一个的蛋白：S252A、H267A、D269A或Q279A。

所述智能水凝胶是将硫辛酸连接酶蛋白(LplA)稀释于缓冲溶液中，通过控制体系的理化条件形成的，所述的理化条件为温度、pH或缓冲液离子浓度；通过控制体系的温度、pH或缓冲液离子浓度，影响蛋白质之间氢键的形成，进而影响蛋白质二聚体的形成，使得体系在凝胶和溶液态之间转变；

进一步地，所述智能水凝胶通过控制温度形成，临界温度范围为8℃-80℃，高于临界温度时形成水凝胶，降温时回复溶液状态；更近一步地，临界温度范围为10℃-50℃；

进一步地，所述智能水凝胶通过控制pH形成，成胶pH范围为2-12,在该pH范围内形成水凝胶；更近一步地，成胶pH范围为4.2-9；

进一步地，所述智能水凝胶通过控制离子浓度形成，成胶离子浓度范围为5-500mM，在该离子浓度范围内形成水凝胶；更近一步地，成胶离子浓度范围为50-100mM。

所述LplA浓度为0.01-5mM，优选浓度为0.05-2mM；

所述缓冲溶液包括但不限于Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液和醋酸盐缓冲液；

本发明还提供上述智能型水凝胶在三维细胞培养、药物缓释、靶向治疗药物制备、美容护肤品及温度传感等组织工程及医学美容领域中的应用。

有益效果：

本发明首次报到一种由单一蛋白质构成的可逆温度敏感性水凝胶，具有低临界溶液温度(LCST,Lower Critical Solution Temperature)，其在低温下呈现自由流动的溶胶态，升高至一定温度可迅速转变为凝胶态，温度降低时又迅速恢复至溶液态。较传统的天然壳聚糖类及纤维素类等的温敏型水凝胶，本发明的水凝胶由单一蛋白质构成，有明确的分子结构，易于改造与修饰。较聚乙二醇类及聚丙烯酰胺类等的人工合成温敏型水凝胶，本发明的水凝胶由纯生物手段制备，避免了化学聚合反应的高温、高压条件，避免了有机溶剂的使用及残留，绿色环保，生物安全性高，且制备工艺简单成熟。

本发明的水凝胶具有温度响应灵敏，在2℃以内完成溶液态到凝胶的转变，温度响应时间短(3min内)的优点。

本发明的水凝胶具有温度可逆性，温度升高形成凝胶态，温度降低变为溶液状态，并且该可逆转变过程可重复30次以上。

此外，本发明公开的水凝胶还具有pH敏感性和离子浓度敏感性，可分别通过温度、pH以及缓冲液的离子浓度调节凝胶状态。

附图说明：

图1 LplA(1mM)水凝胶的流变性质；

图2不同pH和不同缓冲溶液中LplA的凝胶情况；

图3 LplA和5个突变体在常温下的成胶情况；

图4 LplA蛋白间氢键形成示意图。

具体实施方式

：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所涉及的硫辛酸连接酶蛋白(LplA)，可通过氨基酸序列人工合成获得，也可通过基因工程的手段构建重组菌进行表达、分离和纯化获得，表达宿主包括并不限于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)；表达载体包括并不限于质粒pET28a，pET22b，pET21a等；限制性内切酶包括并不限于NcoI和XhoI等，以下实施例将通过基因工程手段对蛋白表达和制备及应用进行示例性的说明。

在本发明中，用于形成凝胶的蛋白可以是SEQ ID NO.1所示的硫辛酸连接酶蛋白，也可以是与SEQ ID NO.1所示的硫辛酸连接酶蛋白的编码基因具有一定同源性的蛋白，如与SEQ ID No.2所示序列具有80％以上同源性，进一步地具有90％以上同源性，更进一步地具有99％以上同源性的核苷酸序列编码的蛋白；或者，是在SEQ ID No.2所示序列的两端增加了一定长度的核苷酸编码的蛋白，优选地，所述增加的核苷酸包括但不限于6个组氨酸序列(His-tag)、谷胱甘肽巯基转移酶标签蛋白序列(GST-tag)、或麦芽糖结合蛋白标签序列(MBP-tag)；或者，是在SEQ ID NO.1基础上发生突变的蛋白，该突变可以影响蛋白二聚体形成，如所述突变体发生以下位点的突变：S252、H267、D269、R277、Q279、G248、P251、C57、C303或C313，优选地，所述突变体是在SEQ ID NO.1基础上产生以下突变位点中至少一个的蛋白：S252A、H267A、D269A或Q279A。

SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：

MGSTLRLLISDSYDPWFNLAVEECIFRQMPATQRVLFLWRNADTVVIGRAQNPWKECNTRRMEEDNVRLARRSSGGGAVFHDLGNTCFTFMAGKPEYDKTISTSIVLNALNALGVSAEASGRNDLVVKTVEGDRKVSGSAYRETKDRGFHHGTLLLNADLSRLANYLNPDKKKLAAKGITSVRSRVTNLTELLPGITHEQVCEAITEAFFAHYGERVEAEIISPNKTPDLPNFAETFARQSSWEWNFGQAPAFSHLLDERFTWGGVELHFDVEKGHITRAQVFTDSLNPAPLEALAGRLQGCLYRADMLQQECEALLVDFPEQEKELRELSAWMAGAVR

在本发明中，温度、pH和缓冲液离子浓度分别都可以影响LplA水凝胶的形成，将LplA溶于Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲液中，通过控制体系的温度、pH或缓冲液的离子浓度，影响蛋白质之间氢键的形成，进而影响蛋白质二聚体的形成，使得体系在凝胶和溶液态之间转变。

其中，不同理化条件的LplA蛋白溶液对应不同的临界温度，该临界温度在10-80℃之间，优选地在10-50℃之间，温度高于临界温度时溶液变成凝胶，低于临界温度时回复溶液状态。如：在pH为5.0-8.0，离子浓度为100-500mM的体系中，若LplA的浓度为0.01-0.05mM，凝胶态的临界转变温度范围为60-80℃，若LplA的浓度为0.05-0.10mM，凝胶态的临界转变温度范围为40-60℃，若LplA的浓度为0.10-0.30mM，凝胶态的临界转变温度范围为23-40℃，若LplA的浓度为0.3-1.0mM，凝胶态的临界转变温度范围为13-23℃，若LplA的浓度为1-4mM，凝胶态的临界转变温度为8-13℃；

其中，不同理化条件的LplA蛋白溶液对应不同的成胶pH，该成胶pH在2-12之间，优选地在4.2-9.0之间。如在温度为20-50℃，离子浓度为100-500mM的体系中，若LplA浓度为0.1-0.6mM，成胶pH范围为5.0-8.0，若LplA浓度为0.6-1mM，成胶pH范围为4.5-8.5，若LplA浓度为1-2mM，成胶pH范围为4.2-9.0；

其中，不同理化条件的LplA蛋白溶液对应不同的成胶离子浓度，该成胶离子浓度在5-500mM之间。如在温度为20-50℃，pH为5.0-8.0的体系中，LplA的浓度为0.1-0.6mM时，成胶离子浓度范围为100-500mM；LplA的浓度为0.6-1mM时，成胶离子浓度范围为50-500mM；LplA的浓度为1-2mM时，成胶离子浓度范围为5-500mM。

本发明所采用的缓冲溶液包括但不限于Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲液。

在本发明中，还包括一些形成凝胶的优选条件，比如：

在LplA浓度为1mM，温度13℃条件下，当缓冲液pH为5.0-8.0左右时，形成凝胶态；pH为8.5-10左右时为溶液态；

在LplA浓度为1mM，温度20℃条件下，当缓冲液pH为5.0-8.5左右时，形成凝胶态；pH为9.0-10左右时为溶液态；

在LplA浓度为1mM，温度38℃条件下，当缓冲液pH为5.0-9.0左右时，形成凝胶态；pH为9.5-10左右时为溶液态；

在LplA浓度为0.6mM，温度38℃条件下，当缓冲液pH为5.0-8.5左右时，形成凝胶态；pH为9.0-10.0左右时为溶液态；

在LplA浓度为1mM，温度13℃，pH7.5条件下，缓冲液离子浓度在0.1-50mM时形成溶液态，在100-500mM时为凝胶态；

在LplA浓度为1mM，温度38℃，pH7.5条件下，缓冲液离子浓度在0.1-5mM时形成溶液态，在10-500mM时为凝胶态；

在LplA浓度为0.6mM，温度20℃，pH7.5条件下，缓冲液离子浓度在0.1-50mM时形成溶液态，在100-500mM时为凝胶态；

在LplA浓度为0.6mM，温度38℃，pH7.5条件下，缓冲液离子浓度在0.1-5mM时形成溶液态，在10-500mM时为凝胶态。

以下将通过具体实施例对本发明做进一步地解释说明。

实施例1基因工程菌的构建

本实施例通过对SEQ ID No.2所示的目标基因的克隆，构建目标蛋白的表达载体，并将表达载体导入大肠杆菌中实现表达生产。本实施例具体操作包括：从NCBI上获得目标基因序列，并在目的序列的N端***NcoI限制性酶切位点，C端***XhoI限制性酶切位点，进行体外基因合成。利用NcoI和XhoI两个限制性内切酶位点，通过酶切酶连的方式与pET28a表达载体相连。而后，将构建成功的pET28a-LplA表达载体转化进入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)细胞中，构建重组大肠杆菌工程菌。

实施例2基因工程菌的发酵

构建成功的大肠杆菌工程菌在含卡那霉素(50μg/mL)的4mL LB培养基中，以37℃，220r/min的条件培养至OD₆₀₀为1.8～2.0时，制备种子液。以1％的接种量将该种子液转入含有卡那霉素(50μg/mL)的200mL LB培养基中，以37℃，220r/min条件培养至OD₆₀₀为0.7时，加入0.2mM的IPTG 30℃诱导目的蛋白表达，12h后收集菌体。

所述的LB培养基成分为：胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L和酵母粉5g/L。

实施例3 LPLA蛋白的制备

LPLA蛋白的制备方法如下：

(1)将收集的菌体用10mL的Tris-HCl(50mM，pH 7.5)缓冲溶液重悬后，使用匀浆破碎仪进行破胞处理；

(2)破胞液在10000×g条件下离心30min，离心后的上清液经0.45μM的滤膜过滤后，上样于填充了Ni-Sepharose的柱子上，并用含有不同咪唑浓度的Buffer进行梯度洗脱；

a.Buffer A和Buffer B洗去非特异性结合的蛋白；

b.用Buffer C洗脱目标蛋白；

(3)收集目标蛋白，使用截留量为30kDa的超滤管将目标蛋白溶液的体积浓缩至1mL以下；

(4)再通过批次添加Tris-HCl(50mM，pH 7.5)缓冲溶液，批次离心的方式将目标蛋白的溶液体系更换为50mM，pH 7.5的Tris-HCl缓冲溶液，利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，根据实验需要稀释到0.1-2mM(低温保存)。

所述的Tris-HCl缓冲溶液是指：三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，随后用HCl调节pH至7.5后的混合溶液。

所述亲和层析柱所用的缓冲溶液如下：

实施例4：蛋白催化活力测定

本发明使用的天然蛋白是具有脂化催化活力的催化蛋白，其可以催化硫辛酸与大肠杆菌来源H蛋白的脂化反应，形成酯化形态的H蛋白(H_lip),具体测定方法如下。

将来源于大肠杆菌体内甘氨酸裂解系统(GCS)的H蛋白基因(NCBI NO.为WP_001295377.1)按照酶切酶连方式连接到表达载体pET28a上，构建pET-28a质粒并转化到大肠杆菌细胞中，并进行培养、纯化得到H蛋白。

向体积为0.2mL的反应体系中加入终浓度为2mM的ATP,2mM的MgCl₂,2mM的lipoate，0.5的mM DTT,0.1mM的LplA与10μΜ的H蛋白，并用pH为7.5的Tris-HCl缓冲溶液补足终体积。在38℃条件下反应1h后，沸水浴加热90s终止反应。将样品离心过膜(0.22μm)，利用配有Shim-pack Inertsil WP300-C18色谱柱(5μm，4.6×150mm)的高效液相色谱(HPLC)在210nm下对终产物--脂化形式的H蛋白(H_lip)进行定量分离检测，测定LplA的催化活力为66nmol/min/mg(酶活定义为1mg酶1分钟反应得到的H_lip的物质的量)。

流动相为：(A)：去离子水(ddH20)中加入0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA，trifluoroaceticacid)；(B)：乙腈(CH3CN)中加入0.095％(v/v)TFA，流速1mL min-1，柱温30℃。

洗脱条件：梯度洗脱，25min内流动相(B)由30％变化至90％。

实施例5：LplA蛋白水凝胶物理表征

试管倒置法：在50mM Tris-HCl(pH 7.5)作为缓冲溶液，蛋白浓度为1.0mM，温度为4℃的条件下，取适量LplA蛋白水溶液于容器/微量试管中，25℃放置，蛋白溶液逐渐凝固为不透明、白色的水凝胶，倒置后长时间不会滑落，整个凝胶过程可在180秒内实现。将水凝胶重新置于4℃环境中冷却后，将回复为透明无色水溶液，并且该可逆转变过程可重复30次以上。

将上述体系在Rheomix600P转矩流变仪上进行检测，测试转速为40rpm，温度变化从10℃升温至60℃，升温速率为1℃/min。实验结果如图1，在13℃-14℃左右有明显的性质转变，粘度开始增大，此时体系由溶液态变为凝胶态，温度在2℃以内完成了溶液到凝胶的转变，对温度响应灵敏。在约45℃后粘度发生跳跃变化，此时蛋白变性，结构已经发生不可逆变性。

临界转变温度随LplA浓度变化而变化，温度高于临界温度时溶液变成凝胶，低于临界温度时回复溶液状态。

实施例6：pH与缓冲液离子类型对成胶的影响

利用实例1-3中的方法制得蛋白溶液，最后将蛋白的溶液环境更换为50mM不同离子类型的(Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液和醋酸盐缓冲液)和不同pH梯度的缓冲液，蛋白浓度稀释至1mM，蛋白溶液置于室温下(20℃)观察成胶情况，LplA在pH6.6，7.5的Tris-HCl缓冲溶液、pH5.8，7.5的磷酸盐缓冲溶液、pH5.8，6.6柠檬酸盐缓冲溶液和pH5.0，5.8醋酸盐缓冲液中均可以形成凝胶，实验结果如图2。

实施例7：LplA蛋白水凝胶的蛋白质改造

水凝胶中LplA以二聚体的形式存在，维持二聚体的主要作用力为两个LplA分子C末端β12～β14片层的氢键和芳环-芳环相互作用及两结构域连接区，涉及氨基酸残基分别为：S252、H267、D269、R277、Q279、G248、P251、C57、C303及C313。通过使用MutⅡFast Mutagenesis Kit对LplA蛋白进行定点突变，再用实施例1-3同样的表达和纯化方法得到突变体蛋白溶液，检测其是否具有形成水凝胶的性质，如图3。

根据实验结果，发现S252A、H267A、D269A和Q279A突变体会使成胶转变温度升高(1mM LplA在pH 7.5Tris-HCl缓冲溶液中野生型临界转变温度约为13℃，S252A约为16℃，H267A约为19.5℃，D269A约为17℃，Q279A约为18℃)，R277A、G248P和P251G突变体无法形成凝胶。这些突变位点集中在蛋白质C段的β折叠区，可以与另一分子蛋白两两作用形成氢键(见图4)，蛋白质分子间氢键，进而形成二聚体是导致水凝胶形成重要影响因素，本发明将形成氢键的极性氨基酸突变为丙氨酸后，氢键作用减弱，形成二聚体难度提升，成胶温度升高甚至不能成胶。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种由单一蛋白形成的智能水凝胶

<130> 1

<141> 2020-06-04

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 339

<212> PRT

<213> 大肠杆菌()

<400> 1

Met Gly Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ile Ser Asp Ser Tyr Asp Pro Trp

1 5 10 15

Phe Asn Leu Ala Val Glu Glu Cys Ile Phe Arg Gln Met Pro Ala Thr

20 25 30

Gln Arg Val Leu Phe Leu Trp Arg Asn Ala Asp Thr Val Val Ile Gly

35 40 45

Arg Ala Gln Asn Pro Trp Lys Glu Cys Asn Thr Arg Arg Met Glu Glu

50 55 60

Asp Asn Val Arg Leu Ala Arg Arg Ser Ser Gly Gly Gly Ala Val Phe

65 70 75 80

His Asp Leu Gly Asn Thr Cys Phe Thr Phe Met Ala Gly Lys Pro Glu

85 90 95

Tyr Asp Lys Thr Ile Ser Thr Ser Ile Val Leu Asn Ala Leu Asn Ala

100 105 110

Leu Gly Val Ser Ala Glu Ala Ser Gly Arg Asn Asp Leu Val Val Lys

115 120 125

Thr Val Glu Gly Asp Arg Lys Val Ser Gly Ser Ala Tyr Arg Glu Thr

130 135 140

Lys Asp Arg Gly Phe His His Gly Thr Leu Leu Leu Asn Ala Asp Leu

145 150 155 160

Ser Arg Leu Ala Asn Tyr Leu Asn Pro Asp Lys Lys Lys Leu Ala Ala

165 170 175

Lys Gly Ile Thr Ser Val Arg Ser Arg Val Thr Asn Leu Thr Glu Leu

180 185 190

Leu Pro Gly Ile Thr His Glu Gln Val Cys Glu Ala Ile Thr Glu Ala

195 200 205

Phe Phe Ala His Tyr Gly Glu Arg Val Glu Ala Glu Ile Ile Ser Pro

210 215 220

Asn Lys Thr Pro Asp Leu Pro Asn Phe Ala Glu Thr Phe Ala Arg Gln

225 230 235 240

Ser Ser Trp Glu Trp Asn Phe Gly Gln Ala Pro Ala Phe Ser His Leu

245 250 255

Leu Asp Glu Arg Phe Thr Trp Gly Gly Val Glu Leu His Phe Asp Val

260 265 270

Glu Lys Gly His Ile Thr Arg Ala Gln Val Phe Thr Asp Ser Leu Asn

275 280 285

Pro Ala Pro Leu Glu Ala Leu Ala Gly Arg Leu Gln Gly Cys Leu Tyr

290 295 300

Arg Ala Asp Met Leu Gln Gln Glu Cys Glu Ala Leu Leu Val Asp Phe

305 310 315 320

Pro Glu Gln Glu Lys Glu Leu Arg Glu Leu Ser Ala Trp Met Ala Gly

325 330 335

Ala Val Arg

<210> 2

<211> 1020

<212> DNA

<213> 大肠杆菌()

<400> 2

atgggctcca cattacgcct gctcatctct gactcttacg acccgtggtt taacctggcg 60

gtggaagagt gtatttttcg ccaaatgccc gccacgcagc gcgttctgtt tctctggcgc 120

aatgccgaca cggtagtaat tggtcgcgcg cagaacccgt ggaaagagtg taatacccgg 180

cggatggaag aagataacgt ccgcctggcg cggcgcagta gcggtggcgg cgcggtgttc 240

cacgatctcg gcaatacctg ctttaccttt atggctggca agccggagta cgataaaact 300

atctccacgt cgattgtgct caatgcgctg aacgcgctcg gcgtcagcgc cgaagcgtcc 360

ggacgtaacg atctggtggt gaaaaccgtc gaaggcgacc gcaaagtctc aggctcggcc 420

tatcgcgaaa ccaaagatcg cggcttccac cacggcacct tgctactcaa tgccgacctc 480

agccgcctgg caaactatct caatccggat aaaaagaaac tggcggcgaa aggcattacg 540

tcggtacgtt cccgcgtgac caacctcacc gagctgttgc cggggatcac ccatgagcag 600

gtttgcgagg ccataaccga ggcctttttc gcccattatg gcgagcgcgt ggaagcggaa 660

atcatctccc cgaacaaaac gccagacttg ccaaacttcg ccgaaacctt tgcccgccag 720

agtagctggg aatggaactt cggtcaggct ccggcattct cgcatctgct ggatgaacgc 780

tttacctggg gcggcgtgga actgcatttc gacgttgaaa aaggccatat cacccgcgcc 840

caggtgttta ccgacagcct caaccccgcg ccgctggaag ccctcgccgg acgactgcaa 900

ggctgcctgt accgcgcaga tatgctgcaa caggagtgcg aagcgctgtt ggttgacttc 960

ccggaacagg aaaaagagct acgggagtta tcggcatgga tggcgggggc tgtaaggtag 1020