阅读说明：本技术 一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒、重组菌及构建方法和应用 (Recombinant plasmid and recombinant bacterium for expressing SARS-CoV-2N protein, construction method and application ) 是由 梁建国 于 2020-07-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒、重组菌及构建方法和应用,属于疫苗技术领域,所述重组质粒以pET-N-GST-Thrombin-C-His为骨架质粒,插入有编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列。本发明采用pET-N-GST-Thrombin-C-His表达载体表达SARS-CoV-2 N蛋白(新冠病毒核蛋白),SARS-CoV-2 N蛋白的表达量高,且表达得到的SARS-CoV-2 N蛋白能够保持良好的蛋白活性,进而能够应用于多个免疫学检测平台,来辅助监控新冠病毒的感染和爆发。(The invention provides a recombinant plasmid for expressing SARS-CoV-2N protein, recombinant bacteria, a construction method and application, belonging to the technical field of vaccines, wherein the recombinant plasmid takes pET-N-GST-Thrombin-C-His as a skeleton plasmid, and is inserted with a full-length sequence of a gene for coding SARS-CoV-2N protein. The invention adopts pET-N-GST-Thrombin-C-His expression vector to express SARS-CoV-2N protein (new coronavirus nucleoprotein), the expression quantity of the SARS-CoV-2N protein is high, and the SARS-CoV-2N protein obtained by expression can keep good protein activity, and further can be applied to a plurality of immunological detection platforms to assist in monitoring the infection and the outbreak of the new coronavirus.)

一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒、重组菌及构建方法 和应用

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，尤其涉及一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒、重组菌及构建方法和应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(简称新冠病毒，英文名SARS-CoV-2)，也称为严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，是冠状病毒科乙型冠状病毒属，严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种的一个分型，是具有包膜的正链单股RNA，它造成了于2019年底暴发的2019新型冠状病毒感染的肺炎(COVID-19)。

新冠病毒病毒核衣壳内最重要的蛋白之一就是核衣壳蛋白(N蛋白)。N蛋白常作为冠状病毒诊断检测工具，是免疫学快速诊断试剂的核心原料。

目前，SARS-CoV-2 N蛋白用大肠杆菌表达获得比较困难，这是由于将N蛋白的编码序列克隆入一些表达载体后，常常发现其表达量符合要求，但是活性不够甚至丧失。因此，本领域迫切需要开发新的高效表达N蛋白或其片段的技术，以便能够大量生产供科研和诊断领域所需的N蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒、重组菌及构建方法和应用，利用本发明的重组质粒表达获得的SARS-CoV-2 N蛋白抗原性良好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒，所述重组质粒以pET-N-GST-Thrombin-C-His为骨架质粒，***有编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列；所述SARS-CoV-2 N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列在pET-N-GST-Thrombin-C-His上的***位点为SalⅠ和XhoⅠa。

本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌。

优选的，所述重组菌的原始菌包括大肠埃希菌BL21。

本发明还提供了上述方案所述重组菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列***到pMD-19T质粒上，得到扩增质粒；

2)以所述扩增质粒为模板，利用第一引物和第二引物进行PCR扩增，得到PCR产物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

3)对pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒进行酶切，得到pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒；

4)将所述pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒和所述PCR产物连接，得到重组质粒；

5)将所述重组质粒转入原始菌，得到表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组菌；

所述步骤1)和步骤3)之间没有时间顺序限制。

优选的，步骤1)中利用pMD-19T载体中的T克隆位点将所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列进行TA连接***。

优选的，步骤2)中所述PCR扩增的程序为：98℃10sec，55℃15sec，72℃2min，循环数为35个；所述PCR扩增的体系以50μl计包括以下组分：1×PrimeSTARMax Premix(2×)25μl、第一引物10pmol、第二引物10pmol、模板150ng和余量的灭菌蒸馏水；所述第一引物和第二引物的浓度分别为0.2μM。

优选的，步骤4)中所述连接的体系以20μl计，包括以下组分：2×Seamlesscloning Master Mix 10μl、pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒2μl、PCR产物5μl和余量的灭菌蒸馏水；所述连接的程序为：50℃反应20min。

本发明还提供了一种基于上述方案所述重组菌或者所述构建方法得到的重组菌制备SARS-CoV-2 N蛋白的方法，包括以下步骤：利用His标签镍柱提取和纯化重组菌的培养发酵液中的SARS-CoV-2 N蛋白。

优选的，所述重组菌的培养发酵液的获取方法包括：将所述重组菌接种于SOC液体培养基，于35～38℃条件下培养至菌液的光密度值为0.4～0.6，在菌液中加入终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG，于18～22℃条件下诱导12～14h，得到重组菌培养发酵液。

本发明的有益效果：本发明提供了一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒，所述重组质粒以pET-N-GST-Thrombin-C-His为骨架质粒，***有编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列。本发明采用pET-N-GST-Thrombin-C-His表达载体表达SARS-CoV-2 N蛋白(新冠病毒核蛋白)，SARS-CoV-2 N蛋白的表达量高，且表达得到的SARS-CoV-2 N蛋白能够保持良好的蛋白活性，进而能够应用于多个免疫学检测平台，来辅助监控新冠病毒的感染和爆发。

附图说明

图1为新冠核蛋白N基因核酸电泳图；

图2为新冠核蛋白WesternBlot蛋白印迹图；

图3为SDS-Page电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒，所述重组质粒以pET-N-GST-Thrombin-C-His为骨架质粒，***有编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列；所述SARS-CoV-2 N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：nucleocapsidphosphoprotein[Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2]

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPSTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。

在本发明中，所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，具体为：atgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaaacattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaagaaggctgatgaaactcaagccttaccgcagagacagaagaaacagcaaactgtgactcttcttcctgctgcagatttggatgatttctccaaacaattgcaacaatccatgagcagtgctgactcaactcaggcctaa。

在本发明中，所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列在pET-N-GST-Thrombin-C-His上的***位点优选为SalⅠ和XhoⅠa；所述pET-N-GST-Thrombin-C-His来源于常规时候，本发明具体实施过程中，所述pET-N-GST-Thrombin-C-His购自于碧云天生物技术有限公司。

本发明对所述N蛋白全长序列的来源没有特殊限制，本发明具体实施过程中，所述N蛋白全长序列优选的采用以下方法制备得到：对SARS-CoV-2病毒的RNA基因组进行反转录，得到cDNA；以cDNA为模板，利用第三引物和第四引物进行PCR扩增，得到N蛋白全长序列；本发明对所述SARS-CoV-2病毒的RNA基因组的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法或者常规病毒RNA基因组试剂盒提物获得；所述反转录的体系以20μl计，包括以下组分：5×PrimeScript IV cDNA Synthesis Mix 4μl，Random 6mers(50μM)0～2μl，SARS-CoV-2病毒的RNA基因组：total RNA≤5μg、poly(A)+RNA≤1μg和余量的RNase Free dH₂O；所述反转录的程序为：30℃10min(使用Random 6mers时)或者42℃10～20min(不使用Random 6mers时)后，95℃、5min或70℃、15min使酶失活后，冰上冷却。在本发明中，所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAG；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：TTA GGCCTGAGTTGAGTCAGCAC；所述PCR扩增的体系以50μl计，包括以下组分：PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl、第三引物10～15pmol、第四引物10～15pmol、模板≤200ng和余量的灭菌蒸馏水；所述第三引物和第四引物的终浓度独立优选为0.2～0.3μM；所述PCR扩增的程序为：98℃、10sec，55℃、15sec，72℃、10sec，35个循环。

本发明提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌；所述重组菌的原始菌优选的包括大肠埃希菌BL21。

本发明还提供了上述方案所述重组菌的构建方法，包括以下步骤：

1)将所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列***到pMD-19T质粒上，得到扩增质粒；

2)以所述扩增质粒为模板，利用第一引物和第二引物进行PCR扩增，得到PCR产物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；

3)对pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒进行酶切，得到pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒；

4)将所述pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒和所述PCR产物连接，得到重组质粒；

5)将所述重组质粒转入原始菌，得到表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组菌；

所述步骤1)和步骤3)之间没有时间顺序限制。

本发明首先将所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列***到pMD-19T质粒上，得到扩增质粒；本发明利用pMD-19T载体中的T克隆位点将所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的基因的全长序列进行TA连接***；本发明具体实施过程中，采用PrimeScript RT试剂盒将RNA进行反转录成DNA。

得到扩增质粒后，本发明以所述扩增质粒为模板，利用第一引物和第二引物进行PCR扩增，得到PCR产物；所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CGATATCGTCGACAGATCTCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATC；所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC。

在本发明中，所述第一引物和第二引物为同源臂引物，利用第一引物和第二引物进行无缝质粒克隆，进行基因克隆时没有酶切位点的限制，仅需在载体的预定克隆位点通过酶切进行线性化或通过PCR的方法直接制备线性化的载体，在***片段的两个PCR引物的5'端引入与载体克隆位点两端完全一致的15～25bp的重叠序列即可实现。

本发明对pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒进行酶切，得到pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒；所述酶切体系优选为：纯化的PCR片段100ng、线性化载体50ng、2XSeamless Cloning Mix 10μl和Nuclease free water 7μl，总体积20μl；所述酶切程序优选为：50℃孵育15min。

在本发明中，pET-N-GST-Thrombin-C-His是一种用于表达N端含GST标签(Glutathione S-transferase tag，GST tag)或C端含His标签(His tag)的重组蛋白的原核表达质粒，也用于表达N端含GST标签并且同时C端含His标签的重组蛋白。GST和His双标签有利于通过GST柱和镍柱两种方法来纯化目的蛋白，使目的蛋白的纯度更高。pET-N-GST-Thrombin-C-His的N端GST标签后有Thrombin酶切位点，可通过Thrombin蛋白酶切除N端的GST标签。

得到PCR产物和pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒后，本发明将所述pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒和所述PCR产物连接，得到重组质粒；所述连接的体系以20μl计，优选的包括以下组分：2×Seamless cloning MasterMix 10μl、pET-N-GST-Thrombin-C-His线性质粒2μl、PCR产物5μl和余量的灭菌蒸馏水；所述连接的程序优选为：50℃反应20min。

得到重组质粒后，本发明将所述重组质粒转入原始菌，得到表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组菌；所述转入的方式优选的包括水浴热激转化；所述水浴热激转化的温度优选为42℃，时间优选为90sec。

本发明还提供了一种基于上述方案所述重组菌或者所述构建方法得到的重组菌制备SARS-CoV-2 N蛋白的方法，包括以下步骤：利用His标签镍柱提取和纯化重组菌的培养发酵液中的SARS-CoV-2 N蛋白。

在本发明中，所述重组菌的培养发酵液的获取方法优选的包括：将所述重组菌接种于SOC液体培养基，于35～38℃条件下培养至菌液的光密度值为0.4～0.6，在菌液中加入终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG，于18～22℃条件下诱导12～14h，得到重组菌培养发酵液；所述重组菌的接种量为100μl/100mL SOC液体培养基；所述培养的温度优选为36～37℃，培养至菌液的光密度值优选为0.5；所述IPTG的终浓度优选为1mmol/L；所述诱导的温度优选为20℃；所述诱导的时间优选为13h。

在本发明中，所述SOC液体培养基以蒸馏水为溶剂，以1L计包括以下组成成分：胰蛋白胨20g、酵母粉5g、NaCl 0.5g、KCl 0.186g、MgCl₂0.95g、葡萄糖3.6g和余量的水；所述SOC液体培养基的pH值优选为7～7.4，更优选为7.2；本发明对所述SOC液体培养基的制备方法没有特殊限制，将上述组成成分充分混匀后灭菌即可；所述灭菌的方法优选为105℃高压灭菌30min。

得到重组菌的培养发酵液后，本发明利用His标签镍柱提取和纯化重组菌的培养发酵液中的SARS-CoV-2 N蛋白。本发明对所述利用His标签镍柱提取和纯化培养重组菌的发酵液中的SARS-CoV-2 N蛋白的具体方法没有特殊限制，采用本领域常规操作即可。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中采用的试剂如下所示：

SARS-Cov-2 RNA基因组由精准健康研究中心有限公司惠赠；

SARS-CoV-2阳性血清由精准健康研究中心有限公司惠赠；

PCR引物由上海生工合成；

测序服务由上海生工提供；

无缝克隆试剂盒购自上海生工；

PCR回收购自台湾Geneaid公司；

PrimerMax DNA聚合酶、PrimeScript RT试剂盒及pMD-19T克隆载体购自Takara；

pET-N-GST-Thrombin-C-His表达载体购自碧云天生物科技有限公司；

Ni-NTA琼脂糖纯化树脂购自美国QIAGEN公司；

X-Gal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside，IPTG)、

Amp及L-琼脂平板培养基购自Sigma；

HRP标记的兔抗人IgG购自美国Thermo公司。

其余试剂均为分析纯。

实施例1

1、SARS-Cov-2总cDNA合成反应

1)参照表1的反转录体系冰上配制以下反应液：

表1反转录体系

2)轻柔混匀后，按照以下条件进行反应30℃、10min，95℃、5min或使酶失活后，冰上冷却。

2、N蛋白基因扩增

根据GenBank数据库(基因组序列号为MN908947.3)公布的相关序列信息，设计病毒重组核蛋白(N蛋白)基因特异性引物(NP正向引物(第三引物)为5’-ATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAG-3’，如SEQ ID NO.3所示；NP反向引物(第四引物)为5’-TTAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC-3’，如SEQ ID NO.4所示)，并进行PCR扩增获得N蛋白全长序列，利用特异性引物扩增出的N蛋白全长序列的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测分析，结果参见图1，可见完整清晰的条带，与预期目的基因大小(1260bp)一致。

N蛋白全场序列PCR扩增体系如表2所示；

表2 N蛋白全场序列PCR扩增体系

PCR反应程序为：98℃10sec，55℃15sec，72℃2min，循环数为35个。

3、PCR片段纯化

1)取50μl PCR反应液加入1.5ml离心管中，向其中加入五倍体积溶液PB(或溶液PB預混溶液pH Indicator)，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。

2)将吸附柱DFH放入2ml收集管中，将上一步所得溶液加入吸附柱DFH中，以16，000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

3)向吸附柱DFH中加入600μl漂洗液Wash(已加入无水乙醇)，静置1min后以16，000×g离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱DFH放入收集管中，以16，000×g离心3min将吸附柱中残余的漂洗液去除。

4)将吸附柱DFH放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20μl洗脱缓冲液EB。室温放置2min，以16，000×g离心2min，收集DNA溶液。

4、用pMD-19T/N载体克隆PCR产物

PCR回收后用pMD-19T的试剂盒(TakarapMDTM19-TVector试剂盒)将回收PCR产物装载于pMD-19T质粒后转化DH5α感受态，挑取阳性克隆测序鉴定。

1)按照表3的配方在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

表3 pMD-19T质粒和PCR产物连接体系

pMD-19T Vector	1μl
		Insert DNA	0.2pmol
dH<sub>2</sub>O	补足至5μl

2)加入5μl(等量)的Solution I。

3)16℃反应30min。

4)全量(10μl)加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30min。

5)42℃加热45sec后，再在冰中放置1sec。

6)加入890μl SOC培养基，37℃振荡培养60min。

7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中***片段的长度大小。

9)挑选的菌落送到上海生工生物进行测序确认。

5、pET-N-GST-Thrombin-C-His/N重组表达载体的构建

以pMD-19T/N质粒为模板，用同源臂引物进行扩增，回收PCR产物。用生工无缝克隆试剂盒进行连接回收PCR产物和酶切(酶切位点SalⅠ和XhoⅠa)过的线性pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒进行连接。同源臂引物如下：NP32a正向引物(第一引物)为5’-CGATATCGTCGACAGATCTCATGTCTGATAATGGACCCCAAAATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；NP32a反向引物(第二引物)为5’-GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGCCTGAGTTGAGTCAGCAC-3’，如SEQ ID NO.2所示；所述PCR扩增的程序为：98℃10sec，55℃15sec，72℃2min，循环数为35个；所述PCR扩增的体系以50μl计包括以下组分：1×PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl、第一引物10pmol、第二引物10pmol、模板150ng和余量的灭菌蒸馏水；所述第一引物和第二引物的浓度分别为0.2μM。

表4回收PCR产物和线性pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒连接体系

组分	加入量
		2×Seamless cloning Master Mix	10μl
线性pET-N-GST-Thrombin-C-His质粒	2μl
		回收PCR产物	5μl
灭菌ddH<sub>2</sub>O	3μl
		共计	20μl

50℃反应20min。反应结束后，立即将离心管置于冰上冷却2min，待转化。

1)加入4μl的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育30min。

2)42℃水浴中热激90sec后快速放入冰上5min。

3)加入500μl SOC液体培养基，37℃孵育45min。

4)4000rpm离心3min收集菌体，将100μl菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。随机挑取单克隆PCR鉴定，结果阳性后送至上海生工进行测序。

6、SARS-CoV-2 N蛋白表达

经测序鉴定后，将重组pET-N-GST-Thrombin-C-His/N质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，于37℃振荡培养至光密度值为0.4后，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，20℃诱导过夜。得到培养发酵液。

7、经His标签镍柱纯化系统纯化新冠病毒重组的N蛋白

可溶性蛋白的破碎

1)收集培养发酵液，20℃，5000rpm离心8min，沉淀转移到离心管中，10℃，13000rpm离心1min，收集沉淀的菌体。

2)取8g菌体加40ml破碎缓冲液(20mM Tris)，加入Leupeptin(亮抑酶肽)与Pepstantin(胃酶抑素)终浓度1μg/ml，加入TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)终浓度1mM/ml。

3)把混合菌体在冰水中用超声探头破碎，超声3sec，间隔8sec。超声20min。

4)破碎的菌液4℃，13000rpm离心10min，取上清，再次4℃，13000rpm离心10min，然后把上清和沉淀分别留样，先做上清纯化，如果只沉淀中有目标蛋白，用变性条件对沉淀中的目标蛋白进行提取。

5)取纯化Ni柱，清洗干净柱子，加入4ml镍琼脂糖凝胶，用洗瓶清洗柱子5次，再用平衡液平衡柱子2次。

6)将柱子和上清充分结合，放置四维旋转混匀器上室温孵育2h后拿出纯化。

可溶性蛋白的纯化

平衡缓冲液：pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含20mM咪唑。

洗脱缓冲液：

①pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含50mM咪唑。

②pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含100mM咪唑。

③pH8.0的50mM Tris缓冲液含0.15M NaCl，含300mM咪唑。

1)过柱，流出FT，取样FT。

2)用20倍柱体积平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速1ml/min，直到流出液点样G250显示无蓝色是开始洗脱柱子上吸附的蛋白。

3)用50mM，100mM，300mM咪唑浓度分阶段洗脱柱子，洗脱5个柱体积，流速1ml/min，4ml/管收集。

4)将收集的各浓度梯度洗脱下来的蛋白，取样，跑SDS-Page。

5)根据SDS-Page电泳图(图3)，收集蛋白进行透析。

8、Western Blot蛋白质印迹法鉴定

重组SARS-CoV-2 N蛋白抗原纯化后，采用SARS-CoV-2 N阳性血清进行WesternBlot蛋白质印迹法鉴定，之后4℃保存备用。

1)Western Blot蛋白免疫印迹：取适量纯化的N蛋白，加入等量的2×样品缓冲液，100℃煮5min，离心12000g，5min，取上清，电泳分离：上样20μl至SDS-PAGE胶(10cm×10cm)电泳。

2)电泳分离(参照SDS-PAGE电泳方法)转膜：将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，用纯甲醇浸泡饱和5sec。装配转移三明治：海绵、3层滤纸、胶膜、3层滤纸、海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转移缓冲液，插上电极，100V，1h(电流约为0.3A)。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

3)免疫杂交与显色：用25ml TBS洗膜5min，室温，摇动。置膜于25ml封闭缓冲液中1h，25℃，摇动。15ml TBS/T洗3次(5min/T)。加入合适稀释度的新冠病人血清样本，25℃孵育2h，缓慢摇动。15ml TBS/T洗3次(5min/T)。加入1：20000稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。15ml TBS/T洗3次(5min/T)。15ml TBS洗1次。配制底物。使用0.3ml以确保印迹膜被底物完全浸湿，且不会变干。使用ECL底物孵育印迹膜1min。蛋白化学发光检测，通过胶片曝光或CCD成像系统对印迹膜进行成像。结果参见图2。

由上述实施例可以看出，本发明采用pET-N-GST-Thrombin-C-His表达载体能够大量表达SARS-CoV-2新冠病毒核蛋白抗原，同时保持良好的蛋白活性，进而能够应用于多个免疫学检测平台用于辅助监控新冠病毒的感染和爆发。

利用新冠病毒核蛋白抗原，可以通过胶体金免疫层析技术来检测患者静脉血或者指尖血，安全性和便捷性高于咽拭子采样，大大降低医护人员被感染和病毒传播风险，而且不需要任何设备，10min以内就可以获得检测结果。同时也能够利用新冠病毒核蛋白抗原生产ELISA试剂盒，能够大规模筛选被感染的人群，具有灵敏度高、速度快、性价比高等特点。

本发明的新冠病毒核蛋白抗原能够用于多种免疫学检测平台，具备表达量大、活性高的特点。该抗原的使用可弥补核酸检测条件要求高、耗时长、阳性率较低的不足之处，可作为疾病诊断的重要补充检测手段，有利于新冠病毒感染防控。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 梁建国

<120> 一种表达SARS-CoV-2 N蛋白的重组质粒、重组菌及构建方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgatatcgtc gacagatctc atgtctgata atggacccca aaatc 45

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtggtggtg gtggtgctcg aggcctgagt tgagtcagca c 41

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctgata atggacccca aaatcag 27

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaggcctga gttgagtcag cac 23

<210> 5

<211> 419

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)

<400> 5

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Ser Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 6

<211> 1260

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)

<400> 6

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260