阅读说明：本技术 一种透明质酸或其盐酶降解的方法 (Method for enzymatic degradation of hyaluronic acid or salt thereof ) 是由 乔莉苹 王珊珊 石艳丽 郭学平 李德杰 于鲁孟 周宁 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本申请涉及一种透明质酸或其盐酶降解的方法。该方法包括：底物溶液配制：混合葡萄糖氧化酶、葡萄糖、透明质酸或其盐和水以生成底物溶液；酶解：向底物溶液加入透明质酸酶或硫酸软骨素酶进行酶解,得到酶解液；纯化：对酶解液进行灭活得到低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。本申请的方法中添加了葡萄糖氧化酶,提高了透明质酸酶的活性,并去除透明质酸/盐酶解液中的氧气,减少或防止氧化褐变的发生,同时显著抑制酶解液中细菌的生长,酶解过程中不用额外添加防腐剂,提高低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的品质。(The present application relates to a method for enzymatic degradation of hyaluronic acid or a salt thereof. The method comprises the following steps: preparing a substrate solution: mixing glucose oxidase, glucose, hyaluronic acid or a salt thereof, and water to produce a substrate solution; enzymolysis: adding hyaluronidase or chondroitinase sulfate into the substrate solution for enzymolysis to obtain an enzymolysis solution; and (3) purification: inactivating the enzymolysis solution to obtain low molecular hyaluronic acid or oligomeric hyaluronic acid or salt thereof. The method has the advantages that the glucose oxidase is added, so that the activity of the hyaluronidase is improved, oxygen in the hyaluronic acid/salt enzymolysis liquid is removed, the occurrence of oxidative browning is reduced or prevented, the growth of bacteria in the enzymolysis liquid is obviously inhibited, no preservative is additionally added in the enzymolysis process, and the quality of the low-molecular hyaluronic acid or the oligomeric hyaluronic acid or the salt thereof is improved.)

一种透明质酸或其盐酶降解的方法

技术领域

本申请总地涉及透明质酸制备及纯化领域，具体涉及一种透明质酸或其盐酶降解的方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)又名玻璃酸或玻尿酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖，广泛地存在于人、动物的玻璃体、皮肤、脐带中，为人体中不可或缺的关键功能物质。

透明质酸根据其分子量的不同，具有很多不同的功能。通常，我们将分子量≥1000KDa的透明质酸定义为高分子透明质酸，把分子量10KDa～1000KDa的透明质酸定义为低分子透明质酸，分子量≤10KDa定义为寡聚透明质酸。

随着透明质酸分子量的降低，尤其是当分子量降低至10KDa以下时，透明质酸越来越容易被氧化从而发生氧化褐变，最终导致透明质酸溶液颜色变深，醇沉出来的粉末白度降低变黄。而采用透明质酸酶或者硫酸软骨素酶制备低分子及寡聚透明质酸及其盐结束时，需要对透明质酸酶进行灭活处理。传统的方法为高pH或者高温灭活，但是高pH或者高温的条件下，低分子及寡聚透明质酸及其盐更容易发生氧化褐变。而采用低pH灭活透明质酸酶又会对酶解用设备造成严重腐蚀。如何在透明质酸及其盐酶解及酶灭活过程中对透明质酸进行抗氧化保护，成为一个难题。

另外，Hélène Lenormand在2009年(The hyaluronan–protein complexes at lowionic strength:How the hyaluronidase activity is controlled by the bovineserum albumin,Matrix Biology Volume 28,Issue6,July 2009,Pages 365-372)报道当透明质酸酶与透明质酸的比例较低时，透明质酸会和透明质酸酶形成没有活性的络合物，严重降低透明质酸酶的酶解活性。随着透明质酸分子量的降低，络合物逐渐解离，将透明质酸酶释放出来。实验表明，在透明质酸酶解液中添加非催化蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)，这些蛋白质可以与透明质酸酶产生竞争作用，从而解放了酶解液中的透明质酸酶，恢复透明质酸酶的活性，但BSA浓度过高也会导致透明质酸酶活性的降低。此外，牛血清白蛋白价格昂贵，无法大规模应用于透明质酸酶解生产过程中。

发明内容

本申请的目的在于提供一种透明质酸或其盐酶降解的方法。

本申请提供了一种透明质酸或其盐酶降解的方法，包括：

底物溶液配制：混合葡萄糖氧化酶、葡萄糖、透明质酸或其盐和水以生成底物溶液；

酶解：向所述底物溶液加入透明质酸酶或硫酸软骨素酶进行酶解，得到酶解液；

纯化：对所述酶解液进行灭活得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。

可选地，根据上述的方法，所述纯化为向所述酶解液加入乙醇得到混合液，搅拌，过滤得到包含所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的过滤液。优选地，所述乙醇在所述混合液中的体积百分比浓度为20％～50％。更优选地，所述乙醇在所述混合液中的体积百分比浓度为20％～35％。

可选地，根据上述的方法，在所述纯化后还包括沉淀和脱水干燥。优选地，所述沉淀为向所述过滤液加入有机溶剂，混合均匀，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的沉淀。优选地，所述脱水干燥为将所述沉淀分离出来，脱水干燥，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。

可选地，根据上述的方法，在所述沉淀中，所述乙醇的添加量为所述过滤液体积的3～20倍。

可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖氧化酶为任意来源的葡萄糖氧化酶。所述葡萄糖氧化酶优选为已商品化的葡萄糖氧化酶。更优选为食品级或优级纯葡萄糖氧化酶。还优选为青霉生产的葡萄糖氧化酶。

可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖氧化酶的酶活单位≥10万U/g。

可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖氧化酶的添加量为每1000L所述底物溶液中加入10g～100g所述葡萄糖氧化酶。优选为每1000L所述底物溶液中加入10g～50g所述葡萄糖氧化酶。

可选地，根据上述的方法，所述透明质酸或其盐为任意高分子透明质酸或高分子透明质酸盐，任意低分子透明质酸或低分子量透明质酸盐。

可选地，根据上述的方法，所述透明质酸或其盐在所述底物溶液中的质量体积浓度为5％～30％。

可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖在所述底物溶液中的质量体积浓度为0.1‰～1‰。优选为0.1‰～0.4‰。

可选地，根据上述的方法，所述透明质酸酶或硫酸软骨素酶为微生物产透明质酸酶、蛇毒来源透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、哺乳动物来源透明质酸酶或硫酸软骨素酶。更优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)产透明质酸酶。最优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50，CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶。

可选地，根据上述的方法，所述透明质酸酶或硫酸软骨素酶的添加量为每1kg所述透明质酸或其盐加入1×10⁷～5×10⁹IU的所述透明质酸酶或硫酸软骨素酶。

本申请通过在透明质酸/盐酶解制备低分子及寡聚透明质酸/盐的过程中，创新性地添加葡萄糖氧化酶，防止透明质酸酶/透明质酸/盐比例过低时，透明质酸酶与透明质酸/盐络合物的产生，提高了酶解效率。

本申请通过在透明质酸/盐酶解制备低分子及寡聚透明质酸/盐的过程中，创新性地添加葡萄糖氧化酶及葡萄糖，去除了酶解液中的氧气，降低了低分子及寡聚透明质酸/盐的氧化褐变。

酶解结束后，本申请采用低度乙醇对透明质酸酶及葡萄糖氧化酶进行灭活及过滤去除，进而通过醇沉、干燥获得最终的低分子及寡聚透明质酸盐，摒弃了传统的碱性灭活或者高温灭活的方式，避免了碱性灭活或者高温灭活酶时对低分子及寡聚透明质酸/盐的氧化。

附图说明

图1为本申请实施例的透明质酸或其盐酶降解的方法流程示意图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本申请的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本申请的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本申请的限制。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本申请提及的方法中各步骤的执行顺序，除特别说明外，并不限于本文的文字所体现出来的顺序，也就是说，各个步骤的执行顺序是可以改变的，而且两个步骤之间根据需要可以***其他步骤。

针对酶解工艺制备透明质酸时，透明质酸/盐和透明质酸酶形成没有活性的络合物，透明质酸/盐易产生氧化的问题，发明人在透明质酸/盐酶解液中添加葡萄糖氧化酶，一方面葡萄糖氧化酶与透明质酸/盐提前结合，拮抗透明质酸酶-透明质酸/盐络合物的形成，提高了透明质酸酶的活性；另一方面可以去除透明质酸/盐酶解液中的氧气，减少或防止氧化褐变的发生，同时显著抑制酶解液中细菌的生长，酶解过程中不用额外添加防腐剂，提高低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的品质。

图1示出了本申请实施例的透明质酸或其盐酶降解的方法。

参见图1，本申请透明质酸或其盐酶降解的方法示例性包括：

S100底物溶液配制：混合葡萄糖氧化酶、葡萄糖、透明质酸或其盐和水以生成底物溶液。例如，先配制一定浓度的葡萄糖氧化酶溶液，依次加入葡萄糖、透明质酸或其盐，配制成底物溶液。该底物溶液还可添加酸或碱以调节其pH值。

S200酶解：在合适的酶解条件下，向所述底物溶液加入透明质酸酶或硫酸软骨素酶进行酶解，酶解一定时间得到酶解液。酶解条件为适合所用酶反应条件的任意条件。酶解时间可通过实时检测酶解液中透明质酸/盐的分子量确定，检测方法采用现有技术中常用的方法，在此不做限制。

S300纯化：对所述酶解液中的酶进行灭活得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。例如采用低浓度乙醇将酶灭活。低分子透明质酸或其盐是指分子量10KDa～1000KDa的透明质酸或其盐。寡聚透明质酸或其盐是指分子量≤10KDa的透明质酸或其盐。

根据一些实施例，纯化包括向所述酶解液加入乙醇得到混合液，搅拌，例如搅拌0.5～1h，过滤得到包含所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的过滤液。优选地，所述乙醇在混合液中的体积百分比浓度为20％～50％。更优选地，所述乙醇在混合液中的体积百分比浓度为20％～35％。采用低浓度乙醇使葡萄糖氧化酶、透明质酸酶或硫酸软骨素酶变性失活，避免了碱性灭活或者高温灭活酶时对低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的氧化。

根据一些实施例，在纯化后还包括S400沉淀和S500脱水干燥。

步骤S400沉淀包括：向所述过滤液加入有机溶剂，混合均匀，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的沉淀。所述有机溶剂为乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、乙二醇等，优选为乙醇。有机溶剂可以以纯有机溶剂的形式加入，也可以以其高浓度的水溶液的形式加入。所述有机溶剂的添加量为所述过滤液体积的3～20倍。

步骤S500脱水干燥包括：将所述沉淀分离出来，用乙醇脱水，干燥，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。干燥例如可为真空干燥，成本低，便于工业化生产。真空干燥的温度为20～40℃，优选为25～35℃。

在步骤S100中，葡萄糖氧化酶为任意来源的葡萄糖氧化酶。优选为已商品化的价格低廉的葡萄糖氧化酶，如青霉生产的葡萄糖氧化酶。优选的为食品级或优级纯葡萄糖氧化酶。葡萄糖氧化酶的酶活单位≥10万U/g。所述葡萄糖氧化酶的添加量通常为每1000L所述底物溶液中加入10g～100g所述葡萄糖氧化酶。优选为每1000L所述底物溶液中加入10g～50g所述葡萄糖氧化酶。当葡萄糖氧化酶的用量过低时，其抗氧化效果不明显，过高时，由于葡萄糖氧化酶本身包含的杂质导致最终产物带入过多杂质，降低最终产物的品质，并可能导致透明质酸酶或硫酸软骨素酶活性的降低。

根据一些实施例，所述葡萄糖在所述底物溶液中的质量体积浓度为0.1‰～1‰，优选为0.1‰～0.4‰。

根据一些实施例，步骤S200中所述透明质酸或其盐为任意高分子透明质酸或高分子透明质酸盐，任意低分子透明质酸或低分子量透明质酸盐。例如当制备低分子透明质酸或盐，可以使用高分子透明质酸或高分子量透明质酸盐；当制备寡聚透明质酸或盐，可以使用高分子透明质酸或高分子量透明质酸盐，也可以使用低分子透明质酸或低分子量透明质酸盐。所述透明质酸或其盐的浓度为任意可以达到的浓度，优选为在所述底物溶液中的质量体积浓度为5％～30％，从而达到酶解效率最优，生产成本降低。

步骤S200采用的透明质酸酶或硫酸软骨素酶为任意可以降解透明质酸的透明质酸酶或硫酸软骨素酶，例如微生物产透明质酸酶、蛇毒来源透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、哺乳动物来源透明质酸酶或硫酸软骨素酶。优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)产透明质酸酶。最优选为芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50，CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶，该透明质酸酶在专利CN201210317032.5中有详细的记载，其酶活高、热稳定性高、pH稳定性高，对透明质酸有很好的降解性，通过控制酶解条件可以得到所需分子量的透明质酸或其盐。当采用芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744发酵培养得到的芽孢杆菌透明质酸酶时，酶解温度为20～48℃，优选为30～40℃，酶解pH为4～9，优选为5.5～7.5。

透明质酸酶或硫酸软骨素酶的添加量根据酶解透明质酸或其盐的用量、浓度、反应条件、酶解时间及目标透明质酸或其盐分子量计算出的任意适宜的添加量。对于芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶来说，优选的范围为：每1kg透明质酸或其盐配制成的溶液中加入1×10⁷～5×10⁹IU的芽孢杆菌透明质酸酶。

下述实施例中，低分子量透明质酸或其盐、寡聚透明质酸或其盐的分子量测定采用Laurent法，白度测定采用欧洲药典白度测定法，细菌总数测量采用《2015化妆品安全技术规范》微生物限度测定法。

因可用于大规模生产酶切低分子及寡聚透明质酸及其盐的细菌产透明质酸酶，仅有芽孢杆菌(Bacillus sp.)A50 CGMCC NO.5744发酵生产的透明质酸酶，因此以下实施例均以采用此酶进行举例，并不再一一说明。

葡萄糖氧化酶，为山东鑫聚药业食品级葡萄糖氧化酶。

实施例1

1.向1.5m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，升温至40℃，调节pH为6.0，设置搅拌速度20rpm，边搅拌边依次向该溶解罐中加入400g葡萄糖，50g葡萄糖氧化酶。

2.搅拌3min后，缓慢加入分子量为1000kDa的透明质酸钠300kg，待到透明质酸完全加入后，搅拌0.5～1h。

3.向透明质酸钠溶液中加入8.0×10¹⁰IU的透明质酸酶，直至酶解至所需分子量，酶解结束。

4.向酶解液中加入乙醇，直至酶解液的酒精度达到25％，搅拌0.5～1h，过滤，收集滤液。

5.向滤液中加入20倍体积乙醇，此时滤液的酒精度约为92％，获得透明质酸钠沉淀。该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥得到低分子或寡聚透明质酸钠成品。

所得成品分子量、白度及细菌总数见表1。

实施例2

1.向1.5m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，升温至40℃，调节pH为6.0，设置搅拌速度20rpm，边搅拌边依次向该溶解罐中加入200g葡萄糖，30g葡萄糖氧化酶。

2.搅拌3min后，缓慢加入分子量为2500kDa的透明质酸钙100kg，待到透明质酸完全加入后，搅拌0.5～1h。

3.向透明质酸钠溶液中加入5.0×10¹¹IU的透明质酸酶，直至酶解至所需分子量，酶解结束。

4.向酶解液中加入乙醇，直至酒精度达到20％，搅拌0.5～1h，过滤，收集滤液。

5.向滤液中加入3倍体积乙醇，此时滤液的酒精度约为76％，获得透明质酸钠沉淀。该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥得到低分子或寡聚透明质酸钠成品。

所得成品分子量、白度及细菌总数见表1。

实施例3

1.向1.5m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，升温至40℃，调节pH为6.0，设置搅拌速度20rpm，边搅拌边依次向该溶解罐中加入100g葡萄糖，10g葡萄糖氧化酶。

2.搅拌3min后，缓慢加入分子量为3000kDa的透明质酸钾50kg，待到透明质酸完全加入后，搅拌0.5～1h。

3.向透明质酸钠溶液中加入5.0×10⁸IU的透明质酸酶，直至酶解至所需分子量，酶解结束。

4.向酶解液中加入乙醇，直至酒精度达到35％，搅拌0.5～1h，过滤，收集滤液。

5.向滤液中加入5倍体积乙醇，此时滤液的酒精度约为80％，获得透明质酸钠沉淀。该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥得到低分子或寡聚透明质酸钠成品。

所得成品分子量、白度及细菌总数见表1。

实施例4

1.向1.5m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，升温至40℃，调节pH为6.0，设置搅拌速度20rpm，边搅拌边依次向该溶解罐中加入1000g葡萄糖，100g葡萄糖氧化酶。

2.搅拌3min后，缓慢加入分子量为300kDa的透明质酸镁300kg，待到透明质酸完全加入后，搅拌0.5～1h。

3.向透明质酸钠溶液中加入3.0×10¹⁰IU的透明质酸酶，直至酶解至所需分子量，酶解结束。

4.向酶解液中加入乙醇，直至酒精度达到50％，搅拌0.5～1h，过滤，收集滤液。

5.向滤液中加入3倍体积乙醇，此时滤液的酒精度约为83％，获得透明质酸钠沉淀。该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥得到低分子或寡聚透明质酸钠成品。

所得成品分子量、白度及细菌总数见表1。

实施例5

1.向1.5m³不锈钢溶解罐中加入1m³纯化水，升温至40℃，调节pH为6.0，设置搅拌速度20rpm，边搅拌边依次向该溶解罐中加入600g葡萄糖，80g葡萄糖氧化酶。

2.搅拌3min后，缓慢加入分子量为1000kDa的透明质酸钠200kg，待到透明质酸完全加入后，搅拌0.5～1h。

3.向透明质酸钠溶液中加入4.0×10⁹IU的透明质酸酶，直至酶解至所需分子量，酶解结束。

4.向酶解液中加入乙醇，直至酒精度达到45％，搅拌0.5～1h，过滤，收集滤液。

5.向滤液中加入12倍体积乙醇，此时滤液的酒精度约为91％，获得透明质酸钠沉淀。该沉淀用乙醇脱水，然后真空干燥得到低分子或寡聚透明质酸钠成品。

所得成品分子量、白度及细菌总数见表1。

比较例1

与实施例1相比，不在酶解液中加入葡萄糖及葡萄糖氧化酶，其余条件包括酶解时间与实施例1一致。

所得成品分子量、白度及细菌总数见表1。

比较例2

与实施例1相比，酶解结束采用50～60℃下灭活30min，过滤，其余条件包括酶解时间与实施例1一致。

所得成品分子量、白度及细菌总数见表1。

表1实施例及对比例成品分子量、白度及细菌总数

从实施例1和比较例1的成品分子量对比可以看出，本申请采用葡萄糖氧化酶与透明质酸钠提前结合，拮抗透明质酸酶-透明质酸络合物的形成，效果显著，同等条件下，实施例1得到3.5kDa的产品，而比较例1成品的分子量仅降低到5.9kDa，葡萄糖氧化酶的加入显著提高了透明质酸酶的酶解速率。

从实施例1和比较例1的成品白度及对比细菌总数可以看出，本申请酶解液中加入葡萄糖氧化酶与葡萄糖，在酶解前及酶解过程中去除酶解液中的氧气，防止其氧化褐变。同时氧气的去除，抑制了酶解液中细菌的生长，降低了成品中的含菌量，提高了产品品质。

从实施例1和比较例2的成品的白度可以看出，虽然比较例2的成品中的细菌总数比实施例1成品的细菌总数低，因为高温灭活起到了一定杀菌作用，但是采用高温灭活，导致低分子透明质酸及寡聚透明质酸褐变，白度远低于实施例1的白度。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本申请所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本申请的保护范围之中。