阅读说明：本技术 杀菌剂抑霉唑离子液、及其制备方法和应用 (Bactericide imazalil ionic liquid, and preparation method and application thereof ) 是由 谭新球 张卓 陈岳 满益龙 曹永松 郑立敏 欧阳超 刘思珍 史晓斌 李成刚 张德 于 2020-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农药领域,具体杀菌剂抑霉唑离子液、及其制备方法和应用。所述抑霉唑离子液是由抑霉唑与有机酸,更具体为脂肪酸、含苯环的酸的配体分别进行酸碱中和反应制备得到的离子液。实验结果表明,以辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌、镰刀菌和辣椒疫霉菌为供试菌株,供试抑霉唑离子液对供试菌株表现出不同的增效抑菌活性,最高增效效果达到47.19％,具有广阔的应用前景。(The invention relates to the field of pesticides, in particular to imazalil ionic liquid as a bactericide, and a preparation method and application thereof. The imazalil ionic liquid is prepared by respectively carrying out acid-base neutralization reaction on the ligands of imazalil and organic acid, more specifically fatty acid and acid containing benzene ring. Experimental results show that the experimental imazalil ionic liquid shows different synergistic bacteriostatic activities on test strains by taking colletotrichum capsici, rice blast, fusarium and phytophthora capsici as the test strains, the highest synergistic effect reaches 47.19%, and the application prospect is wide.)

杀菌剂抑霉唑离子液、及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物保护中的化学农药领域，具体涉及杀菌剂抑霉唑离子液、及其制备方法和应用。

背景技术

离子液体是一类完全由有机离子组成、熔点低于100℃的盐，室温下一般呈熔融状态，不同于传统意义上的熔融盐，离子液体是一种低温条件下始终保持液体状态且粘度相对较低的盐。离子液体可以通过选择不同的阴阳配对离子(不同烷基链长度，不同离子类型等)优化母体自身的理化性质，比如熔点、溶解度、表面张力等。近年来，科学家将药物活性成分为基础，配不同类型的配对阴/阳离子，既保证原药的活性又改善其缺陷的理化性质，自然离子液体对绿色化学的可持续发展的影响而引起学术界的热情关注，成为研究热点之一。

农业领域，将药物制成离子液体后，可以提高通过膜的渗透性加快药物释放速度；农业化学领域，选择合适的配体制备具有疏水性能的离子液体，从而提高耐雨水冲刷能力、减少活性物质的漂移量增强药效以减少农药使用量、促进在植物体内有效成分的移动。如Rogers课题组[Hough W L,Rogers R D.Ionic liquids then and now:from solvents tomaterials to active pharmaceutical ingredients[J].Bulletin of the ChemicalSociety of Japan,2007,80(12):2262-2269]通过合成离子液，改善原药的疏水、控释及传导运输性能而提高原药的生物活性；Docherty等[Docherty K M,Kulpa Jr C F.Toxicityand antimicrobial activity of imidazolium and pyridinium ionic liquids[J].Green Chemistry,2005,7(4):185-189]合成了随着配对离子烷基链增长而增加了抗菌性能的咪唑鎓及吡啶鎓离子液体；但目前相关离子液的研究，目前主要是局限于除草剂的稳定性和淋溶性等特性进行改良，提升除草剂的防治效率，而对于杀菌剂和其他化学农药涉及较少。

抑霉唑属于广谱、内吸、取代苯并咪唑类杀菌剂，具有典型阳离子的结构特征，影响细胞膜渗透性、生理功能和脂类合成代谢。其作用机理与含氮的杂环有关，杂环上的氮原子可以与细胞色素P450甾醇14-α-脱甲基化酶(steol 14α-demethylase P450，Cyp51)的血红素区域(血红素-铁活性中心)以配位键结合，从而抑制该酶的活性[Ji H,Zhang W,ZhangM,et al.Ji,H.et al.Structure-based de novo design,synthesis,and biologicalevaluation of non-azole inhibitors specific for lanosterol 14-demethylase offungi.J.Med.Chem.46,474-485[J].Journal of Medicinal Chemistry,2003,46(4):474-485]。麦角甾醇是真菌细胞膜基本成份，Cyp51是麦角甾醇生物合成途径中的关键性酶[Yoshida Y,Aoyama Y,Noshiro M,et al.Sterol 14-demethylase P450(CYP51)providesa breakthrough for the discussion on the evolution of cytochrome P450 genesuperfamily[J].Biochemical&Biophysical Research Communications,2000,273(3):799-804]，酶的活性受到抑制，导致麦角甾醇合成受阻，它的缺失将导致膜结构的破坏和功能消失，最终导致真菌死亡[李红叶,谢清云,宋爱环.抑霉唑敏感与抗性指状青霉菌株CYP51基因序列比较[J].菌物学报,2003,22(1):153-156.]。抑霉唑属于DMIs杀菌剂，杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)将麦角甾醇生物合成抑制剂DMIs杀菌剂定位为低到中等抗性风险药剂，但由于长期使用不合理的原因，导致某些植物病原菌也会对部分DMIs类杀菌剂产生较高水平的耐药或抗药性，特别是柑橘青霉病菌已经产生明显的抗药性。

目前抑霉唑主要应用于柑橘青霉病菌、作物炭疽病菌等的防治，目前已有研究报道来自多种寄主上的炭疽菌等病原真菌对DMIs等多种杀菌剂产生了抗药性，如何克服或延缓病原菌对其抗药性的产生和发展，以延长其使用寿命，是植物病原菌抗药性问题中所面临的重要难题。同时，由于新杀菌剂的药物研发周期长、花费高，极大的限制了其发展速度。离子液体既具有易合成、种类繁多及理化性质稳定的特点，同时又具有在不影响农药的生物活性的前提下可通过选择不同的配对离子改善农药的理化性质从而降低对环境污染的特点，可以为传统广谱杀菌剂的高效使用提供新途径。

发明内容

基于上述，选择有机酸，具体为不同碳链长度、含苯环及杂环的有机酸作为阴离子配体，以抑霉唑为母体(视为碱)，通过酸碱中和反应，制备抑霉唑离子液，研究相关离子液体的化学表征，比较不同配体制备的离子液生物活性和增效情况，明确其抗菌谱的变化。用以阐释药物离子化后提高真菌对其的敏感性，以延缓真菌产生抗药性，同时筛选最佳的配体，为其杀菌剂离子液的制备和高效利用提供科学依据，延长高效但容易产生抗药性的药物抑霉唑的使用寿命，同时实现农业生产上减少农药的使用量。

因此，本发明首先提供一种杀菌剂抑霉唑的离子液，其是由抑霉唑与有机酸，更具体为脂肪酸、含苯环的酸、或具有杂环酸的配体分别进行酸碱中和反应制备得到的离子液。本发明是将杀菌剂抑霉唑为母体和不同碳链长度、含苯环及杂环的有机酸作为阴离子配体进行化学反应，获得产物为相应杀菌剂的离子液。

在优选的实施方式中，所述的脂肪酸是醋酸、壬酸或油酸；所述的含苯环的酸是苯甲酸或水杨酸。其中，所述的离子液具有下述结构式：

在更优选的实施方式中，所述的配体是水杨酸。

本发明还提供含有上述的离子液作为活性成分的杀菌剂。

本发明还提供上述的离子液在防治植物真菌病害中的应用，其中所述真菌病害是指柑橘青霉病菌、炭疽菌病菌、稻瘟病菌、菌核病菌、疫霉菌、镰刀菌、或稻曲病菌引起植物病害，尤其是辣椒炭疽病，更优选为辣椒胶胞炭疽病。

进一步地，本发明提供一种制备上述的离子液的方法，其特征在于，包括下述步骤：

称取原药抑霉唑，加入有机醇，优选是甲醇，使抑霉唑充分溶解；

加入所述配体，于50-80℃，优选为60-70℃条件下搅拌反应；

将反应化合物除去有机醇，即得到所述离子液。

其中在具体优选实施方式中，所加的配体与抑霉唑是等摩尔加入的。

在一个

具体实施方式

中，所述反应通过薄层析分离法追踪反应至反应完全，以确定何时进行除去甲醇的操作。

在更具体的实施方式中，所述除去甲醇是将反应化合物利用旋转蒸发仪除去甲醇。

本发明的成功制备了抑霉唑离子液，具体包括抑霉唑-醋酸离子液、抑霉唑-壬酸离子液、抑霉唑-油酸离子液、抑霉唑-苯甲酸离子液和抑霉唑-水杨酸离子液，其回收产率>89％，其核磁共振氢谱表征表明，6种离子液中咪唑环上参与反应的反应位点附近的H的化学位移均发生了不同程度的改变，化学位移为0.1ppm-0.4ppm。6种离子液的熔点均小于抑霉唑自身熔点(52.7℃)，常温下呈液态或者蜡状，符合离子液制备要求。本发明人创造性将抑霉唑作为母体(视为碱)，通过与选择不同碳链长度、含苯环及杂环的有机酸阴离子配体发生酸碱中和反应而得到抑霉唑离子液。经实验结果表明，以抑霉唑离子液体为供试药剂，以辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌、镰刀菌和辣椒疫霉菌为供试菌株，供试抑霉唑离子液对供试菌株表现出不同的增效抑菌活性。其中抑霉唑-水杨酸离子液对辣椒炭疽病菌、稻瘟病菌、镰刀菌均表现出增效活性，其最大的增效效果达到47.19％。此外，抑霉唑主要用来防治柑橘青霉病菌，而且容易产生抗性，对于辣椒炭疽病菌、镰刀菌等很少使用，根据本发明表明在离子液确实可以在其他菌防治使用，而且效果比较好。

附图说明

图1抑霉唑核磁共振氢谱图。

图2抑霉唑-醋酸离子液核磁共振氢谱图。

图3抑霉唑-壬酸离子液核磁共振氢谱图。

图4抑霉唑-油酸离子液核磁共振氢谱图。

图5抑霉唑-苯甲酸离子液核磁共振氢谱图。

图6抑霉唑-水杨酸离子液核磁共振氢谱图。

图7不同辣椒炭疽病菌对抑霉唑的敏感性测定。

图8辣椒胶孢炭疽菌对抑霉唑及其衍生物的敏感性。

图9稻瘟病菌对抑霉唑及其衍生物的敏感性。

图10镰刀菌对抑霉唑及其衍生物的敏感性。

具体实施方式

为了更好理解本发明，以下结合实施例进一步阐述本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例一 抑霉唑离子液的合成

称取原药抑霉唑0.297g于50mL三口瓶中，加入20mL甲醇，使得抑霉唑充分溶解；等摩尔分别加入相关阴离子配体(醋酸、壬酸、油酸、水杨酸、苯甲酸)，60-70℃条件下搅拌反应，薄层析分离法追踪反应至反应完全。将反应化合物利用旋转蒸发仪除去甲醇，可得相关抑霉唑离子液体。

选用上述阴离子配体6种，通过酸碱中和反应合成了6种抑霉唑离子配体。其中，编号1为抑霉唑；编号2为抑霉唑-醋酸离子液；编号3为抑霉唑-壬酸离子液；编号4为抑霉唑-油酸离子液；编号5为抑霉唑-苯甲酸离子液；编号6为抑霉唑-水杨酸离子液。

其中，编号2-6号均为液体且5种离子液体的产率均在89％以上，最高达到98％。由于选择的配体离子的关系，合成产物离子液的分子对称性弱，导致晶格能以及分子作用力降低，各合成产物的熔点也低，均小于原药抑霉唑的熔点(52.7℃)，其不同抑霉唑离子液结构式及其状态、熔点和回收率见表1。

表1抑霉唑离子液衍生物的结构式及状态

编号	分子式	结构式	熔点(℃)	状态	回收率
						1	C14H14Cl2N2O	式1	52.7	Powder	—
2	[C14H15Cl2N2O]+[C2H3O2]-	式2	—	Liquid	94.51％
						3	[C14H15Cl2N2O]+[C9H17O2]-	式3	—	Liquid	98.03％
4	[C14H15Cl2N2O]+[C18H33O2]-	式4	—	Liquid	95.51％
						5	[C14H15Cl2N2O]+[C7H5O2]-	式5	—	Liquid	97.43％
6	[C14H15Cl2N2O]+[C7H5O3]-	式6	—	Liquid	89.72％

注：1：抑霉唑；2：抑霉唑-醋酸离子液；3：抑霉唑-壬酸离子液；4：抑霉唑-油酸离子液；5：抑霉唑-苯甲酸离子液；6：抑霉唑-水杨酸离子液。

实施例二 抑霉唑离子液的表征

取实施例一制备得到的抑霉唑离子液适量于核磁管中，加入600μL氘代三氯甲烷，核磁共振仪Bruker Avance DPX 300MHz进行核磁共振氢谱的表征，分析抑霉唑离子液的结构特征。

通过核磁共振仪将所得的抑霉唑离子液进行核磁共振氢谱表征，从表2氢谱图数据可知，所有配对离子中位于高场的羧基的活泼氢均消失，其中合成产物中抑霉唑-醋酸离子液、抑霉唑-壬酸离子液和抑霉唑-油酸离子液咪唑环上N-CH-N氢谱位移向高场移动了约0.1ppm；抑霉唑-苯甲酸离子液咪唑环上N-CH-N氢谱位移向高场移动了约0.25ppm；抑霉唑-水杨酸离子液咪唑环上N-CH-N氢谱位移向高场移动了约0.4ppm。根据熔点及相应氢谱结果表明抑霉唑离子液体成功合成(见图1～7)。

表2抑霉唑离子液体的核磁共振氢谱数据

注：1：抑霉唑；2：抑霉唑-醋酸离子液；3：抑霉唑-壬酸离子液；4：抑霉唑-油酸离子液；5：抑霉唑-苯甲酸离子液；6：抑霉唑-水杨酸离子液。

实施例三：辣椒炭疽病病原菌对抑霉唑的敏感性测定

1、培养基的制备

PDA培养基:购于索莱宝公司的不含抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，称46g于1L ddH2O中溶解，121℃高压灭菌20min，备用。

2、含药培养基的制备

将抑霉唑用甲醇与水的混合溶液完全溶解，配制成浓度为5.0mg/mL的抑霉唑母液。待冷却至55℃左右的200mL PDA培养基里，加入相应体积的5mg/L抑霉唑，充分混匀，配置成含0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L和16.0mg/L抑霉唑的PDA平板。

3、辣椒炭疽病病原菌对抑霉唑的敏感性测定

采用生长速率法进行敏感性测定实验。将供试菌株HHBY48(C.acutatum)、YYGXZ07(C.brevisporum)、HBLF01(C.capsici)、CZHP03(C.truncatum)、CSLL11(C.gloeosporioides)于不含药物的PDA培养基上培养5天，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘取菌丝块，分别接种到含有不同浓度(0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L和16.0mg/L)的抑霉唑的PDA培养皿上，于26℃、50％RH恒温培养箱中黑暗培养7d，从菌丝开始生长(3d)起，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速率，拍照并用Excel工作表记录。

辣椒炭疽病病原菌不同种之间对抑霉唑的敏感性有较大差异。结果表明：辣椒炭疽病菌的不同种对抑霉唑的EC₅₀值存在显著差异，辣椒尖孢炭疽菌(C.acutatum)和辣椒炭疽菌(C.truncatum)EC₅₀值分别2.85mg/L和176.34mg/L，两者相差62倍(具体见表3和图8)。

表3抑霉唑对5种辣椒炭疽菌的毒力回归方程

菌株	线性回归方程(Y＝)	相关系数R<sup>2</sup>	EC<sub>50</sub>(mg/L)
				C.acutatum	1.91x+4.13	0.934	2.85
C.brevisporum	1.27x+3.93	0.977	7.38
				C.capsici	0.80x+3.98	0.580	19.14
C.truncatum	0.57x+3.58	0.621	176.34
				C.gloeosporioides	1.74x+3.62	0.947	6.23

实施例四：辣椒胶孢炭疽病原菌对抑霉唑及离子液的敏感性测定

1、含药培养基的制备

将抑霉唑及抑霉唑衍生物用甲醇与水的混合溶液完全溶解，配制成浓度为5.0mg/mL的抑霉唑及衍生物母液。待冷却至55℃左右的200mL PDA培养基里，加入相应体积的5mg/L抑霉唑及其衍生物，充分混匀，配置成含0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L和16.0mg/L抑霉唑PDA平板。

2、辣椒胶孢炭疽病原菌对抑霉唑及离子液的敏感性测定

采用菌丝生长速率法进行敏感性测定实验。将供试菌株CSLL11(C.gloeosporioides)于不含药物的PDA培养基上培养5天，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘取菌丝块，分别接种到含有不同浓度(0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L和16.0mg/L)的抑霉唑及其离子液的PDA培养皿上，于26℃、50％RH恒温培养箱中黑暗培养7d，从菌丝开始生长(3d)起，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速率，拍照并用Excel工作表记录。

辣椒胶孢炭疽病病原菌对抑霉唑及其离子液的敏感性差异明显，其中衍生物抑霉唑-醋酸离子液，抑霉唑-壬酸离子液，抑霉唑-油酸离子液及抑霉唑-水杨酸离子液与原药抑霉唑EC₅₀值相比，均明显降低，其中抑霉唑-水杨酸离子液EC₅₀值为3.61mg/L，其次为抑霉唑-油酸离子液，EC₅₀值为4.24mg/L，抑霉唑-醋酸离子液和抑霉唑-壬酸离子液的EC₅₀值分别为4.37mg/L和4.53mg/L。与抑霉唑的EC₅₀值相比较，辣椒胶孢炭疽菌的菌丝对其离子化衍生物的敏感性不同程度提高，其增效为29％-47％，其中抑霉唑-水杨酸离子液的增效达47％，表明抑霉唑与选择性配体结合制备成离子液，有助于提高母体药剂的生物活性。有趣的是，我们也发现抑霉唑-苯甲酸离子液反而降低了其敏感性，其中最高降低了36.28％，表明这两种配体对母体活性有负面影响(具体见表4和图9)。

表4抑霉唑及其离子液对辣椒胶孢炭疽菌的毒力回归方程

实施例五 抑霉唑及其离子液的杀菌谱确定

采用菌丝生长速率法进行杀菌谱是否扩大的测定实验。将供试菌株稻瘟病菌、镰刀菌于不含药物的PDA培养基上培养5至6天，用直径为5mm的打孔器于菌落边缘取菌丝块，分别接种到含有不同浓度(0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、8.0mg/L和16.0mg/L)的抑霉唑及其离子液的PDA培养皿上，于26℃、50％RH恒温培养箱中黑暗培养7d，从菌丝开始生长(3d)起，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速率，拍照并用Excel工作表记录。

选择4种抑霉唑-醋酸离子液，抑霉唑-壬酸离子液，抑霉唑-油酸离子液及抑霉唑-水杨酸离子液进行杀菌谱活性测定，以稻瘟病菌、镰刀菌为研究对象，采用菌丝生长速率法进行测定实验。结果表明，3种离子液对稻瘟病菌的EC₅₀值与抑霉唑相当，甚至低于抑霉唑的EC₅₀，增效为3％-5％(具体见表5和图9)；而镰刀菌仅仅对抑霉唑-水杨酸离子液的EC₅₀值低于抑霉唑，增效为12.91％(具体见表6和图10)。以上结果说明，尽管不同配体的离子液的杀菌谱存在一定变异，但是单一离子液的杀菌谱存在扩大的现象。

表5抑霉唑及其衍生物对稻瘟病菌的毒力回归方程

衍生物	线性回归方(Y＝)	相关系R<sup>2</sup>	EC50(mg/L)	增效率(％)
					抑霉唑	3.14x+5.60	0.861	0.65	-
抑霉唑-醋酸离子液	3.12x+5.63	0.863	0.63	2.94
					抑霉唑-壬酸离子液	3.16x+5.59	0.865	0.65	-0.93
抑霉唑-油酸离子液	3.11x+5.65	0.872	0.62	4.64
					抑霉唑-水杨酸离液	2.34x+4.99	0.816	1.01	-56.04

表6抑霉唑及其衍生物对镰刀菌的毒力回归方程

衍生物	线性回归方程(Y＝)	相关系数R<sup>2</sup>	EC50(mg/L)	增效率(％)
					抑霉唑	1.03x+3.95	0.861	10.46	—
抑霉唑-醋酸离子液	1.38x+3.45	0.864	13.18	-26.00
					抑霉唑-壬酸离子液	1.42x+3.48	0.880	11.84	-13.19
抑霉唑-油酸离子液	0.97x+3.94	0.931	12.17	-16.35
					抑霉唑-水杨酸离子液	0.89x+4.15	0.901	9.11	12.91