阅读说明：本技术 一类吡唑啉酮类化合物及其制备方法和用途 (Pyrazolone compounds and preparation method and application thereof ) 是由 陈雏 吴燕 李彬 杜蕾蕾 于 2019-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一类吡唑啉酮类化合物,属于药物化学技术领域,所述吡唑啉酮类化合物的结构如式(Ⅰ)所示：<Image he="89" wi="154" file="DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(Ⅰ)其中：R<Sub>1</Sub>、R<Sub>2</Sub>独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基,R<Sub>3</Sub>、R<Sub>4</Sub>独立地选自氢、甲基、亚甲基；本发明还公开了上述化合物的药学上可接受的盐和互变异构体；本发明的化合物能够减轻氧化应激所致的细胞损伤、能透过血脑屏障并且能够清除自由基,在脑组织内的浓度高于依达拉奉,且在脑组织中的代谢稳定性更好；而且水溶性较好,理化性质较稳定,适宜制备各种固体和液体制剂,尤其是注射剂,可用于制备预防和/或治疗氧化应激损伤相关疾病的药物。(The invention discloses pyrazolone compounds, belonging to the technical field of pharmaceutical chemistry, wherein the pyrazolone compounds have a structure shown in formula (I): (I) wherein: r 1 、R 2 Independently selected from methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, cyclopropyl, R 3 、R 4 Independently selected from hydrogen, methyl, methylene; the invention also discloses pharmaceutically acceptable salts and tautomers of the compounds; the compound can reduce cell damage caused by oxidative stress, can penetrate through a blood brain barrier and can remove free radicals, the concentration of the compound in brain tissues is higher than that of edaravone, and the metabolic stability of the compound in the brain tissues is better; and the water solubility is better, the physicochemical property is more stable, and the preparation method is suitable for preparing various solid and liquid preparations, especially injections, and can be used for preparing medicaments for preventing and/or treating oxidative stress injury related diseases.)

一类吡唑啉酮类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一类吡唑啉酮类化合物及其制备方法和用途。

背景技术

依达拉奉(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)是一种临床常用的神经保护剂，主要用于改善急性脑梗死所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍，以及延缓肌萎缩性侧索硬化症患者的病情进展。

依达拉奉是一种强效自由基清除剂。从结构上看，依达拉奉分子有三种互变异构体，其中烯醇式结构可转化为阴离子形式。

在生理酸碱度条件下，依达拉奉有50％是以阴离子形式存在，而阴离子形式具有很强的自由基清除能力，能将电子传递给自由基并将其转变成没有氧化活性的基团，从而降低或消除自由基对组织细胞的损害(马利萍,等.中国临床药理学与治疗学,2011,16:341-348)。

氧化应激和神经炎症是各类脑和神经系统疾病的共同基础。氧化应激是指活性氧如超氧阴离子、过氧化氢、一氧化氮和羟基自由基等增加导致的细胞损伤。脑组织含丰富的不饱和脂肪酸，容易受到氧化应激损伤。脑梗塞和蛛网膜下腔出血是最常见的脑血管疾病，发生后会出现严重氧化和炎症损伤。依达拉奉能够捕获脑组织缺血或出血状态下产生的过量自由基，抑制脂质过氧化作用，减轻神经细胞、血管内皮细胞和脂质受到的氧化损伤。依达拉奉能抑制黄嘌呤和次黄嘌呤氧化酶的活性，减少自由基的产生，还能增强过氧化物歧化酶的活性，抑制自由基对蛋白质、核酸的不可逆破坏，减少脑梗塞后期神经细胞的死亡(赵晓英,等.麻醉安全与质控,2018,2:107-112)。

脑组织耗氧量高，内在的抗氧化物质相对缺乏，对氧化应激非常敏感。神经元属于终末细胞难以更新，长寿命神经细胞容易积累氧化损伤。事实上，慢性氧化应激导致的神经损伤、胶质细胞活化被认为与肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病、阿尔兹海默病、亨廷顿病、多发性硬化症等神经退行性病变的发病机制和疾病进展密切相关(赵春阳,等.药学学报,2015,50,375-384)。依达拉奉能在一定程度延缓神经退行性病变的进程，具有改善患者神经行为表现的潜在作用(Shu-Sheng Jiao et al.Proceedings of the National Academyof Sciences,2015,112,5225-5230)。

除了基于自由基清除的抗氧化活性，依达拉奉还具有较强的抗炎作用，能降低脑出血患者的炎症因子含量，降低脑梗塞患者的血清炎性因子水平，减轻炎性损伤，改善神经功能。依达拉奉能够抑制脑缺血组织周围脑血流量的减少，提高神经细胞存活率，减轻血管内皮细胞损伤，阻止脑水肿和脑梗塞的进展，并缓解所伴随的神经症状，抑制迟发性神经元死亡(张岩,等.中华神经创伤外科电子杂志,2017,3:44-47)。

由于依达拉奉在体内的半衰期短、代谢速度快，为了快速起效并在脑内达到较高的药物浓度，依达拉奉的上市剂型仅有注射剂。然而，依达拉奉的水溶性不佳(3mg/mL，20℃)，增加了制剂及质量控制的难度。在制备注射剂时需加入pH调节剂使溶液呈弱碱性以提高溶解性，但依达拉奉在偏碱性条件下的稳定性较差，需要添加抗氧化剂以减少依达拉奉的氧化，这不但增加了注射剂生产和储存过程中的质量控制难度，也增加了患者使用时发生不良反应的风险。依达拉奉注射剂使用时只能用生理盐水进行稀释以避免成分析出和降解。这给临床联合用药造成了不利限制。

有报道称，依达拉奉在脑脊液中的浓度是血浆中浓度的50％～60％。然而由于体内存在脑脊液-脑屏障，脑脊液和脑组织中的药物浓度可能存在明显差异，脑脊液中的药物浓度事实上并不能简单等同于脑组织内的药物浓度。发明人通过试验发现，大鼠或小鼠静脉注射依达拉奉后，脑内药物浓度均仅有血浆中的5％左右。由此可见，依达拉奉透过血脑屏障进入脑组织的能力较差。作为神经保护药物，这无疑限制了依达拉奉在脑内抗氧化活性的发挥。

发明内容

为克服依达拉奉存在的上述不足，获得更好的神经保护药物，申请人提出了本发明。

本发明的目的之一，在于提供一类吡唑啉酮类化合物及其药学上可接受的盐。所述吡唑啉酮类化合物，其具有通式Ⅰ的结构：

其中：R₁、R₂独立地选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基，R₃、R₄独立地选自氢、甲基、亚甲基。

本发明所述的吡唑啉酮类化合物，包括其在适用条件下的酮式、烯醇式、胺式互变异构体，即类似于上述的依达拉奉的互变异构体。

本发明所述的吡唑啉酮类化合物，进一步优选自以下化合物：

本发明所述的“药学上可接受的盐”是指，通式Ⅰ化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等无机酸形成的盐，或与甲磺酸、乙磺酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、马来酸、柠檬酸、丙二酸、醋酸、乳酸、苯甲酸、邻苯二甲酸、水杨酸、对甲苯磺酸、扁桃酸、烟酸、抗坏血酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等有机酸形成的盐。

本发明的目的之二，在于提供上述的吡唑啉酮类化合物的制备方法，采用技术技术方案为，可以通过如下步骤制备得到：

具体步骤包括：

(1).通式Ⅱ化合物的制备：

通式II化合物可以由4-氯或溴取代的乙酰乙酸乙酯及其衍生物与仲胺发生亲核取代反应得到。反应溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、水，或所述溶剂组成的混合溶剂；缚酸剂选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾、三乙胺；反应温度随试剂或溶剂等的变化而变化，通常在-10℃至150℃，优选20℃至70℃；反应时间不限，通常为0.5小时至12小时。

(2).通式Ⅰ化合物的制备：

通式Ⅱ化合物与苯肼反应得到通式Ⅰ化合物。反应溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷，或上述溶剂组成的混合溶剂；反应温度随试剂或溶剂等的变化而变化，通常在-10℃至150℃，优选10℃至100℃；反应时间不限，通常为1小时至24小时。

本发明的目的之三，在于提供一种药物组合物，它包含安全有效量的一种或多种吡唑啉酮类化合物及其药学上可接受的盐。

本发明所述的“组合物”是指，通过将一种以上物质或组份混和而成的产品。本发明的组合物包含1wt％(重量百分比)至95wt％、优选地为10wt％至80wt％的上述的吡唑啉酮类化合物及其药学上可接受的盐，以所述药物组合物的总重量计。

本发明所述的“安全有效量”是指，本发明化合物的给药剂量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。本发明化合物的安全有效量可根据给药途径，患者的年龄、体重、疾病类型及其严重程度等变化。对于体重60kg的人而言，每日给药剂量通常为10mg至1000mg，优选地为25mg至500mg。可一次或分多次给药。

作为优选的实施方案之一，该药物组合物可进一步加入一种或多种药学上可接受的载体制成药学上可接受的药物制剂。

本发明所述的“药学上可接受的载体”是指，一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此是指，组合物中各组分能和本发明的吡唑啉酮类化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低吡唑啉酮类化合物的药效。药学上可以接受的载体包括糖(如蔗糖、乳糖、葡萄糖等)、淀粉(如马铃薯淀粉、玉米淀粉等)、纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯、微晶纤维素等)、糊精及其衍生物、微粉硅胶、明胶、滑石粉、硫酸钙、固体润滑剂(如硬脂酸镁、硬脂酸等)、植物油(如大豆油、芝麻油、花生油、橄榄油、蓖麻油、棉籽油、玉米胚芽油、棕榈油等)、醇类溶剂(如乙醇、丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇等)、表面活性剂、等渗调节剂、pH调节剂、乳化剂、润湿剂、着色剂、矫味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热源水。

本发明所述的“药物制剂”包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、散剂、锭剂、注射剂、冻干粉针、糖浆剂、口服液、贴剂、吸入粉雾剂、喷雾剂，经口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下、透皮、口腔喷雾、鼻腔喷雾途径给药。

本发明的目的之四，在于提供上述的吡唑啉酮类化合物及其药学上可接受的盐，或上述的药物组合物的用途，用于制备预防和/或治疗氧化应激损伤相关疾病的药物。

本发明所述的“氧化应激损伤相关的疾病”包括阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化病、缺血性脑卒中、出血性脑卒中、蛛网膜下腔出血、脑水肿、创伤性脑损伤。

在另一优选例中，所述“用途”是指，用于制备改善急性脑梗死所致的神经症状、日常生活活动能力和功能障碍的药物。

在另一优选例中，所述“用途”是指，用于制备延缓肌萎缩性侧索硬化症患者的病情进展的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明所公开的吡唑啉酮类化合物能够减轻氧化应激所致的细胞损伤；本发明所公开的吡唑啉酮类化合物能透过血脑屏障，在脑组织内的浓度高于依达拉奉，且在脑组织中的代谢稳定性更好；本发明所公开的吡唑啉酮类化合物的水溶性较好，理化性质较稳定，适宜制备各种固体和液体制剂，尤其是注射剂；本发明所公开的吡唑啉酮类化合物毒性低，安全性好。

附图说明

图1为H₂O₂诱导细胞损伤试验的细胞活力结果图；

图2为大鼠局灶性缺血试验中海马CA1区和纹状体CPu脑区中同一部位的存活神经元细胞数检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1化合物E-1的制备

100ml圆底烧瓶中依次加入二甲胺的四氢呋喃溶液(2mol/L)40ml、水15ml、碳酸钠11g，室温搅拌5分钟。反应体系置冰浴中缓慢滴入4-氯乙酰乙酸乙酯6.5g，滴毕缓慢升温至室温，然后40℃反应6小时。反应液过滤，滤液浓缩后上硅胶柱分离，二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(100:0至10:1，v/v)，根据TLC合并馏分，浓缩蒸出溶剂后，得4-(N,N-二甲氨基)乙酰乙酸乙酯，深棕红色液体3.1g，收率45％。

25ml圆底烧瓶中依次加入4-(N,N-二甲氨基)乙酰乙酸乙酯2.2g、无水乙醇10ml、苯肼1.3g，20℃反应12小时，过滤，少量乙酸乙酯洗涤，沉淀减压干燥，得化合物E-1，白色粉末1.6g，收率57％。

¹H-NMR(600MHz，D₂O)：δ7.47(2H，d)，δ7.42(2H，t)，δ7.29(1H，t)，δ4.67(2H，s)，δ3.99(2H，s)，δ2.77(6H，s)；¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)：δ162.9，δ141.9，δ138.6，δ129.1，δ126.8，δ123.9，δ87.3，δ55.3，δ42.2；HR-TOF-MS(m/z)：218.1289([M+H]⁺，理论值：218.1293，[C₁₂H₁₆N₃O]⁺)。

实施例2化合物E-1盐酸盐的制备

100ml圆底烧瓶依次加入化合物E-1 680mg、甲醇40ml，60℃搅拌溶解，通入HCl气体，减压回收溶剂至约10ml，-20℃放置析晶，过滤，少量无水乙醇洗涤沉淀，50℃减压干燥6小时，得化合物E-1的盐酸盐，白色砂晶540mg，收率79％。E-1盐酸盐易溶于水(110mg/ml，20℃)。

¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)：δ7.73(2H，d)，δ7.51(2H，t)，δ7.40(1H，t)，δ5.20(2H，s)，δ4.35(2H，s)，δ2.95(6H，s)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)：δ154.8，δ140.8，δ136.5，δ128.9，δ127.7，δ122.8，δ90.3，δ53.4，δ42.0。

实施例3化合物E-4盐酸盐的制备

250ml圆底烧瓶中依次加入水50ml、乙酸乙酯50ml、碳酸钾5.5g、二乙胺11.7g，室温搅拌10分钟。反应体系置冰浴中缓慢滴入4-氯乙酰乙酸乙酯6.5g，滴毕缓慢升温至60℃反应2小时。反应液分出水层，乙酸乙酯层经饱和食盐水洗涤后用2mol/L盐酸调pH＝3，分离得到的酸水层再用2mol/L氢氧化钠调pH＝9。碱化后的水层用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取液减压蒸除溶剂，得4-(N,N-二乙氨基)乙酰乙酸乙酯，深棕红色液体2.0g，收率25％。

25ml圆底烧瓶中依次加入4-(N,N-二乙氨基)乙酰乙酸乙酯1.0g、甲醇5ml、苯肼0.6g，50℃反应3小时。反应液蒸干，加乙酸乙酯溶解后用水萃取，水层浓缩后上反相硅胶色谱柱分离，10％～20％乙醇梯度洗脱，合并目标馏分，用4mol/L盐酸调pH＝3，减压蒸干，得化合物E-4盐酸盐，淡黄色固体0.34g，收率28％。

¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)：δ7.73(2H，d)，δ7.48(2H，t)，δ7.36(1H，t)，δ5.06(2H，s)，δ4.31(2H，s)，δ3.30(4H，m)，δ1.39(6H，t)。¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)：δ154.3，δ140.8，δ137.4，δ128.7，δ127.1，δ122.3，δ89.7，δ48.4，δ8.1。

由于本发明所述化合物都含有烷基取代的N原子，即属于弱碱性化合物，与酸成盐后可使水溶性更好。对于碱性药物分子本领域通常都使用其盐的形式，除非碱性药物分子的溶解性已经足够的好，对于本申请的化合物，由于是弱碱性化合物的盐，当其溶解在纯水中或进入体内其实是分子态(游离碱)为主，离子态(盐)较少；因此，无论游离碱还是其盐的形式从自由基清除能力、体内活性、代谢等角度看二者没有实质性差别，所以，下述实施例主要采用盐的形式进行相关的效果实验。

实施例4ABTS自由基清除能力

取ABTS适量，以水为溶剂，配成浓度为7.4mmol/L的溶液。取K₂S₂O₈适量，加水溶解，配成浓度为2.6mmol/L的溶液。取ABTS储备液和K₂S₂O₈储备液等体积混合，避光室温放置12至16小时，用pH 7.4磷酸盐缓冲液稀释40-50倍(此溶液在734nm处的吸光度值为0.7±0.02)，即得ABTS⁺工作液。取受试品适量，以水为溶剂，配成浓度约为1mmol/L的溶液，并用水逐步稀释成5个系列浓度的受试品溶液。精密吸取各受试品溶液0.2ml，分别加入ABTS⁺工作液9.8ml，摇匀，静置6min，于734nm处测定吸光度值A。以水0.2ml和ABTS⁺工作液9.8ml的混合液为对照，于734nm处测定吸光度值A₀，以水为空白参比。

清除率(％)＝(1-A/A₀)×100％

以化合物浓度为横坐标，ABTS⁺清除率为纵坐标，拟合曲线，计算各化合物清除ABTS⁺自由基的IC₅₀值。结果显示，此测试条件下依达拉奉清除ABTS⁺自由基的IC₅₀值为14.7μM，E-1及其盐酸盐清除ABTS⁺自由基的IC₅₀值分别为11.1μM、11.2μM，E-4及其盐酸盐清除ABTS⁺自由基的IC₅₀值分别为9.4μM、9.9μM。结果表明，本发明所公开的吡唑啉酮类化合物具有较强的自由基清除能力。

实施例5对H₂O₂诱导细胞损伤的保护作用

取处于对数生长期的PC12细胞，调整细胞密度为1×10⁶个/ml，接种于96孔板，100μL/孔，置5％CO₂培养箱中37℃培养24小时。更换培养液，给药组分别加入不同的受试化合物(终浓度10μM)预处理1小时，除正常组(图1中的“Con”组)外加入H₂O₂(终浓度200μM)造成细胞自由基损伤，再培养24小时。然后依据MTT法检测每组的细胞活力，即每孔加入5mg/mLMTT15μL，继续培养4小时，弃去上清液，每孔加入200μL DMSO，反复振荡5分钟，直至蓝紫色结晶完全溶解，用酶标仪在490nm波长检测并计算细胞活力，结果见图1。

由图1可知，本发明所公开的吡唑啉酮类化合物能够明显减轻氧化应激导致的细胞损伤(与模型组即H₂O₂组比较，*P<0.05，**P<0.01)。

实施例6对脑缺血小鼠的神经保护作用

SPF级雄性C57小鼠，随机分组，每组8只，制备小鼠双侧颈总动脉短暂结扎的脑缺血模型(Free Radical Biology and Medicine.2011,50:1780-1786；Neuropharmacology.2014,77:453-464)。于缺血再灌时、24小时和48小时，分别静脉注射等摩尔剂量化合物(依达拉奉3mg/kg、E-1盐酸盐4.38mg/kg、E-4盐酸盐4.86mg/kg)或空白溶媒(Sham组和Model组)。再灌注72小时后，进行神经行为学评价，处死动物取大脑Nissl染色，检测海马CA1区和纹状体CPu脑区中同一部位的存活神经元细胞数，结果见图2。

与假手术组(Sham组)相比，小鼠双侧颈总动脉短暂结扎而造成脑缺血会引起模型组(Model组)动物的神经行为障碍、神经元丢失和星形胶质细胞过度激活。小鼠脑缺血再灌后静脉注射受试化合物，E-1盐酸盐、E-4盐酸盐均表现出神经保护作用，不仅可改善脑低灌状态下小鼠术后24小时、48小时及72小时的神经行为障碍，还能增加海马和纹状体脑区的神经元细胞数，效果优于依达拉奉。

实施例7血脑屏障透过性和代谢稳定性

体重200～220g的雄性SD大鼠，随机分为2组，每组6只，禁食12小时，分别静脉给予等摩尔剂量的E-1盐酸盐(12.7mg/5ml/kg)或依达拉奉(8.7mg/5ml/kg)。每组分别于给药后的5min和60min各处死3只动物。低温离心制备血浆，取大脑加入2倍重量的生理盐水研磨制备脑匀浆。血浆和脑匀浆样品经高氯酸沉淀蛋白后注入UPLC检测。通过化合物在脑组织与血浆中的浓度比值(B/P值)来评价其血脑屏障通透性，B/P值越大则说明化合物越容易透过血脑屏障。

色谱条件：Waters Acquity UPLC(含高压二元泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器)；色谱柱Hypersil-Gold C18(2.1mm×50mm，3μm)；流动相为醋酸铵缓冲液(醋酸调pH＝4.0)-甲醇(75:25，v/v)；流速0.4ml/min；柱温30℃；检测波长240nm。

结果见下表：

上述结果表明，E-1盐酸盐比依达拉奉更易透过血脑屏障且在脑内的代谢稳定性更好。

实施例8片剂的制备

1.处方(1000片量)：

E-4盐酸盐	100g
		淀粉	50g
微晶纤维素	20g
		硬脂酸镁	2g
羧甲基纤维素钠	5g
		50％乙醇	适量

2.制法：将化合物E-4、淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠粉碎、混匀，以50％乙醇适量作润湿剂制成软材，过20目筛制粒，60～80℃干燥，整粒，加硬脂酸镁混匀，压片，包薄膜衣。

实施例9注射剂的制备

1.处方(1000支量)：

化合物E-1	10g
		氯化钠	18g
注射用水加到	2000ml

2.制法：将氯化钠、化合物E-1依次加入注射用水，搅拌溶解，再加注射用水至足量，搅匀，溶液滤过，灌封，灭菌。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。