阅读说明：本技术 一种明胶/结冷胶/羟基磷灰石复合水凝胶及其制备方法 (Gelatin/gellan gum/hydroxyapatite composite hydrogel and preparation method thereof ) 是由 汤克勇 王绿阳 李萌雅 王芳 刘捷 郑学晶 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明属于组织工程技术领域,涉及一种应用于软骨替代物的新材料,具体涉及一种明胶/结冷胶/羟基磷灰石复合水凝胶,同时还涉及其制备方法。复合水凝胶由明胶、低酰基氧化结冷胶和氨基化羟基磷灰石制成,其中,明胶与低酰基氧化结冷胶的重量比为(10～30):(1～3)；氨基化羟基磷灰石的添加量为明胶和氧化结冷胶总重量的0.5%～2%。经过改性后的mHap的粒径明显降低,更接近纳米级,使得mHap在复合水凝胶中分布更为均匀,并且,在Gel-OG中引入mHap后所形成的水凝胶的网络更为致密,且mHap的引入对细胞的增殖有促进作用,使得Gel-OG/mHap具有良好的生物相容性、可降解性和自愈合性,有利于Gel-OG/mHap复合水凝胶在软骨组织工程领域的应用。(The invention belongs to the technical field of tissue engineering, relates to a new material applied to a cartilage substitute, in particular to a gelatin/gellan gum/hydroxyapatite composite hydrogel and a preparation method thereof. The composite hydrogel is prepared from gelatin, low-acyl oxidized gellan gum and aminated hydroxyapatite, wherein the weight ratio of the gelatin to the low-acyl oxidized gellan gum is (10-30) to (1-3); the addition amount of the aminated hydroxyapatite is 0.5-2% of the total weight of the gelatin and the oxidized gellan gum. The particle size of the modified mHap is obviously reduced and is closer to a nanometer level, so that the mHap is distributed in the composite hydrogel more uniformly, a network of the hydrogel formed after the mHap is introduced into the Gel-OG is more compact, and the introduction of the mHap has a promoting effect on the proliferation of cells, so that the Gel-OG/mHap has good biocompatibility, degradability and self-healing property, and the application of the Gel-OG/mHap composite hydrogel in the field of cartilage tissue engineering is facilitated.)

一种明胶/结冷胶/羟基磷灰石复合水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，涉及一种应用于软骨替代物的新材料，具体涉及一种明胶/结冷胶/羟基磷灰石复合水凝胶，同时还涉及其制备方法。

背景技术

软骨组织是一种高度有序、有纤维增强和细胞附着的水凝胶状组织，主要包含软骨组织细胞与细胞外基质（ECM），无淋巴、血管等器官。软骨组织中含有约70%的水、20%的胶原蛋白和10%的蛋白酶，而且组织向内逐渐分为四层结构，即表面、中部、深部和钙化软骨区，每层都具备不同的物理化学及生物特性。软骨组织覆盖在骨关节的末端，有负载减压、保护关节免受直接机械损伤等作用，对动物体的生命活动十分重要。

软骨组织损伤可直接造成关节机械功能退化和骨关节炎等慢性疾病，严重可导致持续疼痛甚至残疾。然而，由于人体关节软骨中缺少神经、淋巴、血管等可实现自我修复的器官，存在的修复细胞数量也有限，因而需要由外植入可以帮助其完成修复和愈合的材料或细胞。当前，可用于治疗和修复软骨组织的传统临床途径主要包括磨损关节置换手术、自体软骨细胞植入（ACI）和基因诱导的自体软骨细胞植入（MACI）等。这些手段往往需要较长的治疗时间，并且可能出现免疫排斥，从而对患者造成二次伤害。

近年来，越来越多的研究着力于寻求重建和开发软骨组织的材料及方法。同时，由于细胞分子生物领域与材料化学领域的进步和突破，利用组织工程技术修复受损人体组织成为了现实。生物材料作为组织工程技术中的重要一环，可以将受损的组织进行替换，还可以充当细胞载体，促进组织细胞再生。而对于软骨组织工程，将生物材料以植入或局部注射的方式替代受损软骨组织，已被作为一种有效的途径和手段来修复受损软骨组织。

目前，组织工程中主要开发和利用水凝胶及支架材料对受损的软骨组织进行修复。支架材料通常有作为关节软骨修复材料所需的机械性能，而且其形态结构与人体自然软骨组织相似；然而，支架材料的形状及机械性能存在一定固定性，不利于其完整匹配受损组织；而且，支架材料的孔洞结构往往较为紧密，甚至出现无孔形态，这将影响组织细胞于支架上的固定和生长，限制其在软骨组织工程中的应用。作为另一种新型的软骨替代及修复材料，水凝胶受到了极大的关注和研究。水凝胶是一类包含大量水且具有完整三维网络结构的材料，可以有效抑制亲水性物质溶于水相环境中。同时，水凝胶和细胞外基质的生理学结构相似，对代谢物质和营养物质表现出良好的渗透性。

当前，用于制备软骨修复水凝胶的原料主要包括天然高分子或合成高分子。合成高分子本身通常具有良好的机械性能，比如较高的拉伸强度，物化性能稳定。外科手术中常用的合成类聚合物有聚氨酯、聚乙二醇和聚丙烯醇等。但合成类聚合物通常伴随较大的细胞毒性，不利于组织细胞的贴附与增殖，而且不易被完全降解，对其于组织工程中的研究和应用造成了挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种明胶/结冷胶/羟基磷灰石复合水凝胶及其制备方法。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：一种明胶/结冷胶/羟基磷灰石复合水凝胶，由明胶溶液、氧化结冷胶溶液、氨基化羟基磷灰石制备而成。

进一步地，明胶与氧化结冷胶的重量比为（10～30）:（1～3）；氨基化羟基磷灰石的添加量为明胶和氧化结冷胶总重量的0.5%～2%。

上述复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（1）配制明胶溶液；

（2）配制氧化结冷胶溶液；

（3）将氨基化羟基磷灰石粉末分散到明胶溶液中，配制成明胶/羟基磷灰石混合溶液；

（4）于30～50℃下，将氧化结冷胶溶液滴入明胶/羟基磷灰石混合溶液中，混合均匀后倒入模具中，置于20～40℃水浴中反应12～18h；反应结束后冷却至室温，即得复合水凝胶。

进一步地，氧化结冷胶的制备步骤为：

（1）将结冷胶溶解分散于90～100℃的水中，搅拌均匀，制得结冷胶溶液；

（2）向结冷胶溶液中加入NaIO₄，NaIO₄与结冷胶的重量比为（0.5～1.3）:1，在35～55℃下，避光反应4～12h，制得氧化结冷胶混合液；

（3）将氧化结冷胶混合液置于透析袋中进行透析，并对透析后的混合液进行抽滤，将抽滤得到的溶液进行冷冻干燥制得氧化结冷胶；其中，透析袋截留分子的分子量为8～14kDa。

进一步地，氨基化羟基磷灰石的制备步骤为：

（1）将羟基磷灰石粉末按照1g:100mL的比例分散于含70%～90%无水乙醇溶液中，进行超声分散处理10～15min，制得混合液；

（2）向混合液中加入氨水和正硅酸乙酯，于60℃下搅拌反应，收集沉淀，并经醇洗、水洗、干燥制得沉淀物；

（3）取γ-氨丙基三乙氧基硅烷滴入含70%～90%无水乙醇溶液中，并向其中加入步骤（2）制得的沉淀物，在25℃～30℃下搅拌6～8h，离心收集沉淀，再经醇洗、水洗、干燥制得氨基化羟基磷灰石。

进一步地，羟基磷灰石的制备步骤为：

（1）分别将硝酸钙、磷酸氢二铵溶于水中，分别制得1.2M的Ca²⁺溶液、0.72M的HPO₄ ^2-溶液；

（2）在40℃～50℃下，将上述Ca²⁺溶液按照体积比1:1滴入HPO₄ ^2-溶液中，利用氨水将混合液的pH稳定在10.5，持续反应2h；

（3）将反应液于50℃下静置沉淀12h，收集沉淀，经醇洗、水洗、干燥后在900℃下煅烧2h制得羟基磷灰石。

进一步地，明胶水溶液的浓度为10～30wt%。

进一步地，氧化结冷胶溶液的浓度为1～3wt%。

进一步地，明胶溶液与氧化结冷胶溶液按照质量比1:1添加。

上述复合水凝胶在软骨组织替代材料中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

（1）本发明通过结冷胶的优化氧化条件，使得最终制得的氧化结冷胶的醛基含量较高，粒径降低，且粒径分布均一，提高氧化结冷胶作为化学交联剂的交联效果。

（2）本发明利用沉淀法制备羟基磷灰石（Hap），并使用正硅酸乙酯（TEOS）和γ-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）改性Hap得到氨基化羟基磷灰石（mHap），粒径测试和FESEM结果表明，经硅烷化改性后，Hap的粒径明显减小，接近纳米级，且分布更为均匀。FTIR和XRD结果表明，成功地将Si-O-Si与-NH2引入Hap中，硅烷偶联剂主要于Hap表面形成了单层结构，且未改变Hap的晶形结构。

（3）本发明通过将mHap掺入Gel-OG中，制备Gel-OG/mHap复合水凝胶，mHap和Gel-OG网络间存在较强的结合作用，使得Gel-OG/mHap复合水凝胶形成的网络更为致密，且Ca、P和Si元素均匀分布于水凝胶中。

（4）力学、溶胀和降解测试结果显示，mHap的掺入，显著提高了Gel-OG/mHap复合水凝胶的压缩力学强度，同时降低了平衡溶胀率和降解速率，与未掺入mHap的水凝胶相比，压缩力学强度提高了一倍。另外，含1 wt% mHap的Gel-OG/mHap复合水凝胶于90%形变的压缩力学强度最高为2.03MPa，能够满足人体关节软骨对压缩力学强度最低要求值0.78MPa。此外，该Gel-OG/mHap复合水凝胶的平衡溶胀率为776%，并且降解速率最低；该复合水凝胶经50次循环压缩，仍可保留初次压缩力学强度的91%，表现出良好的弹性和可压缩性。此外，它还具有良好的拉伸力学强度和一定的自愈合性。MTT测试结果表明，Gel-OG/mHap复合水凝胶对L929细胞均表现出良好的细胞相容性，mHap的引入对细胞的增殖有促进作用，这也有利于Gel-OG/mHap复合水凝胶在人体关节软骨组织工程中的应用。

综上所述，本发明以TEOS和APTES改性Hap制得mHap，并利用mHap掺入Gel-OG中制备Gel-OG/mHap复合水凝胶。经过改性后的mHap的粒径明显降低，更接近纳米级，使得mHap在复合水凝胶中分布更为均匀，并且，在Gel-OG中引入mHap后所形成的水凝胶的网络更为致密，且且Ca、P和Si元素均匀分布于水凝胶中。另外，mHap的掺入使得Gel-OG/mHap复合水凝胶具有较高的压缩力学强度，较低的平衡溶胀率和降解速率，能够满足关节软骨对压缩应力的基本要求。此外，mHap的引入对细胞的增殖有促进作用，表现出良好的生物相容性，还具有可注射和自愈合性能，有利于Gel-OG/mHap复合水凝胶在软骨组织工程领域的应用。

附图说明

图1为OG中的醛基含量折线图；

图2为GG溶液与OG溶液的粒径分布图像；

图3为GG与OG的FTIR图像；

图4为Hap和mHap的粒径分布图像；

图5为Hap与mHap的FTIR图像；

图6为Hap与mHap的XRD图像；

图7为Hap样品、mHap样品的FESEM图像；

图8为10wt% Gel、不同OG含量的Gel-OG水凝胶的截面形貌图；

图9为不同OG含量的Gel-OG水凝胶的压缩应力-应变曲线图以及90%形变时的压缩力学强度图；

图10为不同OG含量的Gel-OG水凝胶的溶胀曲线图；

图11为10wt%的明胶、不同mHap掺入量的Gel-OG/mHap复合水凝胶的FTIR表征图；

图12为Gel、OG和mHap之间可能存在的反应机理图；

图13为不同mHap掺入量的Gel-OG/mHap复合水凝胶的XRD图像；

图14为10wt%的明胶、不同mHap掺入量的Gel-OG/mHap复合水凝胶的断面形貌图；

图15为Gel-OG水凝胶和1 wt% mHap复合水凝胶的低倍FESEM图像；

图16为水凝胶的压缩应力-应变曲线及90%形变处的压缩力学强度图；

图17为不同mHap含量的复合水凝胶在PBS溶液中的溶胀曲线图；

图18为不同mHap含量的复合水凝胶在PBS溶液中的降解曲线；

图19为经过MTT试验所得不同培养天数的L929细胞的相对增值率（RGR/%）图。

具体实施方式

实施例1 氧化结冷胶的制备及表征

一、氧化结冷胶的制备方法

氧化结冷胶（OG）的制备过程如下：

（1）称取一定量的低酰基结冷胶（GG），分散于200mL、90℃的蒸馏水中，搅拌30min，得到均匀的GG溶液，并逐步降温至40℃。

（2）向GG溶液中加入一定量的NaIO₄，在避光条件下，控制氧化温度和氧化时间，并剧烈搅拌均匀得到氧化结冷胶混合液。

（3）将氧化结冷胶混合液倒入透析袋中，透析袋截留分子的分子量为8-14kDa，室温下使用蒸馏水透析5天，以除去残留的NaIO₄与反应副产物，对透析后的混合液进行抽滤，将抽滤得到的溶液于-20℃下预冻12h，再经冷冻干燥机进行冷冻干燥，制得氧化结冷胶，保存于-4℃备用。

二、不同反应条件对OG中醛基含量的影响

基于单因素实验分析法，探究不同NaIO₄用量、氧化温度、氧化时间对OG中醛基含量的影响。根据醛基含量测试结果优化OG的氧化条件，为复合水凝胶的制备提供原料。

（一）醛基含量测定方法

采用电位滴定法来测定OG的醛基含量，通过比较不同氧化条件所得OG醛基含量的高低，对氧化条件进行优化。

醛基含量测定原理为：醛基基团可以与盐酸羟胺中的氨基反应，产生肟与HCl；使用一定浓度得NaOH溶液对反应体系进行滴定，从而推算出OG中醛基的含量。

醛基含量测定详细的操作过程如下：称取0.5g OG溶解于25 mL 40℃的蒸馏水中，使用NaOH将其pH调至5；随后，向其中加入20mL浓度为0.72 mol/L、pH为5的盐酸羟胺溶液，将混合液置于40℃水浴环境搅拌反应4h；接着，使用1mol/L NaOH溶液将反应后混合液的pH滴定至5，消耗的NaOH溶液体积记为V₁（mL）；同时，使用上述方法对相同浓度GG溶液进行测定，此组为空白对照组，对应NaOH溶液的消耗量记为V₀（mL）；OG的醛基含量AC（mmol/g），其计算公式为：AC=（V₁-V₀）×C_NaoH/m_样，其中，C_NaoH表示NaOH溶液的浓度（mol/L），m_样表示样品即GG或OG样品的质量（g），每组样品平行试验三次并取平均值。

（二）单因素试验分析不同NaIO₄用量、氧化温度、氧化时间对OG中醛基含量的影响

1、控制氧化温度为40℃，氧化时间为8h，调整GG与NaIO₄质量比依次为1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1.1和1:1.3时，所得OG的醛基含量如图1（A）所示。随着NaIO₄用量增多，所得OG的醛基含量先大幅升高，而后趋于平衡。这可能是由于GG分子链上可被改性的羟基数量有限，氧化达到饱和状态时，过量的NaIO₄并不会使醛基含量明显增大。当GG与NaIO₄质量比为1:0.9时，所得OG的醛基含量为3.70 mmol/g，保持GG用量不便，继续增加NaIO₄用量，所得OG中醛基含量的增加速率明显降低，故选择GG与NaIO₄质量比优选为1:0.9。

2、控制GG与NaIO₄质量比为1:0.9，反应时间为8h，调整氧化温度依次为35、40、45、50、55°C时，所得OG的醛基含量如图1（B）所示，随着氧化温度逐渐升高，所得OG的醛基含量呈现先升高后降低的趋势。氧化温度为40°C时，对应所得OG的醛基含量最高，达到3.75mmol/g。这可能是由于较低的温度，不利于氧化反应的发生，反应速率较慢；而温度过高时，部分NaIO₄会发生分解，影响与GG的氧化反应。另外，醛基可能会在高温下发生缩合反应，最终导致醛基含量减少，故氧化温度优选为40℃。

3、控制GG与NaIO₄质量比为1:0.9，氧化温度为40℃，调整氧化时间依次为4、6、8、10和12h时，所得OG的醛基含量如图1（C）所示，OG的醛基含量随着氧化时间增加呈现先升高后降低的趋势，醛基含量于8h处达到最大，为3.51 mmol/g。氧化时间短，氧化程度较小；氧化时间达到8h左右时，氧化过程可能已基本进行完全，如继续增长氧化时间，醛基含量开始下降，这可能是由于部分醛基继续发生反应生成了羧基。此外，由于部分醛基会与多糖分子链上的羟基基团进行缩合作用，得到的半缩醛结构也会导致醛基含量的降低。故氧化时间优选为8h。

综上所述，根据OG中醛基含量测试结果，结合经济效益、能耗和氧化反应程度等因素，得出GG较为合适的氧化条件为：GG与NaIO₄质量比为1:0.9，氧化温度为40°C，氧化时间为8h，所制得的OG的醛基含量约为3.75 mmol/g。

三、粒径分析

通过动态光散射激光在氧化前后GG溶液中的散射，确定扩散速度，检测试样的粒径尺寸，以探究氧化过程对GG粒径尺寸的影响。分别将少量、等量的GG和OG溶于一定量去离子水中。利用动态光散射（DLS）粒度分析仪分别对溶液中GG与OG的粒径尺寸进行检测，绘制强度自相关曲线，表示出溶液中粒径尺寸的分布信息。

GG溶液与OG溶液的粒径分布图像如图2所示，其中图2（A）为GG粒径分布图，图2（B）为OG粒径分布图。在图2（A）中，GG的粒径主要分布在518.4 nm处，有一部分粒径分布在约11.2 μm处，这可能是由于GG本身存在该尺寸的粒径，也可能是溶液中的GG分子链间形成了物理交联，互相缠绕导致的。在图2（B）中，OG的粒径主要分布于269.0 nm处，整体粒径尺寸相对于GG减小。一方面，这可能是由于氧化过程使GG发生了降解，导致分子链变短；另一方面，这可能是由于氧化后GG分子链间的结合作用减弱，OG溶液的流动性相对增强，不易形成较大尺寸的粒径。这些结果表明，相较于GG，氧化后所得的OG粒径变小，溶液中粒径尺寸分布较窄，表现的较为均一，有利于其作为化学交联剂的交联效果。

四、傅里叶红外光谱（FTIR）表征

使用FTIR对GG和OG进行表征，以分析反应过程中化学基团的变化，检测氧化及反应过程是否成功。分别将冻干的GG和OG样品剪碎，并分别与KBr以质量比1:100混匀研磨成粉，然后使用FTIR仪器（SpectrumGX, USA）进行检测，扫描范围定为400cm^-1～4000 cm^-1。

GG与OG的FTIR图像如图3所示，1069cm^-1、1638 cm^-1与2930cm^-1处的振动峰，分别对应于GG和OG中的C-O-C基团、C=O基团与C-H基团。相比GG的FTIR曲线，OG的FTIR曲线于1725cm^-1处出现一个新峰，对应于醛基基团的伸缩振动峰，该结果表明在GG中引入了醛基，使用NaIO₄成功地氧化了GG。此外，氧化前后GG的FTIR曲线中未有其他新峰的出现，表明氧化改性过程没有改变GG分子链上的其他基团及GG的整体结构。

实施例2 氨基化羟基磷灰石的制备及表征

一、氨基化羟基磷灰石的制备

氨基化羟基磷灰石的制备过程包括羟基磷灰石（Hap）的合成，以及由羟基磷灰石制备氨基化羟基磷灰石（mHap）的过程，具体过程如下：

（一）羟基磷灰石的合成

（1）分别将硝酸钙和磷酸氢二铵溶于蒸馏水中，分别得到1.2M的Ca²⁺溶液、0.72M的HPO₄ ^2-溶液。

（2）在40℃下，将Ca²⁺溶液按照体积比1:1缓慢滴入HPO₄ ^2-溶液中，同时，使用氨水将混合液的pH稳定在10.5，持续反应2h。

（3）将反应液于50℃下静置沉淀12h，离心收集白色沉淀，交替使用无水乙醇、蒸馏水洗涤沉淀，至少洗涤三次，以除去残留的氨水和反应试剂，将收集的白色沉淀于电鼓风干燥箱内，于60℃下干燥2h，随后转移至马弗炉中，在900℃下煅烧2h制得羟基磷灰石。

（二）氨基化羟基磷灰石的合成

（1）称取2g羟基磷灰石粉末，加入到200mL含90%无水乙醇的蒸馏水中，超声分散处理15min.

（2）向混合液中加入1mL氨水和1.5mL正硅酸乙酯（TEOS），于60℃剧烈搅拌2h，离心收集沉淀，交替使用无水乙醇和蒸馏水对沉淀进行洗涤，至少洗涤三次，以除去残余的TEOS和氨水，再将沉淀转移至电鼓风干燥箱中，在60℃下干燥2h，得到白色固体。

（3）称取0.44g的γ-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）滴入200mL含90%无水乙醇的蒸馏水中，并向其中加入1.83g白色固体，于25℃下剧烈搅拌6h，再通过离心分离混合液，收集沉淀，将收集到的沉淀交替使用蒸馏水和无水乙醇洗涤，以除去残留的APTES和氨水，随后于60℃下干燥制得氨基化羟基磷灰石（mHap）。

二、粒径分析

由于磷灰石的粒径大小对复合水凝胶的稳定性具有较大的影响，故利用动态光散射法对磷灰石粒径的大小进行测定分析。

具体测定方法为：分别取等量的Hap、mHap加入去离子水中，制得具有相同浓度的Hap、mHap的混合液，超声处理10min。使用动态光散射粒度分析仪对混合液中的Hap和mHap的粒径进行检测。

Hap和mHap的粒径分布图像如图4所示，其中图4（A）为Hap粒径分布图像，图4（B）为mHap粒径分布图像。在图4（A）中，Hap的粒径尺寸分布较宽，主要分布在750.2 nm左右，且于1.6µm处仍有分布。在图4（B）中，mHap的粒径尺寸分布较窄，mHap的粒径相比Hap有所减小，主要分布在187.8 nm左右。这表明，经过硅烷化改性后，mHap的粒径明显减小，接近纳米级别，在混合液中分布更为均一。可以合理推测，与Hap相比，mHap的表面结合能降低，不易形成聚集形态，有利于其于有机基质中形成良好的分散。

三、FTIR表征

1、检测方法

分别将制得的Hap、mHap与KBr以1:100的比例混匀研磨成粉，并压片，利用FTIR仪器进行检测，扫描范围设定为400cm^-1～4000cm^-1。FTIR表征可以分析反应过程中化学基团的变化，并检验实验是否成功制备出mHap，即Hap上是否成功引入Si-O-Si和-NH₂基团。

2、检测结果

Hap与mHap的FTIR图像如图5所示，图中3573 cm^-1处对应的为-OH基团的振动峰。一定程度上，改性后纳米粒子上残余羟基的数量越少，表明硅烷偶联剂在粒子表面形成的单层结构越完善。与Hap相比，mHap的FTIR曲线中-OH峰的强度明显降低，这可能是由于TEOS和APTES在Hap表面主要形成了单层结构；在mHap的FTIR曲线中，1382 cm^-1和3130 cm^-1附近分别对应C-N基团和N-H基团的伸缩振动峰，807 cm^-1处对应于硅氧烷基团（Si-O-Si）的弯曲振动峰，这验证了mHap表面硅元素的存在。综上分析可知，本发明方法成功地将Si-O-Si和-NH₂引入Hap制得mHap。

四、X射线衍射（XRD）表征

1.表征方法

XRD表征可以用于分析样品的晶型结构以及晶体化合物的晶型变化。分别将Hap、mHap样品研磨成粉末，再使用 XRD仪器对其进行检测。扫描速度为20°/min，选择5°～80°对样品进行表征。

2.表征结果

Hap与mHap的XRD图像如图6所示，2θ于5.8°、31.8°、32.9°和34.1°处对应的尖峰分别是由于Hap的（002）、（211）、（300）以及（202）的反射引起的，这证明成功地合成了Hap。合成的Hap经TEOS和APTES处理后得到的mHap，mHap的XRD衍射图与Hap相比没有发生明显变化，表明硅烷化改性并未改变Hap样品的晶型结构，这有利于保留Hap的生物活性。

五、FESEM与EDS表征

1.表征方法

检测样品的截面形貌与元素组成，可以通过FESEM与EDS仪器联用来实现。分别称取一定质量的Hap和mHap粉末添加到乙醇水溶液中，得到相同质量分数的Hap与mHap混合液，超声处理10 min。接着，各取少量均匀混合液，滴到硅片表面上，自然风干。使用 Hitachi E1010 型离子溅射镀膜机对待测样品进行铂金溅射镀膜，置于FESEM和EDS仪器中进行观察样品的截面形貌。

2.表征结果

Hap样品、mHap样品的FESEM图如图7所示，其中图7（A）为Hap样品的FESEM图，图7（B）为mHap样品的FESEM图。如图7（A）所示，Hap颗粒趋于聚集，甚至出现板结现象，这可能是由于Hap具有较高的表面结合能。图7（B）中可以看出mHap颗粒为球形或接近球形，它们均匀分布并且平均粒径在100 nm左右。具有或含有纳米级别的材料已被证明可在多个方面为成骨细胞和骨组织细胞提供调控作用。此外，经硅烷化改性后，Hap表面变得粗糙，这可能是由于Hap表面覆盖上了硅涂层。与Hap颗粒相比，mHap颗粒表现出较低的聚集性，具有良好的分散性，可以提供更多与有机基质结合的机会，使复合后的水凝胶材料较为均匀，有利于表现出较好的力学性能。

实施例3 明胶/氧化结冷胶水凝胶的制备及表征

一、明胶/氧化结冷胶水凝胶的制备方法

明胶/氧化结冷胶（Gel-OG）水凝胶的制备过程如下：

（1）称取1g Gel于50°C溶于蒸馏水中，制得20 wt%的Gel溶液。

（2）称取一定量的OG于40°C溶于蒸馏水中，分别制得1wt%、1.5wt%、2wt%、2.5wt%及3wt%的OG溶液；其中，氧化结冷胶（OG）由实施例1优化后的条件制备得到，即在OG的制备过程中GG与NaIO₄质量比为1:0.9，氧化温度为40°C，氧化时间为8h。

（3）在40°C下分别将不同浓度的OG溶液与Gel溶液按照质量比1:1混匀。

（4）将混合液分别倒入五个玻璃试管中，玻璃试管的内径均为13mm，深度均为100mm，封口并置于30°C水浴中12h。最后，移出试管并冷却至室温，剥开试管，分别得到Gel-OG水凝胶样品3-1～3-5，即样品3-1～3-5分别由1wt%、1.5wt%、2wt%、2.5wt%及3wt%的OG与GG反应制得。

二、场发射扫描电镜（FESEM）表征

1.表征方法

将10wt% Gel水凝胶、样品3-1～3-5的Gel-OG水凝胶置于液氮中预冻，再置于冻干机（GT2-Type-8, LYOTECH, Germany）中冻干48h。冻干的Gel水凝胶以及Gel-OG水凝胶样品在液氮环境下进行横截面脆断，使用小型离子溅射仪（Hitachi E 1010, Japan）给样品表面喷涂一层铂金，随后置于FESEM仪器（S4800, Hitachi, Japan）下观察样品的截面形貌。

2.表征结果及分析

2.3.4 FESEM表征分析

10wt% Gel水凝胶、样品3-1～3-5的Gel-OG水凝胶的截面形貌图如图8所示，其中，图8（A）为10wt%Gel的截面形貌图；图8（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分别为样品3-1～3-5的Gel-OG水凝胶的截面形貌图。

由图8可以看出，Gel水凝胶、样品3-1～3-5的Gel-OG水凝胶均表现出良好的三维孔洞结构，Gel水凝胶的孔径约为25µm，而Gel-OG水凝胶的孔径均小于10µm，故Gel-OG水凝胶形成的网络结构相对于10 wt% Gel水凝胶更为致密和规整，这是由于Gel-OG水凝胶制备过程中发生了席夫碱化学交联，产生的交联点更多。

此外，随着OG溶液浓度从1wt%增至2wt%，如图8（B）～（D）所示，所得Gel-OG水凝胶的孔直径从约10µm减小至约3µm。这可能是由于OG加入量升高后，与Gel发生席夫碱反应产生的化学交联点数量增多，易形成更为致密的网络结构。而OG溶液浓度从2wt%增至3wt%时，如图8（D）～（F），所得Gel-OG水凝胶形成的网络逐渐变得疏松，且孔结构变得不规则。这可能是由于交联剂OG溶液的浓度较大，局部易与Gel分子链发生快速交联，阻碍了OG与其他Gel分子链的接触，导致OG与Gel形成的化学交联网络不规则，孔洞大小不均匀。综上所述，当OG溶液浓度为2wt%时，所得Gel-OG水凝胶的网络结构最规整和致密，孔洞最小，可能对应较高的机械强度。

三、压缩力学性能测试

1.压缩力学性能测试方法

将样品3-1～3-5的Gel-OG水凝胶制备成直径为13mm、高度为15mm的圆柱样，室温下置于物性测试仪（TA. XTPlus, UK）测试台上，压缩测试元件以0.5mm/s的速度向下压缩，恒定压缩形变设置为90%。每组样品至少重复试验三次并取平均值。

2.压缩力学性能测试结果及分析

不同OG含量的Gel-OG水凝胶（样品3-1～3-5）的压缩应力-应变曲线图如图9（A）所示，并且不同OG含量的Gel-OG水凝胶在90%形变处的压缩力学强度如图9（B）所示。

在图9（A）中可以看到，所测的五种Gel-OG水凝胶在90%形变时均未发生断裂，表现出良好的韧性。随着OG溶液浓度从1wt%增至3wt%，水凝胶于90%形变时的压缩力学强度呈现先增大后减小的趋势，如图9（B）所示。其中，2wt%时的力学强度最大，为1.81MPa。这可能是由于OG溶液浓度不超过2wt%时，作为交联剂的OG溶液较为均一，与Gel间的交联较均匀；而当OG溶液浓度高于2wt%时，向Gel中滴入OG溶液，可能因局部交联剂浓度过大而形成快速交联，导致Gel-OG水凝胶中存在未交联的Gel部分，降低了其整体力学强度。这些结果表明，使用2wt% OG溶液与Gel发生反应，有利于形成具有较均匀化学交联网络的Gel-OG水凝胶，获得较高的压缩力学强度。

四、溶胀行为测试分析

1.测试方法

按照表1配制pH为7.4的PBS溶液。将样品3-1～3-5的Gel-OG水凝胶切成直径为13mm，厚度为2mm的薄片并且冻干。然后，分别将冻干样品称重，记为W₀（g），接着浸入PBS溶液中，移至37°C的电热恒温培育箱中。一定时间后，取出样品并用滤纸轻拭其表面的溶液，再次将样品称重，记为W_s（g）。水凝胶样品的溶胀率SR（%）按公式SR（%）=[(W_s-W₀)/W₀]×100进行计算。

2.检测结果

不同OG溶液浓度所得Gel-OG水凝胶（即样品3-1～3-5）的溶胀曲线如图10所示，所测五种Gel-OG水凝胶均于28h左右达到溶胀平衡，随着OG溶液浓度从1wt%增至3wt%，水凝胶的平衡溶胀率呈现先降低后升高的趋势。其中，由2wt%的OG溶液制得的水凝胶的平衡溶胀率最低，为920%，这是由于该水凝胶的孔洞结构比其他水凝胶更致密和规整，形成的孔洞较小，这与前述Gel-OG水凝胶的截面形貌检测结果相一致。OG溶液浓度为3wt%时所得水凝胶在溶胀初期0-5h内的溶胀率较其他水凝胶低，这可能是由于该水凝胶内局部含有较致密的网络结构；而在溶胀10h后，该水凝胶的溶胀率上升较快，这是由于水凝胶内可能存在较多的未化学交联部分，提高了整体水凝胶的溶胀率。致密的孔洞结构往往会导致较低的平衡溶胀率。一方面，这是由于致密的孔洞会限制溶胀液的进入；另一方面，具有致密孔洞结构的水凝胶的稳定性较高，不易发生涨破。由于对水凝胶样品进行了冻干，导致样品吸收了大量的溶胀液，使测得的平衡溶胀率偏大。应用于体内环境的水凝胶材料，本身需具备较低的平衡溶胀率，故将OG溶液浓度设置为2wt%比较合适。

综上所述，当Gel溶液的浓度为20wt%，OG溶液浓度为2wt%时，由Gel和OG制得的Gel-OG水凝胶网络结构最规整和致密，孔洞最小，且该水凝胶具有较低的溶胀率，适用于人体关节软骨组织；当该水凝胶处于90%形变时的压缩力学强度达1.81MPa，根据现有文献报道（Sun W, Xue B, Li Y, et al. Polymer‐supramolecular polymer double‐networkhydrogel[J]. Advanced Functional Materials, 2016, 26(48): 9044-9052.），人体关节软骨的压应力在0.78～10MPa，由Gel和OG制得的Gel-OG水凝胶的压缩力学强度虽能达到人体关节软骨对压缩力学强度的最低要求，但仍待进一步提高。

实施例4 不同用量的氨基化羟基磷灰石对复合水凝胶的性能的影响

一、明胶/氧化结冷胶/氨基化羟基磷灰石复合水凝胶的制备

一种明胶/氧化结冷胶/氨基化羟基磷灰石复合水凝胶的制备方法包括以下步骤：

（1）配制明胶溶液：称取1g明胶于50℃的蒸馏水中，配制成20wt%的明胶溶液，于40℃下保存备用。

（2）配制氧化结冷胶溶液：称取0.1g氧化结冷胶溶解于40℃的蒸馏水中，制得2wt%的氧化结冷胶溶液，其中，氧化结冷胶由实施例1优化后的条件制备得到，即在OG的制备过程中GG与NaIO₄质量比为1:0.9，氧化温度为40°C，氧化时间为8h。

（3）在搅拌状态下向明胶溶液中添加一定量的氨基化羟基磷灰石，制得明胶/氨基化羟基磷灰石溶液，其中，氨基化羟基磷灰石由实施例2所述方法制得。

（4）在40℃下，将氧化结冷胶溶液滴入明胶/氨基化羟基磷灰石溶液中，搅拌均匀后转移至透明玻璃试管中，玻璃试管的内径为13mm，深度为100mm，将玻璃试管置于30℃的水中，水浴反应12h，随后取出冷却至室温，制得明胶/氧化结冷胶/氨基化羟基磷灰石复合水凝胶。

参照上述方法，在步骤（3）中向明胶中分别添加0wt%、0.5wt%、1.0wt%、1.5wt%、2.0wt%的氨基化羟基磷灰石，最终制得的复合水凝胶依次记为样品4-1、样品4-2、样品4-3、样品4-4和样品4-55，样品4-1～4-5均经冷冻干燥后备用。其中，氨基化羟基磷灰石的添加量以明胶、氧化结冷胶总重的百分数计；样品4-1的制备过程中未添加氨基化羟基磷灰石，即样品1为明胶/氧化结冷胶水凝胶，样品4-2～4-5为明胶/氧化结冷胶/氨基化羟基磷灰石复合水凝胶。

二、FTIR表征

1.检验方法

以10wt%的明胶作为对照，分别将冻干的样品4-1～4-5、对照样明胶与KBr以1:100的比例混匀研磨成粉，并压片，利用FTIR仪器进行检测，扫描范围定为400cm^-1～4000 cm^-1。

2.检测结果

10wt%的明胶、样品4-1～4-5的FTIR表征结果如图11所示，图中，3439 cm^-1处的宽吸收峰是由N-H与O-H键合的伸缩振动引起的，随mHap含量升高而向高波数方向移动，这表明复合水凝胶中Gel、OG与mHap间的氢键作用增强。相比于样品4-1（Gel-OG）的FTIR曲线，可以观察到复合水凝胶（Gel-OG/mHap）的FTIR曲线在566cm^-1、602cm^-1、631cm^-1和961 cm^-1处均有振动峰，这些峰对应于Hap的磷酸根基团（-PO₄ ^3-），表明mHap成功地掺入Gel-OG网络中。同样地，不同mHap含量的复合水凝胶的FTIR曲线中，900 cm^-1～1200 cm^-1波数范围的相对强度相差较大，1031 cm^-1处对应OG中C-O键的伸缩振动峰，相比Gel的FTIR曲线，此峰于Gel-OG的FTIR曲线中向低波数方向移动，这是由于Gel与OG间存在席夫碱化学交联；而随着mHap含量升高，此峰逐渐向高波数方向移动，这可能是由于mHap与OG间增加的化学交联影响了OG与Gel间的化学反应。上述结果表明，mHap与有机基质间存在较强的相互作用，Gel-OG/mHap复合水凝胶制备成功。

基于上述分析，Gel、OG和mHap之间可能存在的反应机理如图12所示。OG分子链上的-CHO可以直接交联Gel分子链上的-NH₂，形成Gel-OG网络；同时，mHap上的-NH₂可以与OG分子链上的-CHO反应，并通过与Gel-OG网络之间形成氢键，增强与有机基质间的相互作用。

三、X射线衍射（XRD）表征

1.表征方法

分别将10wt%的明胶冻干样品、样品4-1～4-5的冻干样品研磨成粉末状，再使用XRD仪器对明胶、样品4-1～4-5进行检测，扫描速度为20°/min，选择5°～80°对上述待检样品进行表征。

2.表征结果

样品4-1～4-5的XRD图像如图13所示，20°处的峰是由Gel-OG水凝胶产生的，此结晶峰的强度随mHap掺入量的增加而逐渐减弱，且变得钝化，这表明OG、Gel和mHap之间的氢键作用增强。mHap掺入Gel-OG后，于31.8°出现了一个明显的结晶峰，此峰对应Hap典型的结晶峰，峰的强度随mHap含量的增加而增大，且结晶峰的位置未发生明显移动。此外，复合水凝胶的XRD曲线主要表现为有机相，与Gel-OG水凝胶的XRD曲线相似，这是由于掺入mHap的含量较低。由不同mHap含量复合水凝胶的XRD图像，发现mHap的晶体结构在所有水凝胶中都保持良好，表明mHap与有机基质良好共混。

四、FESEM与EDS表征

1.表征方法

将明胶、样品4-1～4-5冻干样品，置于液氮环境下脆断，使用Hitachi E 1010 型离子溅射镀膜机对所有样品4-1～4-5进行铂金溅射镀膜，置于FESEM和EDS仪器中进行观察。

2.表征结果

10 wt%的Gel及样品4-1～4-5的断面形貌图如图14所示，其中图14（A）为10 wt%的Gel水凝胶的断面形貌图，图14（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分别为样品4-1～4-5水凝胶的断面形貌图。

10 wt%的Gel及样品4-1～4-5水凝胶样品均表现出良好的三维孔洞结构。其中，10wt%的Gel水凝胶形成的孔洞较其他水凝胶大，这是由于其他水凝胶都发生了化学交联反应。随着mHap含量从0增至1 wt%，水凝胶形成的网络逐渐变得致密，并具有一定的取向性。这种形态变化可能是由于复合水凝胶中，mHap与Gel通过氢键作用连接，OG与mHap之间氢键与共价键的形成，进一步增加了Gel与OG分子链之间的接触机会，有利于形成更为致密的水凝胶网络。含1 wt% mHap复合水凝胶在多孔结构中表现出大量的小孔，并且其网络相对于其他水凝胶的更致密。当mHap的含量继续增加时，复合水凝胶呈现出相对疏松的网络结构，这可能是由于过多的mHap占据了Gel和OG的反应位置，阻碍了Gel和OG分子链之间的相对运动和接触。然而，与Gel-OG水凝胶（样品4-1）相比，复合水凝胶形成的网络更为致密，这可能是由于水凝胶中增加的氢键作用。由图14（C）～（F）可以推断，mHap粒子可能是均匀分布在复合水凝胶网络中，而不是在其表面聚集，这表明mHap与有机基质间良好的相互作用，有利于提高水凝胶的机械性能。

Gel-OG水凝胶（样品4-1）和1 wt% mHap复合水凝胶（样品4-3）的低倍FESEM图像如图15所示，其中，图15（A）为样品4-1凝胶的断面形貌图以及相应的EDS图；图15（B）为样品4-3复合水凝胶的断面形貌图以及相应的EDS图。由图15可以看到，Gel-OG和1 wt% mHap复合水凝胶都形成了三维的有序孔洞结构，后者的网络结构较前者更致密。相比Gel-OG水凝胶，复合水凝胶内明显含有C、Ca、P和Si元素，表明mHap中含有Si元素，且成功地掺入到空白水凝胶中。此外，Ca、P与Si元素分布较为均匀，表明mHap粒子在复合水凝胶中分布均匀，并未发生明显聚集现象，进一步说明无机粒子和有机基质间良好的结合作用。由于加入mHap的质量相对于Gel-OG水凝胶的低，所以Ca、P和Si的元素点并没有C元素密集，亮度也较低。

五、力学性能测试

1.测试方法

水凝胶的压缩力学强度可以表示材料承压的能力，是设计负载水凝胶的重要参数之一，水凝胶的压缩力学强度测定方法如下：将直径为13 mm、高度为15 mm的样品4-1～4-5水凝胶切成圆柱样，室温下置于物性测试仪测试台上，压缩测试元件以0.5 mm/s的速度向下压缩，恒定压缩形变设置为90%。选取含1 wt% mHap的复合水凝胶（即样品4-3）做循环压缩测试，循环次数设置为50次，恒定形变为85%。每组样品至少重复试验三次并取平均值。

2.测试结果

水凝胶的压缩应力-应变曲线及90%形变处的压缩力学强度如图16所示。图16（A）为样品4-1～4-5水凝胶的照片，随着mHap含量增加，水凝胶的颜色从棕黄色逐渐向白色过渡。并且，可以观察到mHap分布均匀，没有出现明显聚集现象。由图16（B）和（C）均为样品4-3的压缩性能测试图片和打结性与拉伸性能测试图片，可以看出，复合水凝胶显示出较好的韧性、拉伸性能及力学强度。

图16（E）为样品4-1～4-5的压缩力学强度结果，Gel-OG水凝胶在90%形变时的压缩力学强度为1.18MPa，所检测的复合水凝胶（样品4-2～4-5）的压缩力学强度均高于Gel-OG水凝胶（样品4-1）。一方面，这是由于复合水凝胶形成的网络较Gel-OG水凝胶更致密，这导致了较大面积上的能量消散；另一方面，mHap与有机基质间的紧密连接可以抑制复合水凝胶在压缩过程中的微观裂纹的生长。其中，mHap含量为1 wt%时，所得复合水凝胶于90%形变处的压缩力学强度高达2.03MPa，并且没有破裂，相对于未掺入mHap的Gel-OG水凝胶，掺入1%mHap的Gel-OG/mHap复合水凝胶的压缩强度提升了一倍。根据已公开的文献（W. Sun, B.Xue, Y. Li, M. Qin, J. Wu, K. Lu, J. Wu, Y. Cao, Q. Jiang, W. Wang, AdvancedFunctional Materials 2016, 26, 9044）中指出人体关节软骨的压应力应达到0.780～10MPa，能够满足人体部分关节软骨组织对压缩力学强度的要求，相对于未掺入mHap的Gel-OG水凝胶，Gel-OG/mHap复合水凝胶扩大了在人体关节软骨组织中的应用范围。

当mHap的含量从1 wt%增至2 wt%时，所得复合水凝胶的压缩力学强度降低，这可能是由于过多的mHap会干扰Gel-OG有机网络的形成，导致疏松的网络结构，降低了水凝胶的机械强度。这些结果表明，mHap与有机基质间的良好整合增加了水凝胶的抗压强度。

含1 wt% mHap复合水凝胶（样品4-3）的循环压缩应力-应变曲线如图16（F）所示，经过50次循环压缩（恒定压缩形变为85%）后，复合水凝胶的压缩力学强度仍具有初次的91%，表明该复合水凝胶具有良好的可变形性和弹性。这是由于水凝胶中存在可逆的储存能量，高弹性还证明了水凝胶具有可重复使用性。综上所述，利用硅烷偶联剂方法，提升mHap与有机基质间的相互作用，使得水凝胶的柔韧性升高，这有利于其在生物软组织工程中的应用。

六、自愈合行为

1.检测方法

选用直径为13 mm、厚度为2 mm的含1 wt% mHap的复合水凝胶（样品4-3）进行宏观自愈合性能测试。首先，将水凝胶薄片切成两部分，经过亚甲基蓝溶液染色后，将它们拼接在一起并于37℃静置12h，观察水凝胶的形态变化。

2.检测结果

含1 wt% mHap复合水凝胶（样品4-2）的愈合性能测试照片如图16（D）所示。将完整的复合水凝胶切成两部分，然后使用亚甲基蓝溶液染色，将两部分拼接在一起于37°C静置12 h后，发现复合水凝胶两部分之间的边界几乎消失了，这表明两部分作为一个整体粘结在了一起。接着，给该复合水凝胶施加外力拉伸，愈合水凝胶的两部分并未发生分离。这种可修复的水凝胶可能是基于37°C无任何外部刺激时，亚胺键的可逆性。本测试表明，这种具有良好自愈合能力的Gel-OG/mHap复合水凝胶有利于延长其于人体环境中的使用寿命。

七、溶胀行为

1.检测方法

首先，按表1配制pH为7.4的PBS溶液。将不同mHap含量的水凝胶（样品4-1～4-5）切成直径为13mm，厚度为2mm的圆片，并且冻干。然后，分别将冻干样品称重，记为W₀（g），接着浸入PBS溶液中，移至37°C的电热恒温培育箱中。一定时间后，取出样品并用滤纸轻拭其表面的溶液，再次将样品称重，记为W_s（g）。水凝胶样品的溶胀率SR（%）按公式SR（%）=[(W_s-W₀)/W₀]×100进行计算。

2.检测结果

溶胀行为作为水凝胶用于组织工程中重要的考虑因素之一，在人体内具有转移营养和废物的功能。不同mHap含量复合水凝胶（样品4-1～4-5）于37°C下PBS溶液中的溶胀曲线如图17所示。所测水凝胶样品均在30h内均达到溶胀平衡，且该平衡状态可以维持20h，这源于它们高度互连的多孔结构。此外，复合水凝胶的平衡溶胀率低于Gel-OG水凝胶（样品4-1）。这是由于复合水凝胶形成的网络更为致密，导致溶胀液的渗透性降低。mHap含量从0 wt%增至1 wt%时，水凝胶的平衡溶胀率从1010%降至769%，这可能是网络的致密性影响了水凝胶的溶胀性。mHap含量从1 wt%增至2 wt%时，水凝胶的平衡溶胀率从769%增至937%。一方面，这可能是由于mHap上具有一定数量的游离氨基和羟基，它们都是亲水性的；另一方面，过多的mHap会影响复合水凝胶中Gel-OG交联网络的形成，导致大孔结构，水凝胶将吸收更多的溶胀液，表现出更高的溶胀率。基于上述结果，mHap与有机基质间的强相互作用将导致较低的溶胀率，有利于水凝胶维持体内环境的结构和性能稳定性。

八、胶原酶降解行为

1.测定方法

体外环境，使用含胶原酶的PBS溶液对冻干水凝胶的降解速率进行测定。首先，分别将冻干后的不同mHap含量水凝胶（n=5）称重，记为W₀（g），然后，于37℃浸入含有2μg/mLⅠ型胶原蛋白酶的PBS溶液中。一定时间后将样品取出，经3次蒸馏水冲洗并且冻干后，再次称重，质量记为W_t（g），使用下述公式对水凝胶样品的降解速率（DR）进行计算：DR (%)=[(W₀-W_t)/W₀]×100。

2.测定结果

水凝胶的结构稳定性以及对应的降解行为，对其在软骨组织工程的应用尤为重要。不同mHap含量的复合水凝胶于37^oC下含2 µg mL^-1 I型胶原酶的PBS溶液中的降解曲线如图18所示。由于I型胶原酶的存在，所测水凝胶均在6天内完全降解，并显示出不同程度的质量损失。随着mHap的加入，复合水凝胶的降解速率比Gel-OG水凝胶低，这与水凝胶的溶胀行为研究结果相似。含1 wt% mHap复合水凝胶的降解速率最低，这与其网络致密性及mHap和有机基质的强相互作用有关。随着mHap含量从1 wt%升至2 wt%，水凝胶的降解速率略有上升。此外，mHap粒子牢固地嵌入复合水凝胶中，并与有机网络间具有良好的界面相互作用，Hap以有机基质的降解速率而释放，这有利于无机矿物相晶体的形成和伤口愈合。综上表明mHap和有机网络之间的强相互作用可以减少Gel和OG之间的亚胺键的裂解，进一步抑制复合水凝胶的降解。

九、细胞相容性

1.检测方法

采用噻唑蓝（MTT）比色法对不同mHap含量的水凝胶的细胞相容性进行检测。本实验选小鼠成纤维（L929）细胞为试验细胞对象。利用紫外光对水凝胶样品灭菌，再使用无水乙醇对其消毒，浸入DMEM后制得浸提液，作为样品组的细胞培养液来培养L929细胞。经MTT法测得不同组的吸光度，经一定公式计算得到样品组的细胞相对增殖率（RGR/%），从而评价水凝胶的生物相容性与细胞毒性。

细胞复苏与培养：首先，从液氮中取出封装有L929细胞的冻存管中，移至37°C水浴中缓慢振荡，尽量使其在3min内融化。然后，对其喷洒75%酒精灭菌，移至离心机以1200rpm/min速度离心4min，弃上清。灭菌后转至超净操作台，加入1mL 10%牛血清的培养液，将含有细胞的培养液分装至培养瓶中，移至37°C，5% CO₂的恒温培养箱中培育，每两天给细胞换一次培养液。含10%血清培养基的配制方法如下，将DMEM与FBS按9:1的比例混合，并向其中加入少量双抗，使用漩涡器混匀。

细胞传代与种板：将装有L929细胞的培养瓶置于显微镜下观察，当细胞在培养瓶中的密度超过80%，且大多数呈现纤维状生长时，进行传代操作。首先，吸出旧培养液，用PBS溶液对贴细胞一侧的培养瓶壁轻轻冲洗，注意防止细胞的损失。再加入适量的胰蛋白酶溶液，移至37°C，5% CO₂恒温培养箱中消化，使细胞脱离培养瓶壁。3min后取出培养瓶，并置于显微镜下观察，若大多数细胞呈圆球状，且轻轻摇晃培养瓶出现脱壁，则小心将胰蛋白酶溶液吸出，加入适量培养液并小心吹打细胞使其全部离壁。接着，使用离心管分装细胞悬浮液进行离心操作，以1200rpm/min的离心速度离心4min后，弃上清液。再加入适量培养液并小心吹打细胞，以得到细胞均匀分散的悬浮液。

采用血球计数板细胞计数法统计悬浮液中的细胞数量。首先，一定程度地稀释细胞悬浮液，随后以单孔约5000个细胞的比例将其接种到3个96孔板中。每个孔板包含阳性对照组、阴性对照组以及样品组，其中，阳性对照组的孔中加入DMSO溶液；阴性对照组的孔中加入DMEM培养基溶液；样品组的孔中加入水凝胶样品在DMEM中的浸提液。

实验：首先，取3个接种过细胞的孔板并移至37°C，5% CO₂的恒温培养箱中培育48h，定时更换培养液。然后，吸出3个96孔板中的旧培养液，各孔更换为水凝胶材料的浸提液、阴性对照组以及阳性对照组的培养液后，移至37°C，5%CO₂的恒温培养箱中培育，定时更换培养液。第1、3和5天，分别取出1个孔板，接着以10 μL/孔的浓度加入0.5% MTT溶液，移至37°C，5% CO₂的恒温培养箱中反应4h。然后，取出发生结晶现象的96孔板，小心吸出上清液（不要触碰结晶），向各孔添加适量DMSO后，移至振荡器上缓慢摇晃10 min，以保证结晶完全溶解。于570 nm利用酶标仪测定各孔溶液的吸光度，记为OD。其中，OD值越大，表示该孔中存活形态的L929细胞数量越多。使用公式计算细胞相对增殖率（RGR/%），RGR（%）=（OD_sample/OD_control）×100，其中OD_sample和OD_control分别对应被测样品组与阴性对照组的OD值。

根据公式计算所得的RGR，结合表2（ISO 10, 993-5标准）判断对应水凝胶材料的细胞毒性。其中，0级和1级代表该材料对细胞无毒性；2级表示该材料对细胞的毒性大小，应参考细胞的具体存在形态综合分析；3-5级表示该材料有明显细胞毒性，不适合用作生物医用材料。

2.检测结果

细胞相容性是确定材料尤其是改性材料能否用于组织工程中的重要考虑因素。经过MTT试验所得不同培养天数的L929细胞相对增殖率（RGR/%）如图19所示，即培养细胞1、3和5天后，对水凝胶材料的细胞毒性进行评估。材料若无细胞毒性，其RGR需高于75%，对应细胞毒性等级为0或1级（见表2）。如图19所示，样品组中细胞的RGR在86%至124%的范围内，表明Gel-OG水凝胶及不同含量mHap复合水凝胶无明显细胞毒性。此外，在第1、3与5天，随着mHap含量升高，样品组水凝胶的RGR呈现先增加后降低的趋势，1 wt% mHap含量的RGR最高。可能有以下两方面的原因：一方面，含1 wt% mHap的复合水凝胶比其他水凝胶具有更小的孔洞，这可能会限制其于DMEM中溶胀时，自身降解产物的释放，导致样品浸提液中降解产物较少；另一方面，样品组的细胞活力高低可能与Hap的含量有关。此外，已经有研究证明使用硅烷偶联剂改性Hap并不会增加其毒性，而且相比Hap更有利于细胞的增殖，这是由于mHap存在许多有效的细胞结合位点，因此，一些mHap粒子可能从水凝胶支架释放到样品浸提液中，这有助于细胞的增殖。复合水凝胶的RGR值上升可能主要是由于具有良好生物相容性的未交联Gel及多糖溶解于培养液中。相比阴性对照组，水凝胶的RGR在第3天下降，又在第5天上升。这可能是由于MTT实验中培养基更换和其他操作导致的细胞损失。综上所述，复合水凝胶具备较好的细胞相容性，且经硅烷化改性的Hap有利于L929型细胞的增殖。

综上所述，本发明以TEOS和APTES改性Hap制得mHap，并利用mHap掺入Gel-OG中制备Gel-OG/mHap复合水凝胶。经过改性后的mHap的粒径明显降低，更接近纳米级，使得mHap在复合水凝胶中分布更为均匀，并且，在Gel-OG中引入mHap后所形成的水凝胶的网络更为致密，且且Ca、P和Si元素均匀分布于水凝胶中。另外，相比Gel-OG水凝胶，Gel-OG/mHap复合水凝胶具有较高的压缩力学强度，较低的平衡溶胀率和降解速率。此外，mHap的引入对细胞的增殖有促进作用，表现出良好的生物相容性，还具有可注射和自愈合性能，有利于Gel-OG/mHap复合水凝胶在软骨组织工程领域的应用。