阅读说明：本技术 一种具有广泛pH值适应性的淀粉普鲁兰酶及应用 (Starch pullulanase with wide pH value adaptability and application thereof ) 是由 柏玉香 李晓晓 金征宇 于 2020-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有广泛pH值适应性的淀粉普鲁兰酶及应用,属于酶工程及生物改性淀粉技术领域。本发明提供了一种新的淀粉普鲁兰酶,并将其用于淀粉液化,以期为后续淀粉深加工提供合适底物。该淀粉普鲁兰酶在pH5.5和pH8.5条件下具有等同的活性,且在pH4.5-10.0之间保持超过一半的稳定的酶活。该酶的最适温度为75-80℃,且半衰期约为8h。此酶的热稳定性、广泛的pH作用范围,使其可单独或与多种酶类复配,应用于淀粉深加工,提高淀粉液化效率及淀粉底物的利用率,为淀粉加工提供了新的思路,有着巨大潜力和应用前景。(The invention discloses a starch pullulanase with wide pH value adaptability and application thereof, belonging to the technical field of enzyme engineering and biological modified starch. The invention provides a novel starch pullulanase, which is used for starch liquefaction so as to provide a proper substrate for subsequent starch deep processing. The starch pullulanase has equivalent activity under the conditions of pH5.5 and pH8.5, and more than half of stable enzyme activity is kept between pH4.5 and pH 10.0. The optimal temperature of the enzyme is 75-80 ℃, and the half life period is about 8 h. The enzyme has thermal stability and wide pH action range, can be independently compounded with various enzymes or compounded with various enzymes, is applied to deep processing of starch, improves the starch liquefaction efficiency and the utilization rate of a starch substrate, provides a new idea for starch processing, and has huge potential and application prospect.)

一种具有广泛pH值适应性的淀粉普鲁兰酶及应用

技术领域

本发明涉及一种具有广泛pH值适应性的淀粉普鲁兰酶及应用，属于酶工程及生物改性淀粉技术领域。

背景技术

目前，全球每年用于工业转化的淀粉量高达5千万吨，我国每年有1千万吨淀粉用于转化葡萄糖、发酵用糖或酒精生产用糖。糖以其与国计民生的紧密关系在国民经济中占有重要地位，其在食品、饮料、发酵等领域应用广泛。目前淀粉制糖工艺主要是酶法，包括液化和糖化两个阶段。液化阶段是整个淀粉转化生产葡萄糖工艺最为重要的阶段，其结果对最终产品葡萄糖的经济指标与质量指标均有较大影响。传统工艺中液化的pH值一般为6.0-6.5，此pH值的设定并不是依据淀粉转化为葡萄糖的最适反应pH，而是α-淀粉酶的最适反应条件。在此pH条件下进行液化反应时，较高的pH和热作用，淀粉分子还原性末端的葡萄糖分子会异构为果糖分子。在随后进行的糖化反应中，糖化酶不能将水解果糖与葡萄糖之间的α-1,4-糖苷键，在糖化结束后产物中存在麦芽酮糖副产物，此副产物会影响后续葡萄糖浆的利用。此外，糖化酶的最适反应条件约为pH4.5-5.0，因此需要在糖化步骤之前调节液化产物的pH值，造成酸碱消耗。由于酶制剂工业技术的进步，利用不同的酶制剂来确保液化的pH值更接近于葡萄糖高产的方向，以及使得调浆的pH值与糖化时的pH值接近从而减少酸碱的消耗，简化工艺步骤，同时降低糖化液后处理时的离子交换及树脂再生成本。

发明内容

发明人通过大量的筛选，提供了一种pH使用范围广的淀粉普鲁兰酶，该酶具有广泛的pH适应性和良好的热稳定性，可在不同的条件下实现淀粉的快速液化降黏，避免与其它酶类复配时需二次调节pH的问题，可以用于淀粉加工行业。

本发明的第一个目的是提供SEQ ID NO.1所示的淀粉普鲁兰酶在液化淀粉方面的应用。

本发明的第二个目的是提供编码淀粉普鲁兰酶的基因；所述基因含有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒为PMC系列、pET系列或pGEX系列中的一种。

本发明的第四个目的是提供一种表达SEQ ID NO.1所示淀粉普鲁兰酶的基因工程菌。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌或黑曲霉为宿主。

本发明的第五个目的是提供一种促进淀粉快速液化降黏的方法，所述方法用SEQIDNO.1所示的淀粉普鲁兰酶水解淀粉乳；所述淀粉普鲁兰酶的用量为10-40U/g淀粉；所述淀粉乳的质量分数为1-40％，水解过程控制温度为68-95℃。

在一种实施方式中，所述的淀粉乳的pH值为4.5-10.0。

在一种实施方式中，所述的液化时间为0.5-8h。

在一种实施方式中，所述的方法具体为：将淀粉按一定的浓度调浆，加入淀粉普鲁兰酶进行升温液化，煮沸灭酶。

在一种实施方式中，所述的淀粉普鲁兰酶的具体生产过程为：

(1)将编码淀粉普鲁兰酶的基因SEQ ID NO.2接入质粒，构建表达载体，制得携带淀粉普鲁兰酶基因的质粒；

(2)将质粒转入宿主菌，选取阳性单克隆发酵培养，得到淀粉普鲁兰酶粗酶，经过分离纯化，制得所述的淀粉普鲁兰酶纯酶。

在一种实施方式中，所述分离纯化的方法为亲和层析法、疏水层析法、超滤层析或凝胶过滤层析法。

在一种实施方式中，所述的淀粉是将淀粉原料初步酸解后的可溶性淀粉，或马铃薯淀粉、木薯淀粉、红薯淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、大米淀粉、豌豆淀粉、绿豆淀粉、高粱淀粉、蜡质玉米淀粉中的一种或几种。

本发明还要求保护所述的方法在食品、化工、医药领域的应用。

有益效果：本发明提供了一种新淀粉普鲁兰酶及其在淀粉液化降黏中的应用。该淀粉普鲁兰酶可同时水解淀粉中的α-1,4和α-1,6糖苷键，且具有广泛的pH适应性，因此可用于淀粉液化预处理，以方便后期与其它酶类的复配作用，避免黏度过大难以搅拌以及不同酶类需二次调节pH的问题，为淀粉加工生产提供便利。

附图说明

图1：重组菌Amypul-pET-28a(+)/E.coli BL21(DE3)发酵液的胞内上清组分、胞内上清组分75℃热处理10min以及镍亲和层析纯化的SDS-PAGE电泳结果；其中，M：蛋白分子量标准；1：胞内上清组分；2：胞内上清组分75℃热处理10min；3：两步纯化后的纯酶。

图2：本发明淀粉普鲁兰酶在不同pH条件下的酶活变化。

图3：本发明普鲁兰酶在不同pH条件下保存24h后的酶活变化。

具体实施方式

淀粉普鲁兰酶的酶活测定：称取1.0g可溶性淀粉，在50mM的pH5.5的醋酸缓冲液和pH8.5的磷酸缓冲液中分散，在100℃的条件下搅拌30min，充分糊化淀粉样品，之后在75℃下保温。取0.9mL可溶性淀粉(1％)底物，加入0.1mL纯酶，在75℃下保温10min后，加入1mLDNS溶液终止反应，沸水浴5min后置于冰水浴中冷却，在540nm处测吸光值。以同样条件下加入灭活酶液的反应体系作为空白对照。

淀粉普鲁兰酶的酶活(U)定义为：在上述分析条件下，每分钟催化产生相当于1μmoL葡萄糖当量的还原力的酶量定义为一个活力单位。

淀粉水解液DE值的测定：

DE值＝还原糖含量(％)/干物质含量(％)×100

其中，干物质含量采用阿贝折光仪测定，还原糖含量采用斐林试剂法测定，具体测试方法为：

(1)斐林试剂的标定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶中，加入10ml蒸馏水，并从滴定管中加入0.2％标准葡萄糖液若干毫升，其量应控制在后滴定时(消耗0.2％的标准葡萄糖0.5-1.0ml)。摇匀，于电炉上加热至沸，并保持微沸2min，加2滴1％次甲基蓝溶液，继续用0.2％标准的葡萄糖溶液滴定至蓝色消失为终点。此滴定操作在1min内完成，记录耗用的0.2％标准葡萄糖溶液体积为V₀毫升。

(2)定糖预备试验：吸取斐林甲、乙液各5ml，置于250ml三角瓶中，准确加入10ml样品糖液，摇匀于电炉上加热至沸。加2滴1％次甲基蓝溶液，用0.2％标准葡萄糖液滴定至蓝色消失。消耗标准葡萄糖液V₁毫升。

(3)样品中还原糖的测定：准确吸取斐林甲、乙液各5ml,置于250ml三角瓶中，准确加入10ml样品糖液，补加(V₀-V₁)毫升蒸馏水，并从滴定管中预先加入(V₁-1)毫升0.2％标准葡萄糖液。摇匀，于电炉上加热至沸，保持微沸2min，加入2滴1％次甲基蓝溶液，继续用0.2％标准葡萄糖滴定至蓝色消失。此操作在1min内完成。记录消耗标准葡萄糖液总体积为V毫升。

还原糖含量(g/mL，以葡萄糖计)＝(V₀-V)×0.2×0.1×n

其中：V₀-斐林试剂标定值；V-样品糖液测定值；0.2-标准葡萄糖液浓度；10-样品糖液体积；n-样品稀释倍数。

实施例1：淀粉普鲁兰酶的制备

合成SEQ ID NO.2所示的基因，将SEQ ID NO.2编码的淀粉普鲁兰酶的基因接入质粒pET-28a(+)中，构建表达载体Amypul-pET-28a(+)，将表达载体导入宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)进行发酵产酶。种子液以5％的接种量接入含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、160rpm摇瓶70min后，OD值落在0.6-0.8之间。之后加入终浓度0.4mM的诱导剂IPTG，在18℃、160rpm的条件下诱导培养24h。将发酵液在4℃、8000×g的条件下离心15min得到菌体。对菌体进行超声破碎(240W)，之后在4℃、8000×g的条件下离心30min得到粗酶液。对粗酶液进行75℃保温处理10min，之后在4℃、8000×g的条件下离心30min去掉热不稳定杂蛋白，并收集上清液。将上清液过镍亲和层析，在20mM咪唑的条件下洗脱得到淀粉普鲁兰酶纯酶(结果见图1)。

实施例2：淀粉普鲁兰酶的酶活及最适pH、pH稳定性测试

(1)酶活的最适pH测定

配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液代替淀粉普鲁兰酶酶活测定中的缓冲液，分别在75℃下测定淀粉普鲁兰酶的活力，以酶活最高定义为100％，其余酶活与之相比计算得到相对酶活，以考察酶的最适作用pH(检测结果见图2)，结果表明，该淀粉普鲁兰酶在酸性条件pH5.5和碱性条件pH8.5的条件下有最高活性，且活力等同。在pH4.0-10.0的范围内，该酶均表现出稳定性，活力保持在50％以上。

其他来源的酶的最适pH列表如表1，通过对比可以看出，本申请筛选的淀粉普鲁兰酶适用的pH范围广。

表1不同来源的淀粉水解酶的最适pH

(2)酶活的pH稳定性测定

配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的缓冲液代替淀粉普鲁兰酶酶活测定中的缓冲液，将纯化得到的酶分别在上述缓冲体系中4℃下保存24h后，在75℃下测定淀粉普鲁兰酶的活力，以酶活最高定义为100％，其余酶活与之相比计算得到相对酶活，以考察酶的pH稳定性(结果见图3)。结果表明，该酶在不同pH的条件下均具有良好的稳定性，24h的酶活损失在5％以内，且最适作用条件不变。

实施例3：淀粉普鲁兰酶在淀粉液化中的应用

配制浓度为30％(w/v)的马铃薯淀粉乳，调节pH为5.5，加入10U淀粉普鲁兰酶，升温液化，在75℃保温30min，测反应产物的DE值，DE值为14.2。

实施例4：淀粉普鲁兰酶在淀粉液化中的应用

配制浓度为30％(w/v)的马铃薯淀粉乳，调节pH为8.5，加入10U淀粉普鲁兰酶，升温液化，在75℃保温30min，测反应产物的DE值，DE值为13.1。

实施例5：淀粉普鲁兰酶在淀粉液化中的应用

配制浓度为40％(w/v)的玉米淀粉乳，调节pH为5.5，加入20U淀粉普鲁兰酶，升温液化，在75℃保温30min，测反应产物的DE值，DE值为13.9。

实施例6：淀粉普鲁兰酶在淀粉液化中的应用

配制浓度为40％(w/v)的玉米淀粉乳，调节pH为8.5，加入20U淀粉普鲁兰酶，升温液化，在75℃保温30min，测反应产物的DE值，DE值为12.8。

对比例1：

具体步骤同实施例1，不同的是将实施例中的10U淀粉普鲁兰酶，替换为10U的α-淀粉酶(诺维信)，测定反应产物的DE值，DE值为14.7。

对比例2：

具体步骤同实施例5，不同的是将实施例中的10U淀粉普鲁兰酶，替换为10U的α-淀粉酶(诺维信)，测定反应产物的DE值，DE值为13.5。

表2不同条件下水解淀粉的效果

实施例编号	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6	对比例1	对比例2
							DE值	14.2	13.1	13.9	12.8	14.7	13.5

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种具有广泛pH值适应性的淀粉普鲁兰酶及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1203

<212> PRT

<213> Caldisericum exile

<400> 1

Gly Cys Ala Pro Lys Ala Lys Pro Leu Asn Val Ile Val Met Phe His

1 5 10 15

Asn His Gln Pro Phe Tyr Lys Asp Pro Glu Ser Asn Thr Tyr Ile Leu

20 25 30

Pro Trp Val Arg Leu His Gly Ala Lys Asp Tyr Tyr Arg Met Pro Tyr

35 40 45

Leu Ser Ser Gln Phe Lys Asp Ile His Ile Thr Tyr Asp Leu Ser Gly

50 55 60

Ser Leu Ile Asp Gln Ile Lys Asp Tyr Leu Ser Gly Val Glu Asp Lys

65 70 75 80

Tyr His Ile Val Ser Arg Val Asp Pro Asp Lys Leu Thr Ile Asp Gln

85 90 95

Lys Phe Phe Met Leu Ser Ile Pro Gly Gly Phe Phe Asp Ile Asn Trp

100 105 110

Asp His Ile Ile Lys Lys Val Pro Leu Tyr Thr Asp Leu Leu Asn Lys

115 120 125

Arg Gln Asp Ile Phe Lys Gln Tyr Ser Ile Glu Asp Lys Asp Lys Leu

130 135 140

Val Asn Ala Tyr Ser Ser Gln Asp Tyr Leu Asn Leu Gln Thr Leu Phe

145 150 155 160

Asn Leu Phe Trp Leu Asp Val Asn Tyr Ile Lys Ser Asp Pro Glu Leu

165 170 175

Ala Pro Leu Leu Asp Lys Ala Tyr Lys Lys Glu Asn Phe Thr Ile Glu

180 185 190

Glu Arg Asn Leu Val Leu Arg Lys Gln Met Glu Ile Met Ser Met Ile

195 200 205

Leu Pro Glu Tyr Lys Lys Leu Met Asp Glu Lys Leu Ile Glu Ile Val

210 215 220

Ser Thr Pro Phe Ala His Pro Ile Ser Pro Leu Leu Val Asp Phe Gly

225 230 235 240

Leu Ser Thr Glu Leu Lys Glu Gln Leu Asp Ala Ser Asn Lys Leu Phe

245 250 255

Asn Glu Thr Phe Gly Ser Thr Pro Ala Gly Ile Trp Ala Ser Glu Cys

260 265 270

Ala Leu Asn Asp Asp Val Leu Lys Ile Phe Ser Glu Phe Asn Leu Lys

275 280 285

Trp Thr Ile Ser Asp Ile Asp Asn Leu Pro Gln Leu Gly Ile Asp Lys

290 295 300

Asn Asp Pro Ile Lys Ala His Leu Pro Tyr Thr Ile Asn Gly Val Thr

305 310 315 320

Val Phe Phe Arg Asp Lys Tyr Leu Ser Asp Gly Ile Ser Phe Arg Tyr

325 330 335

Ser Gly Lys Ser Val Asn Glu Ala Ile Thr Asp Val Glu Thr Thr Leu

340 345 350

Thr Asn Leu Gln Lys Leu Asn Thr Ala Gly Asp Leu Val Tyr Thr Ile

355 360 365

Ala Leu Asp Gly Glu Asn Ala Trp Glu Tyr Tyr Glu Asn Asp Gly Asn

370 375 380

Asp Phe Leu Asn Ala Phe Tyr Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Lys Lys

385 390 395 400

Gly Ile Ile Lys Val Val Thr Pro Ser Glu Tyr Leu Ser Lys Phe Lys

405 410 415

Gly His Glu Val Thr Leu His Lys Val Ser Ala Leu Tyr Leu Glu Asn

420 425 430

Lys Asp Ile Ser Asn Ile Asn Ser Tyr Ser Asn Leu Pro Lys Arg Glu

435 440 445

Tyr Asp Gly Tyr Phe Gly Glu Ser Ser Trp Val Asn Pro Thr Leu Asp

450 455 460

Thr Trp Ile Gly Glu Pro Gln Glu Asn Ile Ala Trp Met Trp Leu Ile

465 470 475 480

Asp Ala Tyr Lys Lys Tyr Lys Glu Lys Glu Asn Ser Leu Ser Leu Ser

485 490 495

Ile Gln Thr Glu Val Arg Arg Asp Leu Met Ile Ala Glu Gly Ser Asp

500 505 510

Trp Phe Trp Trp Tyr Gly Ser Asp Gln Ser Ser Gly Asn Asp Pro Ala

515 520 525

Phe Asp Arg Leu Tyr Lys Ile His Leu Gly Glu Ile Tyr Lys Lys Ile

530 535 540

Gly Ser Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Tyr Gly Asn Tyr Phe Pro Asp Gly

545 550 555 560

Glu Pro Tyr Val Ser Thr Glu Ile Ser Leu Lys Asp Asp Glu Val Val

565 570 575

Ser Val Ser Asn Leu Ser Asn Met Lys Ile Gly Glu Met Val Tyr Ser

580 585 590

Lys Lys Lys Asn Leu Leu Thr Leu Lys Leu Asn Ser Gln Asp Phe Ile

595 600 605

Val Ala Val Tyr Asn Gly Lys Ser Leu Asn Ser Phe Leu Ser Glu Gln

610 615 620

Thr Lys Pro Arg Asn Phe Asn Met Ser Asn Phe Pro Tyr Thr Asn Glu

625 630 635 640

Ser Ile Gly Met Pro Val Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Lys Asp Ser Val

645 650 655

Tyr Ser Leu Asp Leu Asn Gly Leu Asn Leu Asn Lys Leu Tyr Ile Val

660 665 670

Ile Val Gly Val Lys Asn Gly Asn Ile Lys Val Glu Thr Gln Pro Ile

675 680 685

Lys Leu Lys Phe Pro Leu Asn Ile Gly Gly Thr Leu Ile Gly Glu Leu

690 695 700

Tyr Asp Gln Ala Asn Asp Asp Ser Gly Pro Gly Thr Tyr Thr Tyr Pro

705 710 715 720

Leu Asn Asp Val Phe Lys Asn Lys Gly His Leu Phe Asp Leu Ile Ser

725 730 735

Phe Lys Met Tyr Asp Ala Gly Glu Asn Tyr Ile Leu Gln Tyr Glu Met

740 745 750

Gly Ser Ile Gly Gly Asn Pro Trp Asn Gly Pro Asn Gly Phe Ser Phe

755 760 765

Gln Ile Ile Glu Thr Tyr Phe Asp Val Ile Asp Gly Gly Met Thr Glu

770 775 780

Pro Ile Asp Val Asn Gly Pro Asn Ala Leu Leu Asp Asp Lys His Pro

785 790 795 800

Trp Asp Val Ala Ile Arg Ile Ala Gly Trp Ser Tyr Gly Asn Tyr Ile

805 810 815

Gln Asn Ser Lys Gly Glu Val Ala Gln Gly Glu Leu Gly Ile Ser Val

820 825 830

Asp Asn Glu Lys Asn Thr Ile Asn Val Val Val Pro Lys Lys Tyr Leu

835 840 845

Ser Ile Asn Ser Asn Tyr Thr Pro Tyr Val Cys Ile Ile Ser Gly Ser

850 855 860

Gln Asp Gly Tyr Gly Ala Gly Tyr Phe Arg Ala Ile Thr Gln Thr Ala

865 870 875 880

Ser Glu Trp Thr Cys Gly Gly Gly Asp Pro Glu Ala Leu Asn Ala Gly

885 890 895

Val Leu Pro Lys Val Met Asp Ile Phe Thr Pro Lys Asp Lys Thr Gln

900 905 910

Lys Glu Ile Leu Thr Ser Tyr Asp Val Asn Ser Lys Lys Leu Ala Ile

915 920 925

Ile Pro Met Leu Pro Leu Glu Lys Ala Lys Glu Val Pro Asn Leu Ile

930 935 940

Ser Ser Tyr Lys Leu Asn Ile Gly Glu Ile Thr Pro Pro Asn Ser Glu

945 950 955 960

Phe Ser Leu Asp Ile Gln Ile Lys Asn Ile Gly Lys Gly Asp Gln Asp

965 970 975

Asp Leu Glu Gly Asn Glu Leu Thr Leu Tyr Ile Pro Asp Phe Val Lys

980 985 990

Val Arg Lys Ile Glu Thr Ser Ser Phe Lys Ser Val Ile Asn Gly Lys

995 1000 1005

Val Ile Ala Phe Asn Gly Ser Val Lys Lys Gly Glu Val Glu Lys

1010 1015 1020

Val Lys Ile Thr Phe Gly Leu Ala Ser Asn Val Pro Asn Ala Tyr

1025 1030 1035

Lys Glu Asn Phe Lys Gly Ile Leu Ser Phe Asn Gly Asp Gly Leu

1040 1045 1050

Gly Lys Asn Ser Thr Ser Ser Ala Phe Glu Phe Tyr Phe Tyr Thr

1055 1060 1065

Ser Tyr Lys Leu Glu Ile Cys Leu Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Leu

1070 1075 1080

Val Arg Asn Gly Ser Asn Ile Gln Phe Lys Asn Ala Asn Ile Lys

1085 1090 1095

Thr Glu Phe Ser Glu Arg Phe Asn Asp Ala Thr Thr Ser Leu Glu

1100 1105 1110

Asp Leu Cys Asn Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Asn

1115 1120 1125

Lys Leu Thr Leu Val Phe Met Asp Asn Lys Tyr Glu His Trp Val

1130 1135 1140

Gly Gln Asn Lys Ala Leu Leu Asn Gly Ser Ala Ile Pro Leu Val

1145 1150 1155

Gln Gly Glu Gln Asn Ile Arg Ser Tyr Val Glu Asn Gly Ile Leu

1160 1165 1170

Lys Phe Pro Ile Lys Ala Leu Ala Tyr Ala Phe Lys Phe Lys Tyr

1175 1180 1185

Asn Ile Asp Ser Val Asn Lys Thr Ala Asn Leu Tyr Tyr Leu Pro

1190 1195 1200

<210> 2

<211> 3612

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggatgtgctc caaaggcaaa accacttaac gtcattgtaa tgtttcacaa tcatcagcct 60

ttttataaag atcccgagtc taatacatat attctacctt gggtaaggct tcacggggct 120

aaagattact ataggatgcc ttatctttca tctcaattca aggatataca cataacgtat 180

gatctttccg ggagccttat tgatcaaata aaagactatc taagcggagt agaagataaa 240

tatcatattg tttccagagt tgacccagat aaacttacaa ttgaccaaaa gtttttcatg 300

ctatctatcc ctggtgggtt ctttgatatc aattgggatc acattataaa gaaagttcct 360

ctatacacag atttattaaa taaaagacaa gacattttca aacagtattc aatagaggat 420

aaagataaat tggttaatgc ttattcaagt caagattatt taaatttaca aacactcttt 480

aacctctttt ggcttgatgt aaattacata aaaagcgatc ctgaattggc acctctttta 540

gataaggcat ataagaaaga aaatttcact atagaggaaa gaaatcttgt cttaagaaaa 600

cagatggaaa taatgtcaat gattctgcct gaatacaaga agttaatgga tgagaaactc 660

atcgaaattg tttcaacgcc atttgcgcat ccaatttctc cacttcttgt agattttggt 720

ttatcaactg aattaaaaga acaattggat gcttctaaca agctttttaa tgaaacgttt 780

ggctcaacac cagcaggaat ttgggcttcg gaatgtgctc ttaacgacga tgttttgaaa 840

atatttagcg aatttaattt aaagtggacc atctccgata tcgataacct tcctcaactc 900

gggatagaca aaaatgatcc tataaaagcg catcttccat atactattaa cggggttaca 960

gtatttttta gagacaaata tttatctgat ggaattagtt ttagatactc aggaaaatct 1020

gttaatgagg caataactga tgttgaaaca acgcttacga atttacaaaa actcaatacg 1080

gcaggtgatc ttgtttatac aattgctctt gatggagaga atgcgtggga atactatgaa 1140

aatgacggaa acgatttctt aaacgcgttt tatggtaaac tttcggaact tcaaaagaag 1200

ggaattataa aagtagtaac accgtctgaa tatctttcga agtttaaagg ccatgaggtg 1260

actttacata aagtatcagc actttatctt gagaataaag atatatctaa tattaactct 1320

tattcaaatc ttccaaagag agagtatgat gggtattttg gagaatcaag ttgggtgaat 1380

ccaacgcttg atacatggat tggtgaacct caagaaaata ttgcgtggat gtggttaatt 1440

gacgcatata aaaaatacaa agaaaaagaa aattctctca gtttgagtat tcaaactgaa 1500

gttaggcgag atttgatgat tgcagaggga tctgattggt tttggtggta tggaagtgat 1560

caaagttcag gaaatgaccc tgcatttgat agattatata aaatacattt gggagaaatt 1620

tacaaaaaaa ttggaagtga tattccagat tatctttatg gaaattattt cccagatggg 1680

gaaccttatg tatcaactga aatatcctta aaggatgatg aggttgtttc tgttagtaat 1740

ctttcgaata tgaaaatagg ggaaatggtt tatagcaaaa agaaaaattt gctaacttta 1800

aaactcaatt ctcaagattt cattgttgca gtatataacg gaaaatcttt aaattcattt 1860

ttaagcgaac agacaaaacc cagaaacttt aatatgagca atttcccata tacaaacgaa 1920

agtattggaa tgcccgttga ttttgagatt tacgggaaag atagtgtata ttctttggat 1980

ctaaatggtc tcaacttgaa caagttatat atcgtaatag taggtgttaa aaacgggaat 2040

ataaaggtag aaacacaacc tattaaatta aaattcccgc taaacattgg aggaaccctt 2100

ataggtgaac tttacgatca agcaaatgat gatagcgggc ctggaactta tacctatcct 2160

cttaacgatg tgtttaaaaa taagggtcat ctttttgatt taatttcctt taagatgtat 2220

gatgcaggag agaattatat acttcagtat gaaatgggtt ccataggtgg aaatccttgg 2280

aatggaccta atggtttttc ttttcaaatt attgaaacat actttgatgt tattgatggt 2340

ggaatgaccg agcctattga tgttaatggt ccaaatgctt tgcttgatga taagcatcct 2400

tgggatgttg caattcgtat tgcagggtgg tcatatggca actatataca aaattcaaaa 2460

ggtgaagttg cacaaggaga acttggaatt tcagttgaca atgaaaagaa tacaataaac 2520

gttgtagtac ctaaaaagta tctttcaatt aattccaatt atactcctta tgtgtgcatc 2580

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