阅读说明：本技术 一种生物制备甘露糖甘油酸的方法 (Method for biologically preparing mannose glyceric acid ) 是由 杨建刚 孙媛霞 田朝玉 曾艳 马延和 于 2020-06-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种生物制备甘露糖甘油酸的方法,涉及构建体外多酶催化反应体系,包括甘露糖激酶、甘露糖1-磷酸糖基转移酶和甘露糖甘油酸合成酶三种酶,实现转化甘露糖和甘油酸合成甘露糖甘油酸；本发明还公开了重组谷氨酸棒杆菌的构建方法,并将重组菌株应用于甘露糖甘油酸的发酵合成,实现了以甘露糖和甘油酸为原料发酵法合成甘露糖甘油酸产物,所获得的甘露糖甘油酸可应用于食品、医药、化妆品等领域。(The invention discloses a method for biologically preparing mannose glycerate, which relates to the construction of an in vitro multi-enzyme catalytic reaction system, comprises three enzymes of mannose kinase, mannose 1-phosphate glycosyl transferase and mannose glycerate synthetase, and realizes the conversion of mannose and glycerate to synthesize mannose glycerate; the invention also discloses a construction method of the recombinant corynebacterium glutamicum, and the recombinant strain is applied to the fermentation synthesis of the mannoglyceric acid, so that the mannoglyceric acid product is synthesized by taking mannose and glyceric acid as raw materials through a fermentation method, and the obtained mannoglyceric acid can be applied to the fields of food, medicine, cosmetics and the like.)

一种生物制备甘露糖甘油酸的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物制备甘露糖甘油酸的方法，属于生物制造领域。

背景技术

甘露糖甘油酸由一个甘露糖分子和一个甘油酸分子连接组成，该化合物对于许多高温细菌具有重要意义，保持其在极端条件下稳定的渗透压力；同时，还有助于维持蛋白质结构的稳定性，并且效果要优于海藻糖、甘油或任何其它已知的溶剂。最近有实验表明，在体外条件下甘露糖甘油酸可以显著增强人体的免疫系统，具有治疗由于蛋白质错误折叠或神经衰退而引发疾病(例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病)的作用。当前制备甘露糖甘油酸主要从海藻中提取，这种方法的生产成本很高，且提取率很低，阻碍了其在工业上的推广应用。相关研究以酵母菌株为出发菌株，通过构建微生物重组菌株，实现发酵法合成甘露糖甘油酸，但是产量很低，远不能达到生产要求。因此，亟待开发高效的甘露糖甘油酸绿色制备技术，为甘露糖甘油酸在更广范围内应用提供基础。

发明内容

本发明目的一是提供一种制备甘露糖甘油酸的方法，其以甘露糖和甘油酸为底物，通过体外多酶催化反应催化生产甘露糖甘油酸。

其特征在于，以甘露糖为底物，加入甘露糖激酶、甘露糖1-磷酸糖基转移酶和甘露糖甘油酸合成酶进行多酶催化反应，生成甘露糖甘油酸。在本发明中，甘露糖为底物，甘露糖经甘露糖激酶催化转化为甘露糖-1-磷酸，甘露糖-1-磷酸和鸟苷三磷酸(GTP)经甘露糖1-磷酸糖基转移酶催化鸟苷二磷酸-甘露糖(GDP-甘露糖)，GDP-甘露糖和甘油酸经甘露糖甘油酸合成酶催化合成甘露糖甘油酸。

优选地，甘露糖原料可以是甘露糖纯品也可以是采用酸解或者酶转化方法转化魔芋、淀粉、纤维素、蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、甘露醇等原料获得的甘露糖。

优选地，多酶催化反应中甘露糖和甘油酸的浓度为1-200g/L，进一步优选为5-50g/L，更优选为8-20g/L，最优选甘露糖为20g/L，甘油酸为10g/L。

优选地，多酶催化反应的反应温度为10-95℃，进一步优选为20-80℃，更优选为30-60℃，最优选为37℃。

优选地，多酶催化反应的反应时间为0.5-150小时，进一步优选为1-60小时，更优选为6-48小时，最优选为30小时。

优选地，多酶催化反应中还加入缓冲液、磷酸盐、金属离子。

优选地，甘露糖激酶来源于长双歧杆菌(SEQ ID NO:1)，或其氨基酸序列与上述来源的甘露糖激酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；甘露糖1-磷酸糖基转移酶来源于火球菌(SEQ ID NO:2，或其氨基酸序列与上述来源的甘露糖1-磷酸糖基转移酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；甘露糖甘油酸合成酶来源于海洋红嗜热盐菌(SEQ ID NO:3)，或其氨基酸序列与上述来源的甘露糖甘油酸合成酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。

本发明目的二是提供发酵生产甘露糖甘油酸的微生物重组菌株的构建方法。

所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：

1)向微生物重组菌株中引入由甘露糖激酶、甘露糖1-磷酸糖基转移酶和甘露糖甘油酸合成酶组成的甘露糖甘油酸合成途径。

2)增强微生物体内的甘露糖6-磷酸变位酶，促使胞内甘露糖6-磷酸转化为前体甘露糖1-磷酸。

所述微生物重组菌株的构建方法适用于多种微生物模式菌株，包括，大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等微生物。

本发明的目的三是提供用于发酵生产甘露糖甘油酸的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法。

所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：

1)在谷氨酸棒杆菌中引入来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK(SEQ ID NO:1)、来源于火球菌的甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG(SEQ ID NO:2)、来源于海洋红嗜热盐菌的甘露糖甘油酸合成酶MGS(SEQ ID NO:3)得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MG1；

2)向重组谷氨酸棒杆菌MG1中引入来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶ManB(SEQ ID NO:4)，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为MG2；

所述步骤1)中重组谷氨酸棒杆菌MOS1的具体方法包括以下步骤：

委托江苏金唯智生物技术有限公司合成来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK基因(SEQ ID NO:5),来源于火球菌的甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG基因(SEQ ID NO:6)和来源于海洋红嗜热盐菌的甘露糖甘油酸合成酶MGS基因(SEQ ID NO:7)，并要求其提供含有甘露糖激酶基因的载体pUC57-MK，含有甘露糖1-磷酸糖基转移酶基因的载体pUC57-MPG，含有甘露糖甘油酸合成酶基因的载体pUC57-MGS；以质粒pUC57-MK为模板PCR扩增甘露糖激酶MK基因，以质粒pUC57-MPG为模板PCR扩增甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG基因，以质粒pUC57-MGS为模板扩增甘露糖甘油酸合成酶MGS基因，将上述片段连接至载体pEC-XK99E中，得到重组载体，命名为pE-MK-MPG-MGS；通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MPG-MGS，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MG1。

所述步骤2)中重组谷氨酸棒杆菌MG2的具体方法包括以下步骤：

PCR扩增来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶基因(SEQ ID NO:8)，连接入载体pE-MK-MPG-MGS中，得到携带甘露糖激酶MK基因、甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG基因、甘露糖甘油酸合成酶MGS基因、甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因的重组载体，命名为pE-MK-MPG-MGS-ManB，通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MPG-MGS-ManB，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MG2。

本发明目的四是提供一种发酵法生产甘露糖甘油酸的方法，其特征在于,培养本发明目的之五所述构建方法得到的谷氨酸棒状杆菌重组菌株MG1和MG2,以甘露糖和甘油酸为底物,发酵生产甘露糖甘油酸。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体浓度(OD₆₀₀)为0.5-50；温度30-37℃；甘露糖为20-100g/L，甘油酸浓度为10-100g/L。

本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株可应用于甘露糖甘油酸的合成领域中，所获得的甘露糖甘油酸将在食品和医药行业具有广泛的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为甘露糖甘油酸的合成技术路线。

图2为谷氨酸棒杆菌重组菌株合成甘露糖甘油酸的高效液相色谱分析结果。

具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1体外多酶催化将甘露糖转化为甘露糖甘油酸

通过体外多酶催化体系将甘露糖转化为甘露糖甘油酸的催化途径见图1。其中涉及的关键酶与关键步骤包括：(1)甘露糖激酶，用于催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸；(2)甘露糖1-磷酸糖基转移酶，用于催化甘露糖-1-磷酸和鸟苷三磷酸(GTP)生成GDP-甘露糖和焦磷酸；(3)甘露糖甘油酸合成酶，用于催化GDP-甘露糖和甘油酸合成甘露糖甘油酸。

在本实施例中，甘露糖激酶来源于长双歧杆菌，氨基酸序列在UniProt上的编号为B7GN78(SEQ ID NO:1)；甘露糖1-磷酸糖基转移酶来源于火球菌，氨基酸序列在UniProt上的编号为O58649(SEQ ID NO:2)；甘露糖甘油酸合成酶来源于海洋红嗜热盐菌，氨基酸序列在UniProt上的编号为D0MI02(SEQ ID NO:3)。

委托江苏金唯智生物技术有限公司合成来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK基因(SEQ ID NO:5),来源于火球菌的甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG基因(SEQ ID NO:6)和来源于海洋红嗜热盐菌的甘露糖甘油酸合成酶MGS基因(SEQ ID NO:7)，并要求其提供含有甘露糖激酶基因的载体pUC57-MK，含有甘露糖1-磷酸糖基转移酶基因的载体pUC57-MPG，含有甘露糖甘油酸合成酶基因的载体pUC57-MGS。以合成的甘露糖激酶基因序列、甘露糖1-磷酸糖基转移酶基因序列和甘露糖甘油酸合成酶基因序列设计引物，分别以质粒pUC57-MK、pUC57-MPG和pUC57-MGS为模板，PCR扩增获得MK基因、MPG基因和MGS基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pET21中，得到重组质粒pET21-MK、pET21-MPG和pET21-MGS中。将这两个质粒分别转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，进行蛋白质表达与纯化。

随后反应体系中含有25mM PBS缓冲液(pH 7.5)，5mM的二价镁离子，2U/mL甘露糖激酶，2U/mL甘露糖1-磷酸糖基转移酶，2U/mL甘露糖甘油酸合成酶，20g/L甘露糖，5g/L甘油酸，50mM ATP,20mM GTP在37℃进行催化反应，反应时间为30个小时。

高效液相色谱检测甘露糖甘油酸的浓度，经标准曲线斜率计算，反应体系合成5.6g/L甘露糖甘油酸，相对于甘油酸转化率为98％。

实施例2、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株MG1和MG2

1、谷氨酸棒杆菌重组菌株MG1的构建，包括以下步骤：

1.1、在谷氨酸棒杆菌中引入来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK(SEQ ID NO:1)、来源于火球菌的甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG(SEQ ID NO:2)、来源于海洋红嗜热盐菌的甘露糖甘油酸合成酶MGS(SEQ ID NO:3)，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MOS1。

具体构建过程如下：

分别以质粒pUC57-MK、pUC57-MPG和pUC57-MGS为模板，PCR扩增获得MK基因、MPG基因和MGS基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pEC-XK99E中，得到重组质粒pE-MK-MPG-MGS。

1.2、通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株中导入重组载体pE-MK-MPG-MGS，得到携带有甘露糖激酶MK基因、甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG基因、甘露糖甘油酸合成酶MGS基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MG1。

2、谷氨酸棒杆菌重组菌株MG2的构建,包括以下步骤：

2.1、根据Genbank中大肠埃希氏菌MG1655的甘露糖6-磷酸变位酶基因(SEQ IDNO:8)，设计引物，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，PCR扩增来甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因，采用酶切连接方法连接入载体pE-MK-MPG-MGS中，得到重组载体pE-MK-MPG-MGS-ManB。

2.2、采用电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株中导入重组载体pE-MK-MPG-MGS-ManB，得到携带有携带甘露糖激酶MK基因、甘露糖1-磷酸糖基转移酶MPG基因、甘露糖甘油酸合成酶MGS基因、甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MG2。

实施例3、谷氨酸棒杆菌重组菌株MG1和MG2在甘露糖甘油酸合成中的应用

谷氨酸棒杆菌重组菌株在甘露糖甘油酸合成中的应用包括以下步骤：

选用BHI丰富培养基(脑心浸粉37g/L)，培养基中添加甘露糖(20g/L)和甘油酸(10g/L)，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1进行培养，发酵48h后，对样品进行HPLC检测。

结果如图2((a)表示发酵0h；(b)表示发酵48h)所示，可以看出，经过48小时反应，重组菌株MG1可以发酵甘露糖和甘油酸合成甘露糖甘油酸，产量为3.0g/L；与重组菌株MG1相比，重组菌株MG2合成甘露糖甘油酸产量达到5.5g/L，提高80％。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种生物制备甘露糖甘油酸的方法

<130> 2020.5.25

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 359

<212> PRT

<213> 长双歧杆菌()

<400> 1

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1 5 10 15

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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355

<210> 2

<211> 464

<212> PRT

<213> 火球菌()

<400> 2

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1 5 10 15

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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<210> 3

<211> 397

<212> PRT

<213> 海洋红嗜热盐菌()

<400> 3

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<210> 4

<211> 456

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌()

<400> 4

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1 5 10 15

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165 170 175

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290 295 300

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450 455

<210> 5

<211> 1080

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌()

<400> 5

atgaacaaca ccaacgaagc gctgtttgac gtggcgagcc acttcgcgct ggagggtacc 60

gttgacagca tcgaaccgta cggtgatggc cacattaaca ccacctatct ggtgaccacc 120

gacggtccgc gttacatcct gcagcgtatg aacaccggca ttttcccgga taccgttaac 180

ctgatgcgta acgtggaact ggttaccagc accctgaagg cgcagggtaa agagaccctg 240

gacattgtgc gtaccaccag cggtgacacc tgggcggaaa tcgatggtgg cgcgtggcgt 300

gtttataagt ttattgagca caccatgagc tacaacctgg tgccgaaccc ggatgttttc 360

cgtgaagcgg gtcgtgcgtt cggcgacttt cagaacttcc tgagcggttt tgatgcgaac 420

caactgaccg agaccatcgc gcacttccac gacaccccgc accgttttga ggatttcaag 480

aaagcgctgg cggcggatga actgggtcgt gcggcgggtt gcggcccgga gattgaattt 540

tacctgagcc acgcggatca gtatgcggtg gttatggacg gtctgcgtga tggcagcatc 600

ccgctgcgtg tgacccacaa cgacaccaag ctgaacaaca ttctgatgga tgcgaccacc 660

ggtaaagcgc gtgcgatcat tgacctggat accatcatgc cgggcagcat gctgttcgac 720

tttggtgata gcattcgttt tggtgcgagc accgcgctgg aggatgaacg tgacctggat 780

aaggtgcact ttagcaccga gctgttccgt gcgtataccg agggttttgt tggcgaactg 840

cgtgatagca tcaccgcgcg tgaggcggaa ctgctgccgt tcagcggtaa cctgctgacc 900

atggagtgcg gcatgcgttt tctggcggac tacctggaag gtgatgttta cttcgcgacc 960

aagtatccgg agcacaacct ggtgcgtagc cgtacccaga tcaaactggt tcgtgagatg 1020

gaacaacgtg cggacgagac ccgtgcgatt gtggcggatg ttatggaaac caccaaataa 1080

<210> 6

<211> 1395

<212> DNA

<213> 火球菌()

<400> 6

atgaaggctt tgattctagc tgggggaaag ggaacgaggc tctggcccct aagcagggaa 60

gcgatgccta agcaattcat taaggttttc tctgacaggt ctttatttca aaaaactgtt 120

gaaagggctt taatattttc aaaacccaag gaaatattcg tagttacaaa caaggaatat 180

agatttagag tcctggatga tttaaatgag ctggggctta aagtcccaga agagaatatt 240

ttgctcgagc cggtaggtaa gaatacgtta ccggcaatat actgggggct taaggttata 300

aacgataact acggggattc cgtggttgcg gttctaccca gcgatcatgc aattgaagtc 360

aacgagagtt atatggaagc tttcaagaag gccgaaaagc ttgctgagaa gtatttagta 420

acgtttggga taaagcccac gaaaccccat acggggtatg gatatataaa acctggggag 480

aaaattgaag tagaggggaa agttcttggc tatcttgttg acgagttcaa ggaaaaacct 540

gacttagaaa ccgctaggaa gtacgttgaa aacggctatt actggaatag tggaatgttc 600

atgttcaaag tttccgtctt catggaggag gccagaaagc attccccgga tgtagtaaaa 660

gcttttgagg aaggaaagag catcgaggag atctatgagc tcgccccaga gataagtgtt 720

gattatggga taatggagaa gaccaataaa gcagcggtag tccctttgaa tacatattgg 780

aacgatctag gtagctttga tgctgtttac gaggccttag aaaaagatga aaacggaaat 840

gcagttcatg ttacaggatt taaagctaag tacataaacg ttgattccag gaataacctg 900

gtactaacgg agaggctaac cgctacagtt ggagttgagg atctcgtgat aattgacact 960

ggagacgccc tcttggttgc aaagagggga gaaactcaga aggttaaaga ggtttacaag 1020

aagctgaagg aggaaaacga cgagagggca atagtccata gaacagcgta taggccctgg 1080

gggagctaca ccgttttaga ggagggtgaa aggtacaaga taaagaggtt aacagtcctt 1140

cccggaaaaa ggttgagctt acagatccat tatcacagga gcgagcactg ggttgttgtt 1200

aggggaactg ctaaggtaaa agttggggac aaggagttca tcctaaggcc aggagaaagc 1260

accttcatac cagccggagt tcctcacaga ctcgaaaacc caggaaaagt gattctcgaa 1320

gttatagaaa cccaaatagg cgaatacctt ggagaagacg acatagtaag gcttcaagac 1380

gattacggga ggtga 1395

<210> 7

<211> 1194

<212> DNA

<213> 海洋红嗜热盐菌()

<400> 7

atgtctctgg ttgttttccc gttcaaacac gaacacccgg aagttctgct gcacaacgtt 60

cgtgttgctg ctgctcaccc gcgtgttcac gaagttctgt gcatcggtta cgaacgtgac 120

cagacctacg aagctgttga acgtgctgct ccggaaatct ctcgtgctac cggtaccccg 180

gtttctgttc gtctgcagga acgtctgggt accctgcgtc cgggtaaagg tgacggtatg 240

aacaccgctc tgcgttactt cctggaagaa acccagtggg aacgtatcca cttctacgac 300

gctgacatca cctctttcgg tccggactgg atcaccaaag ctgaagaagc tgctgacttc 360

ggttacggtc tggttcgtca ctacttcccg cgtgcttcta ccgacgctat gatcacctgg 420

atgatcaccc gtaccggttt cgctctgctg tggccgcaca ccgaactgtc ttggatcgaa 480

cagccgctgg gtggtgaact gctgatgcgt cgtgaagttg ctgctatgct gtacgaagac 540

gaacgtgttc gtcgtcgttc tgactggggt atcgacaccc tgtacacctt cgttaccgtt 600

cagcagggtg tttctatcta cgaatgctac atcccggaag gtaaagctca ccgtctgtac 660

ggtggtctgg acgacctgcg taccatgctg gttgaatgct tcgctgctat ccagtctctg 720

cagcacgaag ttgttggtca gccggctatc caccgtcagg aacacccgca ccgtgttccg 780

gttcacatcg ctgaacgtgt tggttacgac gttgaagcta ccctgcaccg tctgatgcag 840

cactggaccc cgcgtcaggt tgaactgctg gaactgttca ccaccccggt tcgtgaaggt 900

ctgcgtacct gccagcgtcg tccggctttc aacttcatgg acgaaatggc ttgggctgct 960

acctaccacg ttctgctgga acacttccag ccgggtgacc cggactggga agaactgctg 1020

ttcaaactgt ggaccacccg tgttctgaac tacaccatga ccgttgctct gcgtggttac 1080

gactacgctc agcagtacct gtaccgtatg ctgggtcgtt accgttacca ggctgctctg 1140

gaaaacggtc gtggtcaccc ggttccgccg cgtgctgctc tgtctaccgc ttaa 1194

<210> 8

<211> 1371

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌()

<400> 8

atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgcg ggaaattagg cgaagaactg 60

aatgaagata tcgcctggcg cattggtcgc gcctatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120

attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180

ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240

tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300

ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360

accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420

accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480

ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540

gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600

gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660

ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720

ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780

attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840

gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900

ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960

gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020

tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080

acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140

agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200

gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260

ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320

ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371