阅读说明：本技术 一种生产去甲四环素的方法 (Method for producing nortetracycline ) 是由 王雪峰 韩冰 闫彩洁 郑万静 王绘砖 徐珍 袁昉 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种生产去甲四环素的方法,将去甲金霉素生产菌株接种斜面培养基,25-30℃,20％-60％湿度条件下培养10-15天；成熟后接种至种瓶培养基,25-30℃,20％-60％湿度条件下220rpm震荡培养36-50h；种液成熟后,按照5％-10％接种量接种到发酵培养基中,相同条件下震荡培养5-8天,发酵结束,得到去甲四环素发酵液；本发明提高了去甲四环素的发酵单位,达到了工业化生产水平,对米诺环素、替加环素等高附加值产品生产过程中简化合成步骤,减少危险因素,降低生产成本具有重要的意义和应用价值。(The invention belongs to the technical field of microbial fermentation, and particularly relates to a method for producing nortetracycline, which comprises the steps of inoculating a noraureomycin production strain into a slant culture medium, and culturing for 10-15 days at 25-30 ℃ under the condition of 20-60% humidity; inoculating to a seed bottle culture medium after maturation, and performing shake culture at 220rpm under the conditions of 25-30 ℃ and 20-60% humidity for 36-50 h; after the liquid is mature, inoculating the liquid into a fermentation medium according to the inoculation amount of 5% -10%, performing shake culture for 5-8 days under the same condition, and finishing fermentation to obtain a nortetracycline fermentation liquid; the invention improves the fermentation unit of the nortetracycline, achieves the industrial production level, and has important significance and application value for simplifying the synthesis steps, reducing the risk factors and reducing the production cost in the production process of high value-added products such as minocycline, tigecycline and the like.)

一种生产去甲四环素的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产去甲四环素的方法。

背景技术

四环素类抗生素(Tetracyclines)是一类具有并四苯(Naphthacene)核心结构的广谱抗生素(图1)，包括土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、四环素(TC)、去甲金霉素(DMCTC)、去甲四环素(DMTC)、强力霉素、米诺环素、替加环素等(Nguyen F,StarostaAL,Arenz S,SohmenD,DonhoferA,Wilson DN(2014)Tetracycline antibiotics and resistancemechanisms.Biological chemistry 395(5):559-75)。在这些抗生素中，OTC、CTC、TC、DMCTC和DMTC是天然产物，OTC由Streptomyces rimosus产生，CTC、TC、DMCTC和DMTC由Streptomyces aureofaciens或其突变体产生。

随着耐药菌株的出现和人们对广谱抗生素的迫切需求，研究者在这些天然产物的基础上，通过化学修饰，开发合成了强力霉素、米诺环素、替加环素等更加高效的四环类抗生素，如：以土霉素为原料可以合成强力霉素，以去甲金霉素为原料可以合成米诺环素、替加环素等。值得指出的是，2018年有3款四环素类抗生素获得FDA批准：Eravacycline、Sarecycline和Omadacycline。因此，提高生物合成类产品的产能具有重要意义。

在实际生产中，以去甲金霉素为原料合成去甲四环素(图2)，然后以去甲四环素为原料合成米诺环素，米诺环素可以进一步合成价值更高的替加环素。去甲金霉素为原料合成去甲四环素的过程需要经过金属钯(Pd)催化的高压氢化脱氯反应，此反应危险并且成本高，所以，如果能够通过发酵法生产去甲四环素，可以简化米诺环素、替加环素等合成的步骤，减少危险因素，降低生产成本。

在目前的研究中，通过发酵法合成OTC、CTC、TC、DMCTC的研究很多，并且均已工业化生产，而去甲四环素(DMTC)的研究报道很少。CN201910693880.8通过敲除金霉素生产菌株S.aureofaciens CGMCC4.1043中编码甲基转移酶的ctcK基因，获得产去甲四环素的工程菌株DMT1，并在此基础上通过表达合成簇内激活基因ctcB、抗性基因ctcR、合成基因ctcQ等策略，进一步提高了去甲四环素的产量；CN201911007748.3通过调整发酵罐培养基组成、调整补料配方，配合发酵过程工艺控制，得到了一种使用金色链霉菌发酵生产去甲四环素的方法。

在去甲金霉素发酵过程中，去甲四环素是其中杂质之一，产量很低。去甲四环素与去甲金霉素的结构差别是7位缺少氯原子，所以推测合成过程是先合成去甲四环素，然后7位卤化加氯，合成去甲金霉素。在去甲金霉素发酵过程中，如果能够通过改变工艺条件，使发酵主产物由去甲金霉素转为去甲四环素，用于去甲四环素的生产，则具有重要的应用价值。

鉴于此，本发明开发了一种通过去甲金霉素生产菌株S.aureofaciens(金色链霉菌)生产去甲四环素的方法及培养基。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种生产去甲四环素的方法，采用去甲金霉素生产菌株金色链霉菌，通过改变培养基和发酵条件，用于生产去甲四环素。

本发明采用的具体技术方案为：(1)斜面培养：将去甲金霉素生产菌株接种斜面培养基，25-30℃，20％-60％湿度条件下培养10-15天；

(2)种瓶培养：斜面培养成熟后接种至种瓶培养基，25-30℃，20％-60％湿度条件下220rpm震荡培养36-50h；

(3)发酵培养：种液成熟后，按照5％-10％接种量接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养5-8天，发酵结束，得到去甲四环素发酵液。

优选地，所述的斜面培养基的成分及其含量为：面粉1-2％，蛋白胨0.05-0.15％，磷酸二氢钾0.01-0.1％，硫酸镁0-0.005％，琼脂2.0-2.5％。

优选地，所述的种瓶培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0-3.0％，淀粉1.0-3.0％，高温豆粉1.0-3.0％，碳酸钙0.5-1.5％，酵母粉0.1-0.5％，蛋白胨0.5-3.0％，硫酸铵0.1-0.5％，溴化钠0-0.5％，磷酸二氢钾0.01-0.05％，玉米浆0-0.5％，豆油(V/V)0.5-2％，pH自然。

优选地，所述的发酵培养基的成分及其含量为：淀粉6-10％，糊精2-4％，高温豆粉2-4％，大豆蛋白粉0.5-3％，碳酸钙0.5-1.5％，蛋白胨1.0-3.0％，硫酸铵0.1-0.5％，L-赖氨酸0.5-1.5％，溴化钠0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.005-0.05％，玉米浆0.3-1.5％，豆油(V/V)0.5-3％，消沫剂0.01-0.05％，α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05-0.1％，2-巯基苯并噻唑0.001-0.002％。用硫酸或硝酸调节pH至5.2-5.5。

优选地，所述的发酵培养基的成分及其含量为：淀粉9％，糊精2％，高温豆粉3％，大豆蛋白粉1％，碳酸钙1％，蛋白胨1％，硫酸铵0.1％，L-赖氨酸0.8％，溴化钠0.3％，磷酸二氢钾0.005％，玉米浆0.3％，豆油(V/V)1％，消沫剂0.01％，α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05％，2-巯基苯并噻唑0.0015％。用硫酸调节pH至5.2-5.5。

优选地，所述的发酵培养基的成分及其含量为：淀粉10％，糊精2％，高温豆粉3.5％，大豆蛋白粉2％，碳酸钙1％，蛋白胨1％，硫酸铵0.1％，L-赖氨酸1.0％，溴化钠0.3％，磷酸二氢钾0.005％，玉米浆0.3％，豆油(V/V)2％，消沫剂0.01％，α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05％，2-巯基苯并噻唑0.0015％。用硫酸调节pH至5.2-5.5。

本发明的有益效果是：通过改变培养基和发酵条件，能够使用去甲金霉素生产菌株金色链霉菌生产去甲四环素，并且，通过工艺优化显著提高了去甲四环素的发酵单位，达到了工业化生产水平。使用去甲四环素为原料合成米诺环素、替加环素等，可以简化合成的步骤，减少危险因素，降低生产成本，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为四环素类抗生素结构式；

图2为去甲四环素结构式。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1

以去甲金霉素生产菌株金色链霉菌S.aureofaciens DC087为实验菌株，首先进行去甲金霉素生产工艺对照实验，采用培养基为：

斜面培养基的成分及其含量为：麸皮3.0％，磷酸氢二钾0.01％，磷酸氢二胺0.015％，硫酸镁0.005％，琼脂2.5％。

种瓶培养基的成分及其含量为：淀粉3.0％，高温豆粉3.0％，碳酸钙1.0％，酵母粉0.2％，蛋白胨0.5％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.15％，豆油(V/V)1％，pH自然。

发酵培养基的成分及其含量为：淀粉8％，高温豆粉3％，碳酸钙1％，硫酸铵0.2％，L-赖氨酸盐酸盐0.8％，氯化钠0.3％，玉米浆0.3％，豆油(V/V)1％，消沫剂0.01-0.05％，α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05％，pH自然。

取S.aureofaciens DC087砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养14-15天；斜面成熟接种至种瓶培养基，28℃，20％-60％湿度条件下220rpm震荡培养48h；种液成熟后，按照10％接种量接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养7天至发酵结束。将发酵液用盐酸酸化并不断搅拌，至pH为1.5-2.0，然后用甲醇稀释至适当倍数，振荡后离心，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，滤液进行液相色谱检测。色谱条件为：

色谱柱：ZORBAXSB C18 4.6*250mm 5.0μm；

流动相：

流动相A：草酸20mM、三乙胺20mM、pH≈1.2，流动相B：乙腈，流动相A：流动相B＝8：2；

进样量：20μL；

流速：1.0mL/min；

波长：350nm；

柱温：25℃；

实验结果如下：

实施例2

由实施例1看出，金色链霉菌S.aureofaciens DC087的发酵液主要成分是去甲金霉素，去甲四环素仅是其杂质之一，产量很低。去甲四环素与去甲金霉素的结构差别是7位缺少了氯原子，所以推测合成过程是先合成去甲四环素，然后7位加氯，合成去甲金霉素。所以，如果去除培养基中的氯离子，或合成过程中抑制加氯的反应，可能使去甲金霉素合成受阻，从而积累去甲四环素。为此，本发明优化了培养基组成和工艺条件。

以金色链霉菌S.aureofaciens DC087为实验菌株，改变工艺条件进行去甲四环素生产，采用培养基为：

斜面培养基的成分及其含量为：面粉1.5％，蛋白胨0.05％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0-0.002％，琼脂2.5％。

种瓶培养基的成分及其含量为：葡萄糖1.0％，淀粉2.0％，高温豆粉3.0％，碳酸钙1.0％，酵母粉0.2％，蛋白胨0.5％，硫酸铵0.2％，磷酸二氢钾0.15％，豆油(V/V)1％，pH自然。

发酵培养基的成分及其含量为：淀粉8％，高温豆粉3％，碳酸钙1％，硫酸铵0.2％，L-赖氨酸0.8％，溴化钠0.3％，玉米浆0.5％，豆油(V/V)1％，消沫剂0.01％，α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05％，2-巯基苯并噻唑0.001％。用硫酸调节pH至5.2-5.5。

取S.aureofaciens DC087砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养14-15天；斜面成熟接种至种瓶培养基，28℃，20％-60％湿度条件下220rpm震荡培养48h；种液成熟后，按照10％接种量接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养7天至发酵结束，将发酵液用盐酸酸化并不断搅拌，至pH为1.5-2.0，然后用甲醇稀释至适当倍数，振荡后离心，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，滤液进行液相色谱检测；色谱条件同实施例1。实验结果如下：

实施例3

以金色链霉菌S.aureofaciens DC087为实验菌株，改变工艺条件进行去甲四环素生产，采用培养基为：

斜面培养基的成分及其含量为：同实施例2。

种瓶培养基的成分及其含量为：同实施例2。

发酵培养基的成分及其含量为：淀粉9％，糊精2％，高温豆粉3％，大豆蛋白粉1％，碳酸钙1％，蛋白胨1％，硫酸铵0.1％，L-赖氨酸0.8％，溴化钠0.3％，磷酸二氢钾0.005％，玉米浆0.3％，豆油(V/V)1％，消沫剂0.01％，α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05％，2-巯基苯并噻唑0.0015％。用硫酸调节pH至5.2-5.5。取S.aureofaciens DC087砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养14-15天；斜面成熟接种至种瓶培养基，28℃，20％-60％湿度条件下220rpm震荡培养48h；种液成熟后，按照5％接种量接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养7天至发酵结束；将发酵液用盐酸酸化并不断搅拌，至pH为1.5-2.0，然后用甲醇稀释至适当倍数，振荡后离心，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，滤液进行液相色谱检测。色谱条件同实施例1。实验结果如下：

实施例4

以金色链霉菌S.aureofaciens DC087为实验菌株，改变工艺条件进行去甲四环素生产，采用培养基为：

斜面培养基的成分及其含量为：同实施例2。

种瓶培养基的成分及其含量为：同实施例2。

发酵培养基的成分及其含量为：淀粉10％，糊精2％，高温豆粉3.5％，大豆蛋白粉2％，碳酸钙1％，蛋白胨1％，硫酸铵0.1％，L-赖氨酸1.0％，溴化钠0.3％，磷酸二氢钾0.005％，玉米浆0.3％，豆油(V/V)2％，消沫剂0.01％，α-淀粉酶(淀粉用量的W/W)0.05％，2-巯基苯并噻唑0.0015％。用硫酸调节pH至5.2-5.5。

取S.aureofaciens DC087砂土管，无菌条件下接种于试管斜面，28℃，20％-60％湿度条件下培养14-15天；斜面成熟接种至种瓶培养基，28℃，20％-60％湿度条件下220rpm震荡培养48h；种液成熟后，按照5％接种量接种到发酵培养基中，相同条件下震荡培养7天至发酵结束；将发酵液用盐酸酸化并不断搅拌，至pH为1.5-2.0，然后用甲醇稀释至适当倍数，振荡后离心，取上清液，用0.22μm滤膜过滤，滤液进行液相色谱检测。色谱条件同实施例1。实验结果如下：

由上述实施例可以看出，通过改变培养基和发酵条件，使去甲金霉素生产菌株S.aureofaciens的发酵主成分由去甲金霉素转为了去甲四环素，并且通过培养基优化，大大提高了去甲四环素的发酵单位，达到了工业化生产水平。